企業(yè)管理第七章抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用 暨南大學(xué)抗體工程研究中心

1、第七章 抗原原抗體反反應(yīng)及應(yīng)應(yīng)用不論天然然的還是是人工合合成的分分子，只只要能被被機(jī)體的的免疫系系統(tǒng)識別別的都可可以誘導(dǎo)導(dǎo)機(jī)體的的免疫應(yīng)應(yīng)答，產(chǎn)產(chǎn)生相應(yīng)應(yīng)的抗體體。大多多數(shù)抗體體和抗原原本身是是既有免免疫原性性(誘發(fā)發(fā)產(chǎn)生特特異抗體體)，又又有反應(yīng)應(yīng)原性(與特異異的抗體體相結(jié)合合)?？箍乖c抗抗體的特特異性反反應(yīng)不僅僅可以在在體內(nèi)進(jìn)進(jìn)行，而而且可以以在體外外進(jìn)行。一切利利用血清清學(xué)技術(shù)術(shù)方法所所進(jìn)行的的各種測測試都是是基于這這一根本本的特性性?？贵w體反應(yīng)技技術(shù)的應(yīng)應(yīng)用之廣廣泛已經(jīng)經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超超出了免免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、甚至生生命科學(xué)學(xué)的范圍圍，成為為類微量量，靈敏敏，快速速的檢測測分析方方法。本本章著重

2、重介紹抗抗體制備備，抗體體抗原反反應(yīng)原理理及技術(shù)術(shù)方法的的應(yīng)用。第一節(jié)抗抗體的制制備 環(huán)境中中的大部部分生物物(包括括病原生生物)及及其產(chǎn)物物分子和和一些化化合物對對哺乳動動物的免免疫系統(tǒng)統(tǒng)而言是是外源抗抗原，這這些抗原原能通過過侵染或或其他的的途徑刺刺激免疫疫系統(tǒng)，產(chǎn)生以以抗體為為主的體體液免疫疫應(yīng)答。同樣用用抗原人人工免疫疫實驗動動物，可可以獲得得含有特特異性抗抗體的血血清，稱稱為抗血血清(aantiiserrum)，因血血清中抗抗體是多多個抗原原決定簇簇刺激不不同B細(xì)細(xì)胞克隆隆而產(chǎn)生生的抗體體，所以以稱多克克隆抗體體(poolycclonnal anttiboody)。一個個B細(xì)胞胞克隆

3、所所分泌的的抗體即即為單克克隆抗體體。用免免疫動物物的B細(xì)細(xì)胞與骨骨髓瘤細(xì)細(xì)胞融合合，在體體外可以以分離出出許多單單個B細(xì)細(xì)胞克隆隆，以此此方法可可制備單單克隆抗抗體(mmonoocloonall anntibbodyy)。隨隨著分子子生物學(xué)學(xué)技術(shù)的的發(fā)展，已經(jīng)可可以用抗抗體基因因文庫(anttiboody commbinnatooriaal llibrraryy)篩選選制備單單克隆抗抗體。應(yīng)應(yīng)用基因因工程技技術(shù)，根根據(jù)需要要對抗體體進(jìn)行改改造，獲獲得基因因工程抗抗體(eengiineeerinng aantiiboddy)，以及催催化性抗抗體(ccataalyttic anttiboody

4、或abbozyyme)等的全全新的抗抗體。 一、抗血清清的制備備 1免疫動動物 (11)抗原原：免疫疫動物是是制備抗抗血清的的第步。免免疫所用用的抗原原可用病病毒、細(xì)細(xì)菌或者者其他蛋蛋白質(zhì)抗抗原，如如果使用用半抗原原如小分分子激素素等，必必須與大大分子載載體連接接，連接接劑見表表71。抗抗原的用用量視抗抗原種類類及動物物而異，次注射射小鼠可可以少至至幾個微微克，免免、羊甚甚至更大大的動物物每次注注射的量量就相應(yīng)應(yīng)增加，從幾百百g次次至幾mmg次次。2)佐佐劑及乳乳化：佐佐劑可以以幫助抗抗原在注注射部位位緩慢釋釋放，以以增加免免疫刺激激的效果果。佐劑劑有完全全和不完完全佐劑劑之分。完全佐佐劑加有

5、有滅活的的分枝桿桿菌(如如卡介苗苗)或棒棒狀桿菌菌。福氏氏佐劑可可從試劑劑公司購購買，也也可用羊羊毛脂和和石蠟油油按1：24混合合自行制制備。佐佐劑與抗抗原按11：1的的比例混混合乳化化為均勻勻的乳液液，放置置后不會會發(fā)生油油水分離離。 (3)免疫動動物：常常用于制制備抗血血清的動動物打豚豚鼠、家家免、小小鼠、大大鼠等，如果大大量生產(chǎn)產(chǎn)可用動動物羊、馬等，動物接接受免疫疫的乳液液量小鼠鼠為10200 mLL，家兔兔為24mLL?？乖庖邉觿游锏耐就緩饺Q決于動物物種類、抗原特特性和是是否使用用佐劑。腹腔注注射(iip)，肌肉肉注射(imm)，皮皮內(nèi)注射射(id)和皮下下注射(scc)適適合于

6、任任何抗原原，這些些途徑主主要刺激激局部淋淋巴結(jié)發(fā)發(fā)生免疫疫應(yīng)答，初次免免疫和免免疫加強(qiáng)強(qiáng)注射均均可使用用。靜脈脈注射(i.vv.)則則只適合合于可溶溶性抗原原及分散散的單細(xì)細(xì)胞懸液液，且不不能使用用佐劑，其誘發(fā)發(fā)的免疫疫應(yīng)答主主要發(fā)生生在脾臟臟。此外外，在單單克隆抗抗體制備備時，亦亦可用脾脾臟直接接注射或或體外免免疫方法法，尤其其對微量量抗原比比較實用用。體外外免疫方方法也常常用于人人源單克克隆抗體體的制備備。體外外免疫時時將脾細(xì)細(xì)胞或外外周血淋淋巴細(xì)胞胞(包括括B細(xì)胞胞，T細(xì)細(xì)胞及抗抗原遞呈呈細(xì)胞)與抗原原一起作作體外培培養(yǎng)，然然后再與與骨髓瘤瘤細(xì)胞融融合。初初次免疫疫后要經(jīng)經(jīng)過23次以以

7、上的免免疫加強(qiáng)強(qiáng)以保證證能形成成較高水水平的IIgC抗抗體。兩兩次免疫疫注射之之間的時時間間隔隔，一般般34周比比較適合合大部分分動物，小動物物可間隔隔1014dd，大動動物則在在2月左左右。在在免疫加加強(qiáng)最后后一次注注射后的的一周內(nèi)內(nèi)采集抗抗血清，可獲得得高水平平的抗體體。 2抗血血清的純純化與保保存 （1）采血：加強(qiáng)免免疫的動動物23次后后，可通通過耳靜靜脈或眼眼球(小小鼠)采采血，進(jìn)進(jìn)行抗血血清效價價測定。當(dāng)效價價達(dá)到理理想的高高度后，可以采采血。采采血方式式可以從從心臟直直接取血血，也可可通過動動脈放血血。待血血液凝固固后用針針筒或吸吸管吸取取血清。 (2)抗血清清的純化化與保存存：除

8、抗抗體外血血清中含含有多種種其他蛋蛋白成分分。為了了避免這這些蛋白白質(zhì)干擾擾抗體(免疫球球蛋白)標(biāo)記反反應(yīng)和抗抗原抗體體反應(yīng)，抗血清清可經(jīng)過過純化以以獲得單單一的機(jī)機(jī)體(常常為IggG)組組分。常常用的純純化IggG的方方法為飽飽和硫酸酸胺鹽析析和層析析法。蛋蛋白質(zhì)在在不同的的鹽濃度度的溶液液中，其其溶解度度不一樣樣，鹽離離子干擾擾蛋白質(zhì)質(zhì)和水分分子間氫氫鍵形成成，因為為水鹽結(jié)合合比水蛋白質(zhì)質(zhì)結(jié)合更更穩(wěn)定，蛋白質(zhì)質(zhì)即可從從溶液中中沉淀出出來。蛋蛋白質(zhì)分分子越大大，沉淀淀時所需需鹽離子子濃度越越低。免免疫球蛋蛋白(MMr 11.5105)比血血清中主主要蛋白白質(zhì)白蛋蛋白(MM r 6.77104

9、)的分分子大得得多，抗抗體在33050飽和度度的硫酸酸鹽中析析出，而而白蛋白白需在77080飽和度度才析出出，因此此常用333飽飽和度的的硫酸胺胺純化血血清中的的IgGG。鹽析析時為了了減少抗抗體變性性，需在在4進(jìn)行，同時用用pH88.0緩緩沖液稀稀釋抗血血清，以以減少蛋蛋白濃度度過高而而發(fā)生共共沉淀。銨鹽的的溶解度度不隨溫溫度變化化而明顯顯改變，0和25僅差33，而而鈉鹽則則相差55倍，因因此常在在低溫沉沉淀時用用銨鹽，室溫沉沉淀用鈉鈉鹽。銨銨鹽對抗抗體的標(biāo)標(biāo)記反應(yīng)應(yīng)(如FFITCC和biiotiin標(biāo)記記時)有有一定的的干擾作作用。 鹽析法法只能部部分純化化抗體，更高純純度的抗抗體制劑劑可

10、用層層析法制制備。 IgMM五聚體體相對分分子質(zhì)量量達(dá)9.7105，比血血清中任任何其他他蛋白都都大，用用分子篩篩層析很很容易將將其純化化。IggG在PPH 880時時帶負(fù)電電荷，能能與DEEAE纖纖維素上上的陽離離子結(jié)合合，因此此可用離離子交換換層析來來純化IIgG。IgGG純化最最常用的的方法為為親和層層析。IIgG與與葡萄球球菌A蛋蛋白和鏈鏈球菌GG蛋白具具合高度度的親和和性，可可用這兩兩種蛋白白質(zhì)交聯(lián)聯(lián)親和層層析柱將將IgGG純化。大部分分IgGG與蛋白白A結(jié)合合PH為為89，洗洗脫P(yáng)HH為24；而而與蛋白白G的結(jié)結(jié)合PHH為57，洗洗脫P(yáng)HH為910。C蛋白白更適合合于IggG的純純

11、化，不不但反應(yīng)應(yīng)條件為為溫和的的弱酸性性或弱堿堿性，并并且與IIgG的的結(jié)合力力高于AA蛋白。G蛋自自能與大大部分動動物種類類的IggG結(jié)合合，而AA蛋白對對小鼠IIgG11、大鼠鼠IgGG2b、人IggG3、馬和綿綿羊IggG結(jié)合合力弱或或不能結(jié)結(jié)合G蛋蛋白和AA蛋白均均不能與與雞IggG結(jié)合合。 抗血清清或純化化的抗體體在低溫溫保存可可維持活活性數(shù)年年，反復(fù)復(fù)凍融使使抗體很很快失活活，被細(xì)細(xì)菌或霉霉菌污染染的抗血血清或IIgG制制品也易易失去活活性。稀稀釋的抗抗血清加加入防腐腐劑疊氮氮化鈉和和保護(hù)劑劑如BSSA等可可于4保存。長期保保存常用用等量甘甘油于20以下冷冷藏。也也可置于于 500

12、飽和和硫酸銨銨中4保存，還可以以冷凍干干燥保存存。 3抗血血清的特特性鑒定定 根據(jù)不不同目的的制備的的抗血清清，對其其中所含含抗體的的濃度，特異性性及免疫疫球蛋白白種類的的要求也也不一樣樣。為了了獲得質(zhì)質(zhì)量和數(shù)數(shù)量上合合符要求求的抗血血清，在在收集動動物血清清前必須須對免疫疫效果進(jìn)進(jìn)行檢測測，對收收獲后的的抗血清清也必須須對些參數(shù)數(shù)進(jìn)行分分析，如如效價、親和力力及交叉叉反應(yīng)等等。 根據(jù)不不同的抗抗原性質(zhì)質(zhì)選用合合適的檢檢測方法法。最常常用的為為免疫沉沉淀，EELISSA，放放射免疫疫等。 效價又又稱滴度度(tiiterr)，是是常用于于表達(dá)抗抗血清中中特異性性抗體相相對含量量的個半定定量指標(biāo)標(biāo)

13、，即在在給定的的條件下下，結(jié)合合定量抗抗原的抗抗血清的的稀釋度度。抗血血清經(jīng)一一系列稀稀釋后(如倍比比稀釋)與定量量的抗原原反應(yīng)，以能檢檢測抗血血清最大大稀釋倍倍數(shù)即為為該抗血血清的效效價。不不同的檢檢測方法法測定同同一種抗抗血清的的效價，靈敏度度不一樣樣，抗血血清的效效價也不不一樣，如沉淀淀反應(yīng)(瓊脂雙雙擴(kuò)散)與ELLISAA二者的的效價相相差甚大大，后者者遠(yuǎn)高于于前者。放射免免疫分析析(RIIA)常常用于標(biāo)標(biāo)記小分分子抗原原來檢測測抗血清清的效價價。 親和力力(afffinnityy)表示示抗血清清與相應(yīng)應(yīng)抗原的的結(jié)合強(qiáng)強(qiáng)度，是是描述抗抗體持異異性的重重要指標(biāo)標(biāo)，常用親和和常數(shù)KK表示。親

14、和常常數(shù)K與與抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)的平衡衡常數(shù)有有關(guān)： K+AgAAb AAgAbb KAgAAb KK+ K= K=AgAbb K式中K+為結(jié)合合速度常常數(shù)，KK為解離離速度常常數(shù)。親親和常數(shù)數(shù)K的測測定見第第二節(jié) 抗體特特異性與與交叉反反應(yīng)：抗抗體是特特異的。只與相相應(yīng)抗原原反應(yīng)。實際制制備的抗抗體卻常常有非特特異性反反應(yīng)，這這是因為為抗原不不純造成成的。多多組分抗抗原之間間存在共共同的抗抗原決定定簇，或或者兩個個抗原決決定簇結(jié)結(jié)構(gòu)類似似能與同同一抗體體結(jié)合，均可出出現(xiàn)抗體體與異源源抗原的的交叉反反應(yīng)。用用瓊脂雙雙擴(kuò)散能能簡便直直觀地反反映不同同抗原與與同一抗抗血清，或不同同抗血清清與同一一抗

15、原的的交叉反反應(yīng)。 二、單單克隆抗抗體的制制備 1制備備原理 單克隆隆抗體(MAbb)與抗抗血清(又稱多多克隆抗抗體，PPAb)最主要要的區(qū)別別是MAAb為單單一種BB細(xì)胞克克隆所產(chǎn)產(chǎn)生的一一種均一一的免疫疫球蛋白白分子。所以MMAb是是B細(xì)胞胞克隆的的標(biāo)志，是一種種獨特型型的抗體體，它的的特異性性是針對對一個抗抗原決定定簇的。制備單單克隆抗抗體不能能用化學(xué)學(xué)分離的的方法從從多克隆隆抗體中中去分離離純化得得到它，而是用用分離產(chǎn)產(chǎn)生抗體體的B細(xì)細(xì)胞克隆隆的方法法得到它它。為了了使B細(xì)細(xì)胞克隆隆能在體體外人工工培養(yǎng)下下長期存存活并產(chǎn)產(chǎn)生完全全均一的的MAbb，GKhleer合MMilssteiin

16、于119755年創(chuàng)立立了雜交交瘤方法法。所以以制備單單克隆抗抗體的技技術(shù)又稱稱雜交瘤瘤技術(shù)(hybbreddomaa teechnniquue)。 雜交瘤瘤技術(shù)的的基本原原理是用用分泌抗抗體但不不能長期期培養(yǎng)的的B細(xì)胞胞與能在在體外長長期培養(yǎng)養(yǎng)并可低低溫保存存的腫瘤瘤細(xì)胞進(jìn)進(jìn)行雜交交。篩選選得到的的雜交瘤瘤細(xì)胞應(yīng)應(yīng)該是既既能分泌泌抗體又又有瘤細(xì)細(xì)胞的特特性，可可長期傳傳代培養(yǎng)養(yǎng)，又可可在液氮氮中保存存的細(xì)胞胞。把這這些細(xì)胞胞單克隆隆化，用用單克隆隆化的雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞進(jìn)行行單克隆隆抗體的的生產(chǎn)（圖71）。 2B細(xì)胞胞與瘤細(xì)細(xì)胞的來來源及雜雜交瘤選選擇原理理 最常用用的單克克隆抗體體是小鼠鼠的單抗

17、抗，此外外也有大大鼠的和和人源的的單抗。人源單單抗制備備比較復(fù)復(fù)雜。小小鼠單抗抗的制備備通常是是使用BBalbbc小小鼠的BB細(xì)胞和和它的骨骨髓瘤細(xì)細(xì)胞。大大鼠的單單抗制備備通常用用Louuc大大鼠及其其骨髓瘤瘤和Y33AOO大鼠及及其骨髓髓瘤細(xì)胞胞(表772)。B細(xì)胞胞是從免免疫動物物的脾臟臟中分離離出來的的。動物物免疫方方法與抗抗血清制制備相同同，只是是在制備備脾臟前前3d必必須進(jìn)行行一次靜靜脈加強(qiáng)強(qiáng)注射以以保證得得到的BB細(xì)胞有有旺盛的的分泌抗抗體的活活性。骨骨髓瘤細(xì)細(xì)胞有許許多細(xì)胞胞株是經(jīng)經(jīng)過誘變變和篩選選得到的的缺陷型型。篩選選的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)是瘤細(xì)胞胞本身不不產(chǎn)生抗抗體或者者產(chǎn)生抗抗體的某

18、某種鏈，但不能能分泌；是次黃黃嘌呤鳥鳥嘌呤核核苷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(HGPPRT)和胸腺腺嘧啶激激酶(TTK)的的缺陷型型。因為為這種缺缺陷型的的瘤細(xì)胞胞正常的的核酸合合成途徑徑被氨基基喋吟(amiinoppterrin)阻斷后后，由于于缺失這這些酶，即使補(bǔ)補(bǔ)充它的的底物次次黃嘌呤呤(H)和胸腺腺嘧啶(T)，核酸合合成的旁旁路也不不能起到到救援的的作用，結(jié)果導(dǎo)導(dǎo)致瘤細(xì)細(xì)胞死亡亡(圖772)。而雜交交瘤細(xì)胞胞因帶有有B細(xì)胞胞的全套套基因，在HAAT存在在的條件件下借助助于HGGPRTT和TKK的作用用通過替替代的核核酸合成成途徑能能正常合合成DNNA和RRNA。所以雜雜交瘤能能正常地地生長繁繁殖而被被選

19、擇出出來。未未被融合合的游離離的B細(xì)細(xì)胞只能能存活33d而后后自行死死亡。這這就是用用HATT培養(yǎng)基基進(jìn)行選選擇的原原理。 33細(xì)胞胞雜交與與選擇培培養(yǎng) (1)融合：細(xì)胞雜雜交之前前，要分分別準(zhǔn)備備好脾臟臟的B細(xì)細(xì)胞懸液液和小鼠鼠骨髓瘤瘤細(xì)胞(如SPP200Agll4細(xì)胞胞株)。免疫后后的小鼠鼠脾臟在在無菌條條件下破破碎，將將B細(xì)胞胞懸浮在在沒有血血清的培培養(yǎng)液中中(通常常使用RRPMIIl6440商品品配制)，并洗洗滌3次次去掉小小鼠的血血清。SSP20細(xì)胞胞是用加加有100胎牛?；蛐∨ＥＱ迮嗯囵B(yǎng)的，每天更更換新鮮鮮培養(yǎng)液液使成為為對數(shù)分分裂期生生長旺盛盛的細(xì)胞胞。細(xì)胞胞用RPPMIll6

20、400洗滌223次，把兩種種細(xì)胞合合并在同同試管中中，用550的的聚乙二二醇(相相對分子子質(zhì)量為為1000015000)作作為融合合劑，在在37條件下下融合ll2miin。然然后用116400培養(yǎng)液液緩慢稀稀釋，然然后除去去PEGG，將細(xì)細(xì)胞分散散至HAAT選擇擇培養(yǎng)板板中。電電融合方方法也可可用于單單克隆抗抗體制備備，雖融融合率較較高，但但一次融融合的細(xì)細(xì)胞數(shù)少少，且需需專門設(shè)設(shè)備，故故限制了了其廣泛泛使用。融合時時脾細(xì)胞胞和骨髓髓瘤細(xì)胞胞的比例例在5：110：1均可可獲得滿滿意結(jié)果果，每次次融合細(xì)細(xì)胞數(shù)量量在1007108較為合合適。融融合后的的細(xì)胞在在40或或96孔孔板上的的HATT培養(yǎng)

21、液液(RPPMIll6400含10020胎?；蚧蛐∨Ｑ搴虷HAT)中377，5CO22條件下下培養(yǎng)。融合后后的細(xì)胞胞懸液中中只有脾脾細(xì)胞和和骨髓瘤瘤細(xì)胞形形成的雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞能在在HATT培養(yǎng)基基中生長長，其他他形式的的融合細(xì)細(xì)胞均不不能生長長未融融合的細(xì)細(xì)胞也不不能在HHAT培培養(yǎng)液中中生存(表73)。 在融合合后的細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)過程中中，飼養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞(feeederr ceell)有助于于雜交瘤瘤細(xì)胞的的生長。飼養(yǎng)細(xì)細(xì)胞可用用同種動動物的腹腹腔細(xì)胞胞或胸腹腹細(xì)胞。腹腔細(xì)細(xì)胞中的的吞噬細(xì)細(xì)胞能清清除死亡亡細(xì)胞碎碎片。使使背景更更為清潔潔“干凈”。同時時飼養(yǎng)細(xì)細(xì)胞分泌泌的細(xì)胞胞因子或或活性物物

22、質(zhì)有助助于雜交交瘤細(xì)胞胞的生長長?，F(xiàn)有有商品“雜交瘤瘤細(xì)胞生生長因子子”可用于于替代飼飼養(yǎng)細(xì)胞胞。 (2)陽性雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞的篩篩選與單單克降化化：雜交交細(xì)胞經(jīng)經(jīng)約10014dd培養(yǎng)后后，形成成可用的的細(xì)胞集集落(克克隆)。經(jīng)過幾幾次更換換培養(yǎng)液液(HTT培養(yǎng)液液)后進(jìn)進(jìn)行抗體體活性檢檢測。常常用的篩篩選槍測測方法是是ELIISA和和凝集試試驗，前前者常用用于可溶溶性抗原原，后者者適用于于細(xì)胞、細(xì)菌等等表面抗抗原。此此外，DDotELIISA、免疫印印跡及免免疫熒光光試驗均均可用于于雜交瘤瘤細(xì)胞的的篩選。 使使許多細(xì)細(xì)胞克隆隆混合生生長的細(xì)細(xì)胞分離離為單個個的細(xì)胞胞克隆的的過程稱稱克隆化化(c

23、oolonnizaatioon)最最常用的的單克隆隆化方法法是有限限稀釋法法(liimitted dillutiion)，即將將混合細(xì)細(xì)胞經(jīng)稀稀釋后分分裝于培培養(yǎng)板上，使培培養(yǎng)板的的大部分分孔中只只出現(xiàn)一一個細(xì)胞胞。為了了確?？箍贵w分泌泌細(xì)胞來來源于單單個細(xì)胞胞，克隆隆化過程程可重復(fù)復(fù)進(jìn)行，稱為亞亞克隆化化(suubclloniizattionn)。除除有限稀稀釋法外外，熒光光激活細(xì)細(xì)胞分揀揀法(FACCS)也也用于雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞的克克隆化過過程。 4單單克隆抗抗體的擴(kuò)擴(kuò)大生產(chǎn)產(chǎn) 產(chǎn)生特特異性抗抗體的單單克隆雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞株應(yīng)應(yīng)立即擴(kuò)擴(kuò)大培養(yǎng)養(yǎng)，以獲獲得足夠夠的細(xì)胞胞用于保保存和生生產(chǎn)可供供應(yīng)

24、用的的抗體。生產(chǎn)大大量單克克隆抗體體的方法法目前常常用的有有3種：小鼠腹腹水制備備，大瓶瓶培養(yǎng)和和中空纖纖維反應(yīng)應(yīng)器，前前者多用用于實驗驗室制備備，后二二者適應(yīng)應(yīng)于工廠廠化生產(chǎn)產(chǎn)。 腹水制制備：雜雜交骨髓髓瘤細(xì)胞胞在腹腔腔中定植植，并產(chǎn)產(chǎn)生大量量腹水。選用與與單克隆隆抗體制制備所用用相同的的動物品品系或者者含有相相同基因因的Fll代雜交交品系。雜交FF1代品品系更適適合于腹腹水制備備，如果果用異源源動物制制備腹水水時可選選用無MMHC限限制性的的裸鼠。用小鼠鼠制備腹腹水時，先用礦礦物油或或Priistaane致致敏，以以抑制其其免疫功功能，利利于腹水水的形成成。腹腔腔注射1106107個雜交交

25、瘤細(xì)胞胞，經(jīng)過過710 d后形形成腹水水。每只只小鼠可可獲得335mLL腹水，每mLL含IggG抗體體可達(dá)5510mmg。腹腹水中含含有較多多的雜蛋蛋白和非非特異性性IgGG，并且且含有許許多蛋白白酶，易易使抗體體失活，因此腹腹水收集集后應(yīng)盡盡快純化化，以防防止降解解。 大瓶培培養(yǎng)：采采用10000mmL或更更大的搖搖瓶培養(yǎng)養(yǎng)。大瓶瓶培養(yǎng)上上清體積積大，但但抗體濃濃度低，給抗體體純化帶帶來很大大困難，消耗人人力和培培養(yǎng)液，增加生生產(chǎn)成本本。 中空纖纖維反應(yīng)應(yīng)器：是是比較經(jīng)經(jīng)濟(jì)的單單克隆抗抗體生產(chǎn)產(chǎn)方法。該裝置置由具有有半透膜膜性質(zhì)的的成束的的微孔纖纖維組成成，雜交交瘤細(xì)胞胞位于纖纖維外部部的小

26、量量培養(yǎng)液液中，培培養(yǎng)液在在纖維的的微孔中中循環(huán)，供給營營養(yǎng)和帶帶走廢物物，抗體體大分子子和小分分子化合合物被隔隔開。高高密度的的雜交瘤瘤細(xì)胞能能在此系系統(tǒng)中維維持?jǐn)?shù)月月，每天天可產(chǎn)生生數(shù)百毫毫克的抗抗體，抗抗體濃度度高，體體積小易易于純化化。 胎(小小)牛血血清一直直是細(xì)胞胞培養(yǎng)所所必須的的，在單單克隆抗抗體生產(chǎn)產(chǎn)過程中中培養(yǎng)液液中的血血清蛋白白使抗體體的純化化增加了了困難，近年開開發(fā)的無無血清培培養(yǎng)技術(shù)術(shù)已逐漸漸用于單單克隆抗抗體的生生產(chǎn)中。 5人人單克隆隆抗體的的制備 小鼠的的單克隆隆抗體蛋蛋白應(yīng)用用于人體體后，作作為抗原原能引起起人的免免疫應(yīng)答答，大大大降低其其生物活活性，并并可能導(dǎo)導(dǎo)

27、致變態(tài)態(tài)反應(yīng)。因此人人源單克克隆抗體體在臨床床治療上上有廣泛泛應(yīng)用前前景，引引起人們們的普遍遍興趣。但是人人單克隆隆抗體制制備存在在許多技技術(shù)上和和倫理上上的障礙礙，如人人雜交瘤瘤細(xì)胞系系不穩(wěn)定定，有些些抗原不不能對人人進(jìn)行人人工免疫疫，人BB細(xì)胞只只能從外外周血中中分離而而無法從從脾臟取取得等。盡管如如此，一一些人源源單克隆隆抗體已已經(jīng)獲得得，技術(shù)術(shù)上也在在逐步完完善起來來。 人的瘤瘤細(xì)胞株株U2666常用來來與人外外周血BB細(xì)胞融融合以獲獲得人源源單克隆隆抗體。另一些些淋巴母母細(xì)胞抹抹(LCCL)則則來源于于EB病病毒轉(zhuǎn)化化的淋巴巴細(xì)胞，如GMMl5000，WW1L2和和ARHH77等等也

28、用于于雜交瘤瘤細(xì)胞的的制備。這些細(xì)細(xì)胞系表表現(xiàn)EDD病毒核核抗原(EBNNA)陽陽性，且且形成的的雜交瘤瘤細(xì)胞抗抗體的分分泌水平平不高。 獲得人人單克隆隆抗體的的另一方方法是用用EBVV直接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化某些些抗體分分泌細(xì)胞胞，使之之成為“不死”的細(xì)胞胞在體外外培養(yǎng)。EBVV感染人人B細(xì)胞胞后，病病毒基因因插入人人B細(xì)胞胞基因組組中，有有1的的細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為“不死”的細(xì)胞胞。B細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化化可通過過“病毒驅(qū)驅(qū)動”和“細(xì)胞驅(qū)驅(qū)動”兩種方方法獲得得。前者者是將BB細(xì)胞與與分泌EEBV的的B9558細(xì)胞胞系一同同培養(yǎng)，后者則則是與EEBNAA陽性的的LCLL細(xì)胞一一同培養(yǎng)養(yǎng)?！凹?xì)胞驅(qū)驅(qū)動”轉(zhuǎn)化的的B細(xì)胞胞比較穩(wěn)

29、穩(wěn)定，抗抗體分泌泌能力也也較強(qiáng)。 人淋巴巴母細(xì)胞胞系和人人雜交瘤瘤細(xì)胞較較難獲得得，人單單克隆抗抗體也可可以通過過異源雜雜文的辦辦法制備備，即將將EBVV轉(zhuǎn)化的的B細(xì)胞胞與小鼠鼠骨髓瘤瘤細(xì)胞融融合，將將獲得的的異源雜雜交瘤細(xì)細(xì)胞再與與免疫后后的B細(xì)細(xì)胞融合合，得到到人單克克隆抗體體分泌細(xì)細(xì)胞，不不產(chǎn)生自自身免疫疫球蛋白白，EBBVA也也是陰性性。 三、基基因工程程抗體的的制備 1抗抗體的化化學(xué)修飾飾 抗體FFc段用用雙功能能連接劑劑與熒光光素，同同位素，酶，發(fā)發(fā)光化合合物，稀稀土元素素以及藥藥物，毒毒素等連連接后，并不影影響其FFab功功能區(qū)與與特異性性抗原結(jié)結(jié)合。根根據(jù)交聯(lián)聯(lián)物的性性質(zhì)不同同

30、，標(biāo)記記的抗體體可用作作診斷試試劑，也也可作為為藥物的的定向載載體，引引導(dǎo)藥物物或毒素素到達(dá)抗抗原存在在部位使使藥物或或使毒素素發(fā)揮更更有效的的作用，即俗稱稱“生物導(dǎo)導(dǎo)彈”。從而而減少藥藥物、毒毒素、同同位素、酶在腫腫瘤治療療過程中中引起嚴(yán)嚴(yán)重的副副作用，大大提提高治療療腫瘤的的效果。 許多毒毒素如蓖蓖麻毒素素，白喉喉毒素，天花粉粉，紅豆豆毒素等等均為蛋蛋白質(zhì)或或糖蛋白白，可用用雙功能能劑與抗抗體相連連；嗎啡啡，前列列腺素，氨甲喋喋吟，磷磷酸酯酶酶C等含含有羧基基能用碳碳二亞胺胺(EDDC)，混合酸酸酐法與與抗體的的氨基形形成酰胺胺鍵；同同樣，含含脂肪胺胺的藥物物如慶大大雷素，阿霉素素在水溶溶

31、性EDDC的作作用下與與抗體的的羧基連連接；而而含芳香香胺的藥藥物則先先在低溫溫下與亞亞硝酸作作用形成成重氮化化合物，再與抗抗體分子子上的酪酪氨酸或或組氨酸酸殘基形形成偶氮氮鍵。總總之通過過抗體的的化學(xué)修修飾把抗抗體的特特異性用用到定向向給藥和和定位檢檢測上。 2抗抗體基因因文庫 抗體基基因文庫庫(anntibbodyy reecommbinnatiion libbrarry)是是將不同同的重鏈鏈和輕鏈鏈基因隨隨機(jī)組合合，克隆隆到合適適的表達(dá)達(dá)載體中中，在原原核細(xì)胞胞表達(dá)不不同的抗抗體，形形成一個個抗體庫庫，從這這個抗體體庫中，用抗原原可以篩篩選到相相應(yīng)的抗抗體基因因(圖773)?？贵w基基因來

32、源源于雜交交瘤細(xì)胞胞或動物物B細(xì)胞胞(免疫疫或未免免疫)的的DNAA和mRRNA 。用質(zhì)粒作作為抗體體文庫的的載體，雖然也也可能表表達(dá)有活活性的抗抗體分子子或片段段，但由由線狀噬噬菌體表表達(dá)更為為方便有有效。MM13、fd、F1等等噬菌體體的外殼殼蛋白由由5種蛋蛋白組成成：p、p、p、p和p。每種種含量不不一，其其中p含量最最多，每每個噬菌菌體有227000個p亞基，其余44種蛋白白僅5個個拷貝。增加噬噬菌體外外殼蛋白白的長度度并不影影響噬菌菌體的裝裝配，抗抗體以融融合蛋白白的形式式表達(dá)于于噬菌體體表面。噬菌體體表達(dá)質(zhì)質(zhì)粒常用用的有ffdCCAT11、fddteetDDOG11、PHENN1、

33、ppCommb3和和pCoomb33H等?？贵w融融合蛋白白構(gòu)建多多用p和p，p拷貝數(shù)數(shù)高，低低親和力力的抗體體蛋白容容易篩選選出來。在噬菌體體表達(dá)抗抗體時，常常不不表達(dá)完完整的抗抗體分子子，（因因為CHH2上不不能進(jìn)行行糖基化化）。根根據(jù)不同同的引物物得到重重鏈的VVH或VHCH1區(qū)，輕鏈的的VL或VLCL區(qū)。VVL和VH兩個片片段用一一短肽作作連接片片段，形形成單鏈鏈可變區(qū)區(qū)（siingllecchaiin ffraggmennt vvariiablle，sscFvv）；VVHCH1和VVLCL兩片段段則形成成Fabb片段。另外，單獨的的VH和VL也能結(jié)結(jié)合抗原原，如果果二者形形成同源源或異

34、源源二聚體(dAbb)，則則穩(wěn)定性性和親和和性明顯顯提高(圖74)。此外在在抗體片片段DNNA末端端加上一一些功能能蛋白(如堿性性磷酸酶酶和蛋白白毒素)的基因因，則表表達(dá)的抗抗體就帶帶有一定定生物活活性功能能片段，可用于于檢測或或治療。如果在在抗體基基因末端端加上終終止子(TAGG)則表表達(dá)的抗抗體片段段是可溶溶性的，而不是是結(jié)合在在噬菌體體表面。 用特特異性抗抗原免疫疫的動物物B細(xì)胞胞構(gòu)建抗抗體的噬噬菌體文文庫，抗抗體親和和性高，用與免免疫抗原原不同的的抗原篩篩選得到到的抗體體親和性性普遍較較低?？煽捎媚M擬天然體體細(xì)胞突突變的方方法來提提高親和和力。如如混雜重重組法，即將己己獲得的的輕鏈或

35、或重鏈的的V片段段切下，再克隆隆至隨機(jī)機(jī)的文庫庫中的VV區(qū)構(gòu)成成二級文文庫，使使H鏈和和L鏈混混雜，可可以使抗抗體片段段的親和和性提高高。利用用PCRR錯配將將隨機(jī)突突變引人人至抗體體的抗原原結(jié)合區(qū)區(qū)，也能能提高對對抗原的的親和力力。先用用低親和和力的載載體在噬噬菌體的的P表達(dá)，篩選后后、將抗抗體基因因片段PPCR擴(kuò)擴(kuò)增轉(zhuǎn)至至P上表達(dá)達(dá)，可獲獲得高親親和力的的抗體片片段。 抗體基基因文庫庫有兩個個優(yōu)點，一是從從不適合合進(jìn)行人人工免疫疫的物種種獲得單單克隆抗抗體，如如人源單單克隆抗抗體；二二是可快快速方便便獲得單單克隆抗抗體。 3抗抗體基因因的改造造 將鼠源源抗體的的V區(qū)基基因與人人源抗體體C區(qū)

36、基基因重組組，獲得得的嵌合合抗體(chiimerricaal aantiiboddy)，可保留留鼠抗體體對抗原原的高親親和性，又減弱弱鼠源抗抗體對人人的免疫疫原性，提高治治療性抗抗體的效效果。重組的嵌嵌合抗體體基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化骨髓髓瘤細(xì)胞胞或中國國地鼠卵卵細(xì)胞(CH00)，可可在其中中表達(dá)。為了進(jìn)進(jìn)一步地地消除鼠鼠抗體VV區(qū)框架架區(qū)(FFW)的的異源性性，可實實行CDDR移植植(CDDR ggrafftinng)，以獲得得與鼠FFW類似似的人FFW結(jié)構(gòu)構(gòu)的嵌合合抗體。 噬菌體體表達(dá)的的抗體僅僅含V區(qū)區(qū)(sccFv)或Faab片段段，缺乏乏Fc區(qū)區(qū)，使抗抗體的穩(wěn)穩(wěn)定性下下降，半半衰期縮縮短，與與Fc受

37、受體結(jié)合合功能也也消失。因此在在抗體功功能片段段的末端端連接AA蛋白、酶、細(xì)細(xì)胞因子子、CDD4和毒毒素等分分子，既既可增加加抗體片片段的穩(wěn)穩(wěn)定性，又可發(fā)發(fā)揮某些些生物學(xué)學(xué)活性功功能。 用抗體體基因工工程方法法獲得的的抗體與與效應(yīng)分分子交聯(lián)聯(lián)物比用用化學(xué)交交聯(lián)法具具有優(yōu)點點：可以以大量生生產(chǎn)，不不會因修修飾作用用影響抗抗體及效效應(yīng)分子子的活性性，效應(yīng)應(yīng)分子還還可根據(jù)據(jù)需要進(jìn)進(jìn)行改造造。 此外在在抗體片片段的末末端連接接一段特特異的雙雙親性螺螺旋(aamphhiphhiliic hheliixess)結(jié)構(gòu)構(gòu)，如亮亮氨酸拉拉鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)(leeuciine zippperr)，可可使單價價的sccFv

38、或或Fabb片段在在體內(nèi)或或體外形形成穩(wěn)定定的雙分分子聚合合體，從從而提高高抗體片片段的親親和力。此法也也可用于于制備雙雙特異性性抗體。 4基基因工程程抗體在在真核細(xì)細(xì)胞中的的表達(dá) 噬菌體體表達(dá)的的抗體片片段常常常是在原原核細(xì)胞胞(E.colli)中中完成。原核系系統(tǒng)表達(dá)達(dá)抗體片片段產(chǎn)量量高，成本本低，快快速易于于操作。但抗體體片段在在原核表表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)中不能能進(jìn)行CCH2糖糖基化，從而影影響抗體體的活性性。因此此重組抗抗體基因因片段可可轉(zhuǎn)移至至適合的的骨髓瘤瘤細(xì)胞系系或哺乳乳動物細(xì)細(xì)胞系(如CHHO)，甚至于于植物細(xì)細(xì)胞中表表達(dá)，可可以得到到與淋巴巴細(xì)胞表表達(dá)相同同的抗體體分子。免疫球球蛋白I

39、IgA的重鏈和和輕鏈及及分泌片片基因可可以分別別轉(zhuǎn)化不不同的植植株，將將表達(dá)這這些蛋白白的植株株進(jìn)行有有性雜交交，在雜雜交后代代中可以以裝配成成完整的的IgAA雙分子子。以植植物作為為生物反反應(yīng)器進(jìn)進(jìn)行抗體體的表達(dá)達(dá)已有許許多成功功的研究究報道，與動物物細(xì)胞相相比更為為經(jīng)濟(jì)，具有廣廣泛的應(yīng)應(yīng)用前景景。 四、催催化性抗抗體的制制備 1抗抗體催化化的原理理 19886年，由PGsschuultzz和RALLernner分分別領(lǐng)導(dǎo)導(dǎo)的兩個個小組同同時證明明抗體具具有催化化活性。針對一一個四面面體帶電電荷的磷磷酸酯半半抗原產(chǎn)產(chǎn)生的抗抗體，能能有選擇擇性地催催化相應(yīng)應(yīng)的碳酸酸脂和羧羧酸脂的的水解反反應(yīng)。

40、他他們將這這種有催催化活性性的抗體體稱為催催化性抗抗體(ccataalyttic anttiboody)，又稱稱抗體酶酶(abbozyyme)。催化化抗體的的作用取取決于底底物分子子水解時時的轉(zhuǎn)換換態(tài)(ttrannsittionn sttatee)(圖圖75)。轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)的分子子結(jié)構(gòu)是是分子活活化后的的一種結(jié)結(jié)構(gòu)狀態(tài)態(tài)，處于于轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)的分子子具有最最高的活活化能，分子表表現(xiàn)極性性。處于于這種狀狀態(tài)的分分子也是是最不穩(wěn)穩(wěn)定的，能與這這種分子子結(jié)合的的酶或者者抗體會會使某些些化學(xué)鍵鍵發(fā)生斷斷裂(如如酯鍵，碳鍵，胺鍵等等)起到到酶解作作用。可可見抗體體酶的作作用與天天然的蛋蛋白質(zhì)酶酶非常相相似。抗抗體

41、酶也也表現(xiàn)出出對底物物的專一一性，對對立體結(jié)結(jié)構(gòu)的專專一性。在飽和和動力學(xué)學(xué)與競爭爭性抑制制方面都都與常規(guī)規(guī)酶相似似。所以以抗體酶酶的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)打破了了只有常常規(guī)酶才才有的分分子識別別和加速速催化反反應(yīng)的傳傳統(tǒng)概念念，為酶酶工程學(xué)學(xué)開創(chuàng)了了新的領(lǐng)領(lǐng)域。 2抗抗體催化化的化學(xué)學(xué)反應(yīng) 由抗體體催化的的化學(xué)反反應(yīng)特異異性高于于酶，但但催化速速率低于于常規(guī)的的酶，只只有l(wèi)003106倍。但但有一些些未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)催化劑劑的反應(yīng)應(yīng)，如DDiellsAldder反反應(yīng)也能能被抗體體催化。常規(guī)酶酶一般不不能催化化胺鍵水水解，抗抗體酶能能使胺鍵鍵水解的的速度增增加255萬倍。訖今為為止，已已發(fā)現(xiàn)和和證明的的由抗體體催化

42、的的化學(xué)反反應(yīng)不下下40種種。 3催催化性抗抗體的制制備 抗體酶酶是抗原原決定簇簇處于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)結(jié)構(gòu)的抗抗體。因因為轉(zhuǎn)換換態(tài)分子子極不穩(wěn)穩(wěn)定無法法制備抗抗體，所所以催化化性抗體體的獲得得主要是是通過設(shè)設(shè)計穩(wěn)定定的轉(zhuǎn)換換態(tài)的類類似物作作為半抗抗原，與與載體蛋蛋白交聯(lián)聯(lián)后，免免疫動物物，獲得得針對半半抗原的的抗體，從中篩篩選具有有催化活活性的抗抗體。篩篩選催化化性單克克隆抗體體所用的的ELIISA與與篩選一一般抗體體的方法法不完全全一樣，應(yīng)根據(jù)據(jù)催化反反應(yīng)的特特點而進(jìn)進(jìn)行適當(dāng)當(dāng)?shù)男薷母?。?jīng)典典的方法法是先篩篩選出與與底物或或半抗原原結(jié)合的的抗體，然后從從中再篩篩選出有有催化活活力的抗抗體，這這種方

43、法法費時費費力。利利用催化化性抗體體對底物物的催化化活性，對底物物進(jìn)行適適當(dāng)修飾飾，使催催化反應(yīng)應(yīng)的產(chǎn)物物可直接接表現(xiàn)抗抗體的催催化活性性，這樣樣可以簡簡化檢測測步驟。 轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)類似物物半抗原原的設(shè)計計，必須須了解催催化反應(yīng)應(yīng)的轉(zhuǎn)換換態(tài)模型型的結(jié)構(gòu)構(gòu)特點。催化抗抗體的抗抗原結(jié)合合位點上上與轉(zhuǎn)換換態(tài)互補(bǔ)補(bǔ)的某些些催化基基團(tuán)的形形成，能能穩(wěn)定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)分分子。此此外有人人把單克克隆抗體體分子用用化學(xué)修修飾方法法引入一一些活性性基團(tuán)，提高催催化性抗抗體的催催化與親親和效率率。應(yīng)用用噬菌體體抗體文文庫也可可以篩選選催化性性抗體，可省去去制備轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)類類似物的的復(fù)雜過過程，直直接用底底物從文文庫中篩篩選有

44、催催化活性性的抗體體片段。如用半半抗原免免疫后制制備的文文庫或文文庫經(jīng)過過多次混混雜重組組，則可可以得到到更高的的親和力力的催化化性抗體體?？躬毆毺匦涂箍贵w也用用于催化化性抗體體的制備備，用酶酶作為抗抗原免疫疫小鼠獲獲得能夠夠封閉酶酶活性位位點的單單克隆抗抗體，將將這個抗抗體用蛋蛋白酶除除去Fcc片段，用Faab免疫疫其他品品系的小小鼠或家家兔，得得到的抗抗體具有有相應(yīng)的的酶催化化活性。 從理論論上看，B細(xì)胞胞具有全全套免疫疫球蛋白白的多樣樣性的胚胚系基因因，當(dāng)然然也包括括有催化化作用的的自身抗抗體在內(nèi)內(nèi)。然而而19889年P(guān)Paull W.首次報報道了人人體的一一種能催催化蛋白白質(zhì)水解解的免

45、疫疫球蛋白白。它是是種自身身抗體，能水解解血管活活性腸肽肽(vaasoaactiive inttensstinnal pepptidde，VVIP)的Gllnl66Mett17鍵鍵。用VVIP作作為抗原原能得到到有催化化作用的的單克隆隆抗體，也能催催化Gllnl66Mett17鍵鍵。大約約有177的人人有這種種自身抗抗體酶，但患有有氣喘的的病人中中該抗體體與VIIP的親親和力比比健康人人高500倍。由由于VIIP是一一種氣管管松弛劑劑，因此此有人認(rèn)認(rèn)為這種種VIPP自身抗抗體的長長期作用用可能與與氣喘的的過敏應(yīng)應(yīng)答有一一定關(guān)系系。由此此推測除除了人工工設(shè)計催催化抗體體以及發(fā)發(fā)現(xiàn)的自自身催化化抗

46、體外外，用篩篩選單抗抗的方法法，也有有可能找找到所需需要的催催化抗體體。第二節(jié) 抗原原抗體反反應(yīng)原理理 抗體能能特異性性地識別別相應(yīng)的的抗原，并與之之結(jié)合。這種結(jié)結(jié)合在體體外也能能發(fā)生，這種特特性就是是許多免免疫檢測測方法的的基礎(chǔ)。抗原與與抗體相相互作用用是非共共價的，可逆的的，其特特性符合合許多化化學(xué)反應(yīng)應(yīng)的基本本原理。但因為為抗體分分子的結(jié)結(jié)構(gòu)特點點，以及及抗原分分子結(jié)構(gòu)構(gòu)的多樣樣性，使使抗原抗抗體結(jié)合合反應(yīng)表表現(xiàn)出復(fù)復(fù)雜性。 一、抗原抗抗體作用用的熱力力學(xué)與動動力學(xué) 1溶溶液中抗抗原抗體體的化學(xué)學(xué)平衡 抗體與與抗原的的結(jié)合是是非共價價結(jié)合，二者在在結(jié)構(gòu)互互補(bǔ)適應(yīng)應(yīng)的基礎(chǔ)礎(chǔ)上通過過范德華華

47、力(vvan derr Waaalss foorcee)、靜靜電引力力、氫鍵鍵和疏水水作用等等次級鍵鍵相互作作用。因因為結(jié)合合是可逆逆的，結(jié)結(jié)合與解解離的強(qiáng)強(qiáng)度在定條件件下取決決于抗原原與抗體體的親和和力。如如果以SS代表抗抗體結(jié)合合位，即即互補(bǔ)位位(paarattopee)；以以L代表表抗原決決定簇；以SLL代表抗抗原與抗抗體的復(fù)復(fù)合物，則抗原原(Agg)與抗抗體(AAb)在在溶液中中的反應(yīng)應(yīng)如下： KK+ K+AgAAb AAgAbb 即SSL SSL KK KKSL/SSLLKK+/ KK 抗原抗體體結(jié)合形形成的復(fù)復(fù)合物的的濃度為為SLL，游游離的抗抗體結(jié)合合位的濃濃度為S，抗原決決定簇

48、的的濃度為為L。在反反應(yīng)早期期復(fù)合物物形成很很快，一一定時間間后逐漸漸慢下來來，直至至復(fù)合物物的形成成與解離離達(dá)到平平衡(圖圖76)。此時抗抗原抗體體復(fù)合物物的濃度度SLL與游游離抗原原表位的的濃度S和和游離抗抗體結(jié)合合位的濃濃度LL之比比K是平衡衡常數(shù)，又稱為為內(nèi)在結(jié)結(jié)合常數(shù)數(shù)，或稱稱內(nèi)在親親和力(inttrinnsicc afffinnityy)。KK+和K分別為為結(jié)合和和解離反反應(yīng)速度度常數(shù)。 在恒定定的條件件下，如如溫度、pH、離子強(qiáng)強(qiáng)度等一一定時，K是一個個常數(shù)。改變抗抗原或抗抗體的濃度度，復(fù)合合物的濃濃度也相相應(yīng)改變變以達(dá)到到新的平平衡，在在一定范范圍內(nèi)如如果SS與L增增加2倍倍，

49、則SL應(yīng)該增增加4倍倍，但實實際上會會少于44倍，因因為AggAb復(fù)復(fù)合物的的濃度SL是抗原原抗體的的一部分分。如果果上述濃濃度都以以摩爾濃濃度moolLL表示，則是KK的單位位為濃度度的倒數(shù)數(shù)(Lmoll)。如如抗體的的K在100710122 Lmool為高高親和力力抗體，K低于1007 Lmool為低低親和力力抗體。 如果以以解離常常數(shù)(KK)描述述抗體的的親和力力，比KK更簡單單方便，Kd為為K的倒數(shù)數(shù)，即KKd11/K，單位位為mool/LL。Kd值越越大親和和力越小小，Kdd越小親親和力越越大。 2抗抗原抗體體反應(yīng)的的自由能能變化 抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)的自由由能改變變與K相關(guān)：F0RTl

50、nn K，KeF/RT，這里RR摩爾爾氣體常常數(shù)88.311J(mollK)；T絕對溫溫度；lln自自然對數(shù)數(shù)；e自然對對數(shù)的底底數(shù)；F0標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)的自由由能變化化，規(guī)定定F01mmolSS與1mmol L形成成1mool SSL時自自由能的的變化。負(fù)號表表示自由由能為負(fù)負(fù)的變化化。 從上式式可以估估計：當(dāng)當(dāng)抗原抗抗體結(jié)合合親和力力增加ll0倍，則1nn1023303，37(3l015KK)時的的F05.94KKJmmol，溫度低低于377時F0更小。這種自自由能變變化還不不足單個個氫鍵的的能量(約188811KJmoll的13。即即使親和和力非常常高，KK10100Lmool，F(xiàn)0只有55944

51、KJmoll，僅相相當(dāng)于33個氫鍵鍵的結(jié)合合能。當(dāng)當(dāng)抗原與與抗體間間形成氫氫鍵時，水的氫氫鍵被破破壞，因因此每個個氫鍵的的凈能接接近于44.188KJmoll。由此此可見抗抗體與抗抗原結(jié)合合時，吸吸力與斥斥力幾乎乎相等，即使在在很高親親和力下下，也只只有幾個個千卡的的微小差差別。因因而F的輕微微增加會會導(dǎo)致抗抗原抗體體結(jié)合的的親和力力增高，這就不不難理解解當(dāng)抗原原結(jié)構(gòu)發(fā)發(fā)生某些些微小改改變(如如化學(xué)修修飾)時時，會引引起抗原原抗體的的親和力力的很大大變化。自由能對對K的影響響取決于于溫度，然而自自由能本本身也受受溫度的的影響：F 00H0TS 00H0 為焓變變，S 00為熵變變，T為絕對對溫

52、度。K隨溫度度的變化化如下:dlnKK/dTT=H0 / RT2 或ddlnKK/d(1/TT)= H0 /R 當(dāng)氫鍵鍵和極性性鍵形成成時，較較大的負(fù)負(fù)焓變驅(qū)驅(qū)動放熱熱，親和和力會隨隨溫度的的增加而而下降。因此抗抗原抗體體相互作作用在44比在255或37有更高高的親和和力，可可見在給給定的濃濃度下，最大眼眼度的結(jié)結(jié)合在較較低溫度度下達(dá)到到的。相相反，非非極性或或者疏水水的相互互作用受受到熵的的影響，TS 00和H0接近于于零，所所以這時時溫度對對親和力力影響較較小。 3.抗抗原抗體體反應(yīng)的的動力學(xué)學(xué) 抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)達(dá)到平平衡時的的參數(shù)測測定在實實際操作作時是困困堆的。反應(yīng)完完成900，只只需

53、幾分分鐘或幾幾小時，而從990至至99則需幾幾倍的時時間，而而欲達(dá)到到999完完成時所所費時則則更長，因為此此時的Ag和AAb已已減少到到極低的的水平。測定一一些參數(shù)數(shù)在反應(yīng)應(yīng)的早期期或者未未到平衡衡時是可可行的，利用動動力學(xué)可可以計算算出抗原原抗體反反應(yīng)的特特征性參參數(shù)，用用以描述述抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)的規(guī)律律：K+ Ag（SS）AAb(LL) AAgAbb （SL）K結(jié)合反應(yīng)應(yīng)速度KSLM-1S-1 解離反反應(yīng)速度度=K-SLLS-1達(dá)到平衡衡時，則則K+SLK-SLLKKK+K-KKK+K-表明相相同親和和力的抗抗體，其其結(jié)合速速度常數(shù)數(shù)和解高高速率常常數(shù)并不不一致。如果K+和KK-均很大大

54、則抗原原抗體復(fù)復(fù)合物形形成很快快，但不不穩(wěn)定；而K+和K-均小時時抗原抗抗體復(fù)合合物形成較慢慢，但很很穩(wěn)定。前者適適合于親親和層析析，后者者適合于于標(biāo)記分分析。 抗原抗抗體結(jié)合合成復(fù)合合物后解解離的速速度常數(shù)數(shù)(K-)取決決于結(jié)合合鍵的強(qiáng)強(qiáng)度。已已知抗體體的親和和力和結(jié)合合速度常常數(shù)K+，根據(jù)據(jù)動力學(xué)學(xué)基本公公式KK+K-可以計計算解離離常速度度數(shù)K-。例如抗葡葡萄球菌菌核酸酶酶的抗體體對酶蛋蛋白抗原原的親和和力是88.3l08Lmool，結(jié)結(jié)合速度度常數(shù)KK+41l05 L(molls)，比對半半抗原的的結(jié)合常常數(shù)低。由公式式KK+K-計算得得到K-4.910-44 L(molls)。然后根

55、根據(jù)公式式t1/221nn2KK-，計算算半解離離期(hhalfftiime forr diissoociaatioon)，得到該該抗體與與抗原復(fù)復(fù)合物的的半解離離期為223miin。了了解抗原原抗體復(fù)復(fù)合物的的半解離離期便可可知道結(jié)結(jié)合物在在多大的的時間范范圍內(nèi)稀稀釋而不不影響結(jié)結(jié)合物的的解離，這對在在免疫親親和層析析等許多多其他免免疫方法法的應(yīng)用用中有重重要意義義。 抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)的速度度在很大大程度上上取決于于抗原分分子和抗抗體分子子的擴(kuò)散散速率及及碰撞的的機(jī)率。擴(kuò)散散速度常常數(shù)用下下式表示示： Kddl44D(610200) 為抗原原和抗體體分子半半經(jīng)之和和(單位位為cmm)；DD為

56、反應(yīng)應(yīng)系統(tǒng)中中抗原和和抗體分分子的擴(kuò)擴(kuò)散常數(shù)數(shù)之和(單單位為ccm2s)；610200為轉(zhuǎn)換換函數(shù)，為了把把單位轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換為LL(mmols)。例如100-6cmm，D107cm2s，Kdll=7.5108L(mmols)。通常大大的蛋白白抗原比比半抗原原與抗體體結(jié)合的的速率要要慢，大大部分蛋蛋白質(zhì)的的結(jié)合速速度在1105106L(mmols)，而理論論上限為為109 L(molls)。 二、抗抗體與單單價抗原原的作用用 1抗抗體親和和力的測測定 抗體親親和力的的測定的的方法常常采用作作圖法?？乖箍贵w反應(yīng)應(yīng)最簡單單的情況況是單克克隆抗體體與單價抗原的的反應(yīng)，如半抗抗原與單單克隆抗抗體或單單克隆抗

57、抗體與大大分子抗抗原上單單一的非非重復(fù)的的位點(抗原決決定簇)的作用用。以最最簡單的的單克隆隆抗體與與半抗原原反應(yīng)為為例的作作圖法，首先用用平衡透透析(equuiliibriium diaalyssis)(圖777A)來來測定系列游游離抗原原及結(jié)合合抗原的的濃度。根據(jù)不不向抗原原濃度進(jìn)行平平衡透析析所獲得得的結(jié)合合抗原，游離抗抗原?？箍贵w濃度度是已知知的。根根據(jù)這些些數(shù)據(jù)，進(jìn)行Scattchaard分分析，即即可計算算出Kaa的值(圖77B)。 Scaatchhartt分析方方法是將將KaSLL/SL分分子和分分母都除除以抗體體的濃度度，SSL/Ahh=rr,r代表每個個抗體分分子結(jié)合合的抗原

58、原(單價價)分子子數(shù)SSLL/Ab=SS/Ab.LL(nr)CC，SS/Ab;表示示每個抗抗體分子子上未被被抗原占占有的游游離抗體體結(jié)合位位的濃度度。這濃度實實際上是是抗體分分子上等等于全部部抗體結(jié)結(jié)合位(n)減減去以被被抗原占占據(jù)了的的結(jié)合位位數(shù)。因因為用的的是單價價抗原，因此也也就是減減去結(jié)合合的抗原原分子數(shù)數(shù)r，即即(nr)。這里的的n實際際上代表表抗體的的價數(shù)。C在這這里代表表抗原的的濃度L。由此得得到公式式：當(dāng)固定抗抗體的濃濃度用不不同濃度度的抗原原進(jìn)行一一系列的的平衡透透析實驗驗，得到到一系列列相應(yīng)的的r數(shù)據(jù)據(jù)，然后后根據(jù)以以r/CC對r作作圖。如如果所用用抗體是是均質(zhì)的的（單克克

59、隆抗體體），rr/C與與r的關(guān)關(guān)系為線線性關(guān)系系，它的的斜率即即為親和和力Kaa（圖777BB）。從從公式可可見，當(dāng)當(dāng)抗原的的濃度很很大的rr/C0，所以Kaa（nr）0或KKan=KKar,由由圖77B可可見橫坐坐標(biāo)r的的截距就就等于抗抗體價nn。2親和和力的異異質(zhì)性 當(dāng)與單單價抗原原結(jié)合的的抗體是是多克隆隆抗體時時，其SScattchaard圖圖呈非線線性關(guān)系系(圖777B)。由于多克隆隆抗體來來源于多多個細(xì)胞胞克隆，其內(nèi)在在親和力力不同。內(nèi)在親親和力的的平均值值Ko常常用于表表示異質(zhì)的的多克隆隆抗體的的親和力力，Koo為抗體體結(jié)合位位點12被占占據(jù)時的的游離抗抗原濃度度。 3抗抗體結(jié)合合

60、抗原的的特異性性半抗抗原反應(yīng)應(yīng)抗體與單單價半抗抗原反應(yīng)應(yīng)的特異異性極強(qiáng)強(qiáng)，半抗抗原上化化學(xué)基團(tuán)團(tuán)的細(xì)小小差別或或位置的的改變，則與抗抗體的反反應(yīng)性會會表現(xiàn)明明顯的差差別(圖圖78)?？贵w與與同源抗抗原(hhomoologgouss anntiggen)反應(yīng)最最強(qiáng)，與與異源抗抗原(hheteerollogoous anttigeen)反反應(yīng)相對對較弱。有些抗抗體與異異源抗原原的反應(yīng)應(yīng)比同源源強(qiáng)，稱稱為變態(tài)態(tài)抗體(hetteroocliiticc anntibbodyy)。抗抗原分子子表面或或末端的的一些突突出的基基團(tuán)，具具有免疫疫優(yōu)勢，是抗原原決定簇簇的主要要結(jié)構(gòu)，影響決決定簇的的特異性性?？贵w