說明中期報(bào)告

1、多酚類化合物對(duì)牙釉質(zhì)脫礦的抑制作用Polyphenolic compounds on inhibition of enamel demineralization 指導(dǎo)老師：關(guān)曉旭 小組成員：俞媛媛 王姍姍 林夢(mèng)娜 黃佳夢(mèng) 金玲玲 文獻(xiàn)檢閱購(gòu)買并配置保存液各地醫(yī)院搜集離體牙完成綜素，明確實(shí)驗(yàn)方案制定實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行開題答辯進(jìn)一步探討具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，明確任務(wù)分工列出實(shí)驗(yàn)耗材清單購(gòu)買實(shí)驗(yàn)試劑聯(lián)系口腔實(shí)驗(yàn)室，了解具體情況分工合作，收集離體牙預(yù)實(shí)驗(yàn)開展并完成熟悉實(shí)驗(yàn)過程，討論實(shí)驗(yàn)問題整理思路，修改完善實(shí)驗(yàn)方案離體牙匯總進(jìn)行中期匯報(bào)展示制定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及人員分配實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備離體牙地點(diǎn)：浙江省口腔醫(yī)院浙江省口腔醫(yī)院（城

2、西分院）浙江省第一醫(yī)院成果：預(yù)計(jì)需要47顆人離體前磨牙累計(jì)收集牙齒71顆可用牙齒50顆原來用于收集的一次性離心管底部呈圓錐形，不便于放置收牙存在競(jìng)爭(zhēng)，易被他人取走省口和浙一距離紫金港較遠(yuǎn)，每周收集較不方便牙齒儲(chǔ)存液網(wǎng)上購(gòu)買并查詢文獻(xiàn)采用適宜濃度進(jìn)行配置請(qǐng)老師和學(xué)姐代為收集定期去醫(yī)院回收牙齒自行準(zhǔn)備數(shù)量適宜的廣口平底瓶進(jìn)行收集1. 厚樸酚：購(gòu)于上海金穗生物科技有限公司，70元/20mg2. 沒食子酸：購(gòu)于上海華藍(lán)技術(shù)有限公司，20元/25g3. 茶多酚4. NaF（1g/L）5. 鹽酸溶液（1%）6. 冰乙酸（50mmol/l）7. 磷酸二氫鉀（1.5mmol/l）8. HEPES（20mmol

3、/l）9. DDW10. 人工唾液11. KCl緩沖液12. 麝香草酚實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑 沒食子酸：1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml 厚樸酚溶液：3.9ug/ml、7.8ug/ml、15.7ug/ml、31.3ug/ml、62.5ug/ml 茶多酚溶液：1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml 人工唾液:NaCl 0.4g、KCl 0.4g、CaCl22H2O 0.795g、NaH2PO42H2O 0.78g、Na2S5H2O 0.005g,尿素 1.0g、加蒸餾水至1L、用NaOH、HCl酸性緩沖液：冰乙酸（50mmol/l），磷

4、酸二氫鉀（1.5mmol/l） 中性緩沖液：HEPES（20mmol/l），磷酸二氫鉀（1.5mmol/l）鈣標(biāo)準(zhǔn)液（1）鈣標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000mgmL-1） （2）鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液（50mgmL-1） （3）鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液系列: 1.0、2.0、5.0、10.0 、20.0 、50.0 mg/mL。鈣標(biāo)準(zhǔn)液的濃度范圍需再確定實(shí)驗(yàn)室自行配制的該標(biāo)準(zhǔn)液不夠精確0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0mg/ml;現(xiàn)配現(xiàn)用試劑避光保存調(diào)節(jié)ph調(diào)PH到6.8調(diào)PH到5調(diào)PH到7麝香草酚實(shí)驗(yàn)儀器用途來源硬組織切割機(jī)3x3x2 mm釉質(zhì)塊口腔實(shí)驗(yàn)室超聲潔凈器清潔牙釉質(zhì)-20冰箱保存離體牙及試劑碳化硅砂紙（

5、800、1200、2400）拋光37恒溫儀脫礦病變?cè)游舛确止夤舛葍x鈣濃度教C220金老師， 顯微硬度儀前后釉質(zhì)硬度口腔實(shí)驗(yàn)室張凱（羅巧潔學(xué)姐）掃描電鏡SEM釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)生命科學(xué)樓陳老師，88206593實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備儀器電子顯微鏡測(cè)試鈣離子濃度測(cè)試硬度測(cè)試預(yù)實(shí)驗(yàn)流程牙體處理切割、拋光硬度測(cè)試PH循環(huán)預(yù)實(shí)驗(yàn)牙體處理預(yù)實(shí)驗(yàn)牙體處理 牙 體 形 態(tài) 可 操 作 度 對(duì) 比 性牛牙vs人牙切牙vs前磨牙顯微硬度計(jì)HV-1000預(yù)實(shí)驗(yàn)硬度測(cè)試預(yù)實(shí)驗(yàn)PH循環(huán)試劑/儀器酸性緩沖液中性緩沖液茶多酚溶液 1、2、4 8、16mg/ml五倍子多酚溶液 1、2、4、 8、16mg/ml厚樸酚溶液 3.9、7.8、 1

6、5.7、31.3、 62.5ug/ml EP管 鑷子 滴管 計(jì)時(shí)器人工唾液浸泡過夜實(shí)驗(yàn)溶液處理酸性緩沖液處理中性緩沖液處理12次注意：1.中性緩沖液配置需要的hepas需要提前跟學(xué)長(zhǎng)預(yù)約使用2.實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，需要提前借好門卡3.操作量大4.提早做好標(biāo)記，滴管勿混淆，6.換溶液時(shí)，釉質(zhì)塊掉落。原子吸收光譜儀MKIIM6原子吸收光譜儀可測(cè)定多種元素，火焰原子吸收光譜法可測(cè)到10-9g/mL數(shù)量級(jí)。預(yù)實(shí)驗(yàn)原子分光光度法測(cè)定鈣離子濃度1.試劑: 無水碳酸鈣、1mol/L鹽酸溶液、蒸餾水、鑭溶液2.配制溶液：（1）鈣標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000g/mL） （2）鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液（50g/mL）3.實(shí)驗(yàn)條件：在電腦程序

7、中根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況設(shè)置相關(guān)參數(shù)，并打開相應(yīng)氣閥。4.實(shí)驗(yàn)步驟：（1）鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：利用鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液配置1 g/mL 、2.0g/mL、5.0g/mL、10.0 g/mL、20.0 g/mL、50.0 g/mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.樣品準(zhǔn)備：取一定量的樣品溶液并按照比例加入鑭溶液。6.分光光度儀測(cè)試：測(cè)定空白溶液，再依此測(cè)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品溶液。7.制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和結(jié)果計(jì)算：利用電腦軟件自動(dòng)生成存在問題：1.實(shí)驗(yàn)中使用的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液為自行配置，精確度不穩(wěn)定；2.pH循環(huán)時(shí)酸性緩沖液的量較少，測(cè)定鈣離子濃度時(shí)只夠測(cè)定一次，沒有備份。3.預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中是否加入鑭溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果

8、差距不大，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體情況進(jìn)行操作。4.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可適當(dāng)調(diào)準(zhǔn)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度，以提高準(zhǔn)確性。分組處理釉質(zhì)硬度（前）kg/mm2釉質(zhì)硬度（后）kg/mm2鈣濃度mg/l鈣釋出率CDR（10-3）陰性對(duì)照DDW367.67301.431.065311.10陽性對(duì)照NaF-0.31123.2416mg/ml五倍子16mg/ml五倍子334.07322.750.15841.65Ph循環(huán)后，釉質(zhì)硬度均降低，實(shí)驗(yàn)溶液降低比較小Ph循環(huán)后，鈣離子釋出率陰性對(duì)照陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)溶液。預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)材料1.1 樣本：厚樸酚、茶多酚、沒食子酸（五倍子多酚）處理的牛切牙1.2 儀器：硬組織切割機(jī)、

9、拋光機(jī)、800、1200、2400#碳化硅砂紙、原子吸收分光光度計(jì)、顯微硬度儀、電子顯微鏡1.3 藥品：1 g / L NaF、1%鹽酸溶液、酸性緩沖液：50mmol/l冰乙酸，1.5mmol/l磷酸二氫鉀，pH5.0中性緩沖液：20mmol/lHEPES，1.5mmol/l磷酸二氫鉀，pH7.0、去離子水(DDW)、 抗酸指甲油、0 . 05 mmo l/ L麝香草酚液正式實(shí)驗(yàn)方案2、實(shí)驗(yàn)步驟2.1、脫礦實(shí)驗(yàn)2.1.1 標(biāo)本制備： 取新鮮拔除的牛切牙，去除根部軟組織，冠部超聲洗凈，-20冰箱保存，備用。取備用牙塊，用高速硬組織切割機(jī)將牙冠切成3mmX3mm大小的釉質(zhì)塊，唇面釉質(zhì)用拋光機(jī)及 #

10、碳化硅砂紙?jiān)诹魉录堃来文テ?、拋光，去除表層約150微米，以消除表面有機(jī)污染物和表面的不規(guī)則。2.2.2 獲得性薄膜形成： 將準(zhǔn)備好的釉質(zhì)塊浸泡在離心處理的人全唾液中，每塊2ml，室溫下震蕩過夜。2.2.3 pH循環(huán)：將標(biāo)本固定在pH循環(huán)模型上，進(jìn)行如下循環(huán): 實(shí)驗(yàn)溶液處理5min(2ml/樣本)去離子水沖洗2次，1min/次酸性緩沖液處理1h 去離子水沖洗2次，1min/次 中性緩沖液處理5min 去離子水沖洗2次，1min/次，如此循環(huán)重復(fù)12次，保留酸性緩沖液。3、檢測(cè)指標(biāo)3.1 CDR: 原子吸收光譜測(cè)定酸性緩沖液中的鈣濃度，計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)測(cè)定釉質(zhì)塊脫礦面積，用鈣釋出率(CDR)表示。3.2