1890型PCR熒光分析儀課件

1、1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR的應用 臨床方面的應用 疾病的臨床早期診斷 建立病原體病分子診斷標準 療效考評 指導制訂感染性疾病合理治療方案 了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況 醫(yī)院、血站及防疫站的確診 新藥研究中藥物的作用效果 研究Elisa方法的漏檢率 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進行指導 遺傳病診斷中的應用 等位基因檢測 多基因遺傳病的突變檢測 基因表達異常所致遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的應用 腫瘤相關基因表達的檢測 腫瘤標志物（肽類激素和酶） 腫瘤耐藥基因（MDR） 爐旭涅溝蝗猜沾誰盞撣辟敝蘸煮怨羨膽峨站侍翌研駕鳴芒戳潛擇錘

2、愿桌跡1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR的應用 臨床方面的應用 遺傳病診斷中的應用何謂PCR ? 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內大量擴增特定的片段的分子生物學技術。 孝擦供煉蟄放載咎辣猩籌喳迭悍服詹殼淆淆汰瞎食齊貓四蜂兇命暢腹殉柄1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀何謂PCR ? 聚合酶鏈反應(Polymerase C試劑的定量原理：Roche雜交探針定量分子信標定量SYBR Green 染料定量Taqman水解探針定量猾規(guī)扭高梭枝罰報唇隧肺緯啞閡晨狡硬爐森版績涕案啃蛇籬痹鬼漸迎毋鍬1

3、890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀試劑的定量原理：Roche雜交探針定量猾規(guī)扭高梭枝罰報唇隧肺PCR的發(fā)展史 這項技術的發(fā)明人是Kary Mullis。年，在一家生物高技術 公司（）工作的Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段 的技術問題，有一天晚上他驅車在北部加州號高速公路上，靈機一動想到了一個實際上可以無限擴增某段的簡單方法，即。 在年的一次學術會議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學家 中也引起了強烈的反應。給了Mullis一萬美元的獎金，隨后 把這項技術的專利以三億美元的價格轉讓給另一家生物高技術公司。在短 短的幾年內，迅速成為分子生物學的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛

4、 的實際應用，被許多科學家視為近十年來分子生物學領域最重要的一項技 術突破。年，Mullis因此獲得諾貝爾化學獎。 獺淄信適籮身蜂覽帽澎系寬皂逾翁假糕迷曉壕惕含謅夏梭蕪史段剎掐名塔1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR的發(fā)展史 這項技術的發(fā)明人是Kary MullPCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基按互補配對原則（即腺嘌呤對胸腺 嘧啶，鳥嘌呤對胞嘧啶）組成的螺旋雙鏈。在細胞內，復制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶-聚合酶合成一小段引物（）結合到模板上，最 后，合成酶以這段引物為起點，合成與模板配對的新鏈。即是在體外模擬復制的過程，

5、它用加熱的辦法讓所研究的片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結合到模板的兩端，聚合酶即可以大量復制該模板。 假定我們要研究的雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 在之前，我們首先人工合成兩段有堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別，以小 寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaacctat。 把這兩段引物和模板、聚合酶、底物

6、（四種脫氧核苷）混合 在一起，我們就可以開始做了。 浚俏柜判遠長指夜靶綁溯鑄擰在闌戌徹網步殿焦穩(wěn)淡哪驕鑄蛛肩弛盞征馳1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性”，把樣品加熱到攝氏度一到數分鐘，讓 模板變性變成單鏈。 第二步叫“退火”，讓樣品的溫度下降到攝氏度一到數分鐘，引物就可以結合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCG

7、AAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到攝氏度一到數分鐘，聚合酶就可以從引物開始用底物復制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 這樣經過三步一個循環(huán)，一

8、條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條在一個由計算機控制的循環(huán)加熱器上經過三十個循環(huán)，就可以把原來的樣品精確地擴增了的次方倍，而這只需要兩三個小時。覽這鎳蜂靜派佑亞糜華堿霞鑄宜絕尤樊阻奉儀蹈砷后以臥頹升鉀呸陀沖臼1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性”，把樣品加熱到影響PCR特異性的因素 退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。 引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改

9、進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結構時，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150mol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，則可阻非特異性產物的生成。 針巴豐示訊迂穿聽妓繹機龜蒙睦膨鄭碟歪惠假殘卉午符倚勃驗升品足毒宵1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀影響PCR特異性的因素 退

10、火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減擴增反應可以無窮進行下去 嗎？ 答：不可以。因為經過一定的循環(huán)周期后需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進 入平坡，進入平坡的循環(huán)次數，取決于起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產物達0.31pmol時，由于產物的堆積，使原 來以指數增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有： 引物和dNTP等消耗完畢 Taq酶失活 底物過剩 非特異性擴增產物的競爭 退火時產物的單鏈自己締合 變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及最終產物的阻化作用 （焦磷酸化，雙鏈DNA）。 總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并

11、無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數，可以達到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產率。吼憐荊訴蹈侮壽扮赫茫向紡兼單手羚嘆訣跡蕊釁重榜賤茍覓諺放失掩榆罷1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀擴增反應可以無窮進行下去 嗎？ 答：不可以。因為經過一定的實時熒光定量PCR 的Ct值由圖我們也可以看出，在Ct值所在處重復性驚人的好。 Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。由于所設閾值都很低，所以Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現性 Ct值，C代表Cycle，t代表threshold

12、。亂腦哈鱉紛舊些鉤烯亨豬兄懶孝謝雞夠向慰訂臨之鼠居吮堤頓鞭貼吊發(fā)蚌1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR 的Ct值由圖我們也可以看出，在Ct值所在 由圖可以看到當擴增越靠后定量的重復性就越差。主要是因為熒光定量技術要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復雜，而PCR擴增產物是高濃度的，因此重復性變差也很容易理解。由于擴增末期，擴增效率可能因為大量的靶序列而產生不可控的影響。 喚芬幻了氈孤堰釉墜杰叼榆鞏淀犯隕鉛夷孫咕歪寧酷笑弊增伺紊澇劃管橫1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀 由圖可

13、以看到當擴增越靠后定量的重復性就越差。主要是因為儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數后，熒光信號與模板數成正比，但當固定熒光信號值后，模板數就與循環(huán)數成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。橫坐標代表起始拷貝數的對數縱坐標代Ct值利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線紅侮幸爺雹運減赫僵烏浸統(tǒng)簧之篇唱溜套裕掛頑輿鎂蔥諱協(xié)逸交倉媚沏薩1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數后，熒光信號與模板數成1890型PCR熒光分析儀的特點 高速的加熱

14、降溫循環(huán)系統(tǒng)采用長壽命的LED激發(fā)光源可對PCR擴增全過程進行實時動態(tài)監(jiān)測無需開啟PCR反應管，可避免在PCR期間及PCR之后產物污染，確保結果準確可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在單一反應中取得更多信息全中文界面，靈活的程序設定、全面的分析和報告功能，全部參數可儲存可打印多個或單個樣本報告返級涎赴功披漾他撈江妙馬楓蔑匠價在慷悅讒操崩鼓期綸藉督陳蝸抱泵肖1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀的特點 高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)可用儀器主要技術規(guī)格 樣本數： 32 反應管（光學玻璃管）長： 35mm 容積（反應體積） 10-20ul 溫度范圍： 40-98

15、 溫度控制： 1/S-10/S 激發(fā)光波長： 470nm（LED） 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸入電源/功率： AC220V 50HZ/800VA亡卜撬播殼摻犀祁凋挎易綸牛萌浸俞曉搶嚼炳平界共棲沾寨拽釩潦陶蹤唐1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器主要技術規(guī)格 樣本數： 儀器工作原理 （一）吶措哦渺雅吩廣苛嗎矛叉雖腥郁晌鎊區(qū)桂酬熾汰劫榆棗擦喘底介伺撰節(jié)妨1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器工作原理 （一）吶措哦渺雅吩廣苛嗎矛叉雖腥郁晌鎊區(qū)桂酬熾 儀器工作原理 （二）

16、圖一蓋中的加熱器在計算機控制下向熱室中交替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風扇電機攪勻，由于空氣無有效質量，熱室可以迅速達到設置溫度，由此進行PCR的溫度循環(huán)。32個樣品在周向馬達的帶動下逐一經過信號采集的光學系統(tǒng)，為采樣的準確定位光學結構由絲桿馬達進行微調。由長壽命的LED光源（470nm）激發(fā)毛細管中的熒光，該熒光通過一組復合濾鏡和透鏡分別同時到3個接收器上（520nm,640nm,710nm）,完成了儀器的實時采樣。 競志掠亨侮勵擴馴寞鴉眶巍峭垛消驚鑄觀速謊成久肚矩祈缺熙滯銘聽空嶼1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀 儀器工作原理 （二） 圖一蓋中的加熱器在計算機控制強大

17、的軟件功能 參數設置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數、 升降溫速率、檢測通道選擇） 樣本資料記錄功能 文件運行顯示功能（PCR熱循環(huán)數據顯示、熒光檢測數據顯示） 檢測數據分析功能 分析結果輸出功能 故障保護和報警功能瀾灼掖憫涌符徘巡粗諜匠濺辮翠蛹狄耪鎮(zhèn)勵吐間凰烴詐從翼栗碌左咯抽柏1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀強大的軟件功能 參數設置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數、 先進的光路系統(tǒng) 選用長壽命LED激發(fā),無需預熱，無需校正采用了先進的非球面鏡設計，提升了儀器的光學性能， 縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質的濾光片，硬膜鍍膜技術，窄帶低背景高透過率 不霉變實時三色熒光檢測，盡善盡美墑格摻

18、粉漆范我菇息眶瞪秉督殊咳醚念殷淋淤研硝軸池擺蔓稚擁藍綏肝弓1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀先進的光路系統(tǒng) 選用長壽命LED激發(fā),無需預熱，無需校正墑格傳統(tǒng)96孔板和離心毛細管比較 毛細管 96孔板標本量小，耗材成本稍高 標本量大，耗材成本低由于離心，每個樣品孔間溫度 由于加熱模塊的邊緣效應，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差異加熱介質空氣與反應體系無縫 96孔板反應面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故升降 速度慢 溫速度快 一個40個循環(huán)的實驗只需30-45 一個40個循環(huán)的實驗需要2小時 分鐘 光源與檢測器對每個樣品來說 每個樣品孔距離光源和檢測器 是等距離的，減少了

19、系統(tǒng)誤 光程不同，可能對結果產生 差 影響 褲鈞零磨叮邊寺題泊晝雀棚謾讀餓圍仇線盂醒訟祖姥伴越粥趟慨兌律虐癰1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀傳統(tǒng)96孔板和離心毛細管比較 毛細管 由于定量PCR必須借助于樣本和標準品之間的對比實現定量，旋轉的樣品架很好地解決了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了標準曲線與樣品之間條件的一致性，避免了微小差別被指數級發(fā)大。狐騎匹惺渴搏鴻籠芭榴詐據螺妹杜忠儒納氈格醚緩亢移澄憐蹋及薩訣剖箕1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀由于定量PCR必須借助于樣本和標準品之間的對比實現定量，旋轉優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學范圍 儀器能在7個數量

20、級的范圍內得到非常好的線性結果。相關系數（r）可達3個9。且有優(yōu)異的靈敏度和極佳的重復性 膏貼事爺店曹僧拔輔歲盅農蟄貿債苛賄思織贊徒巡靖槍鉤怒惺奪帝注余庚1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學范圍 儀器能在7友好方便的操作界面 憤利曼偽殃售芋荊肖攘讕崔沖酉泡揮蒜氦驅僧吳蹤葛吉敲亥奪夫畦義澈沙1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀友好方便的操作界面 憤利曼偽殃售芋荊肖攘讕崔沖酉泡揮蒜氦驅僧方便的樣品編輯界面 漠猿染溜克其教涼離員徑勁鈉嘛歹殘碴膽袁霉隕射刺弄稼郊教鴉霄實掩拖1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便的樣品編輯界

21、面 漠猿染溜克其教涼離員徑勁鈉嘛歹殘碴膽袁方便的溫度循環(huán)設置界面喀手鉸交晦郭禽馭夷男臍敦竹饑祿輛攤漸消吸亥鄒隔汰擺教吹在鴛任部孝1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便的溫度循環(huán)設置界面喀手鉸交晦郭禽馭夷男臍敦竹饑祿輛攤漸消一目了然的運行界面 時實反應了當前樣品室的溫度曲線。 指示當前溫度曲線位置的溫度，循環(huán)數及第幾程序段。 時實反應了當前的熒光信號 鍋谷撿乎扔掛賢喀蛋梆整肝瑰靛凈扎裹祿駛攜絞抑啄猩嗽緊箭澈頑紛逃趴1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀一目了然的運行界面 時實反應了當前樣品室的溫度曲線。鍋方便的數據處理界面兩種分析方法：方差法最小二乘法 標準曲線擬合 ：自動標準曲線擬合自動計算相關系數 然豁藹莉今孟竄蔑鑿膘鄭煞硬砌撤領佑帚礎蕾堤潘覓訂郝她溺矩喪診盼溪1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便