實(shí)驗(yàn)十五 血清ALT測定(賴氏法)

1、實(shí)驗(yàn)十五血清ALT測定(賴氏法)目的】了解血清ALT活性測定的原理及測定方法。掌握血清ALT活性測定的臨床意義?！驹怼勘彼崤ca-酮戊二酸在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反應(yīng)到達(dá)規(guī)定時間時，加入2，4-二硝基苯肼-鹽酸溶液以終止反應(yīng)。生成的丙酮酸與2，色的深淺，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。后者在堿性條件下顯棕紅色。根據(jù)顏NaOH2，4-二硝基苯肼丙酮酸丙酮酸-2，4-二硝基苯腙(紅棕色)COOH1COOHch33CO1CH。CHNHALT31HC-NH。+ch2CA+CH22-COCOOHCH2COOHCoohCH2Cooh丙氨酸a-酮戊二酸丙

2、酮酸谷氨酸求得血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活力。反應(yīng)式如下：2器材】試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、分光光度計。耗材：血清，座標(biāo)紙等。試劑】O.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稱取磷酸氫二鈉(NaHPO,AR)11.928g，磷酸二氫鉀(KHPO,AR)2.176g，加少量蒸餾2424水溶解并稀釋至1000ml。ALT底物液稱取a-酮戊二酸29.2mg,DL丙氨酸1.79g于燒瓶中，加O.lmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液80ml,煮沸溶解后冷卻，用lmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4（約加入0.5ml）,再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液在容量瓶內(nèi)加至100ml,混勻，加氯仿數(shù)滴，置冰箱可保存數(shù)

3、周。丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（2umol/ml）精確稱取丙酮酸鈉（AR）22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液至刻度。2，4-二硝基苯肼溶液稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L鹽酸10ml溶解后，加蒸餾水至100ml,置棕色瓶內(nèi)，冰箱保存。0.4mol/LNaOH溶液稱取16gNaOH溶于適量蒸餾水中，然后稀釋至1000ml?！静僮鳌咳?支試管按下表操作：表3-16血清ALT測定（賴氏法）操作步驟加入物（ml）測定管對照管血清0.10.1ALT底物液0.5混勻，置37C水浴，保溫30分鐘2，4二硝基苯肼0.50.5ALT底物液0.5混勻，置37C水浴，保

4、溫20分鐘0.4mol/LNaOH5.05.0混勻，靜置10分鐘，用505nm波長比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，用測定管吸光度值減去對照管吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得ALT活力單位。【標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制】見下表：表3-17血清ALT測定（賴氏法）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作步驟加入物（ml）管號012345丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（2umol/ml）00.050.100.150.200.25ALT底物液0.050.450.400.350.300.250.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1混勻，置37oC水浴，保溫30分鐘2，4二硝基苯肼0.050.050.050.050.050.05混勻

5、，置37oC水浴，保溫20分鐘0.4mol/LNaOH5.05.05.05.05.05.0相當(dāng)于ALT單位0285797150200混勻，靜置10分鐘，用505nm波長比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，將各管吸光度值減去“0”號管吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的酶活性單位為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。【正常參考范圍】525卡門氏單位賴氏法的酶活力單位是根據(jù)本法中丙酮酸量及其吸光度值與卡門氏單位的對等關(guān)系，套用卡門氏單位而來?？ㄩT氏單位的定義是：血清lml,反應(yīng)液總量3ml，反應(yīng)溫度25C，波長340nm，比色杯光徑1cm,每分鐘吸光度減少0.001為一個卡門氏單位。【臨床意義】ALT主要存在各組織細(xì)胞中，以肝細(xì)胞中含量最多，正常情況下只有極少量釋放入血，血清中ALT活性很低。當(dāng)肝細(xì)胞病變、壞死或肝細(xì)胞膜通透性增加時，ALT可大量釋放入血，使血中該酶的活性顯著升高，故此酶是判斷肝細(xì)胞損傷的一個常用的指標(biāo)。急性肝炎、藥物中毒性肝細(xì)胞壞死時，血清ALT活性明顯升高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死時，血清ALT活性中度升高；阻塞性黃疸、膽管炎時，血清ALT活性輕度升高