生物化學(xué)課件之蛋白質(zhì)課件

1、生物化學(xué)第四章 蛋白質(zhì)化學(xué)學(xué)習(xí)要點(diǎn)1、了解蛋白質(zhì)的元素組成、分類和功能，掌握蛋白質(zhì)常見氨基酸的種類、名稱、符號(hào)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，了解氨基酸準(zhǔn)備方法、掌握分離分析鑒定的技術(shù)原理。2、重點(diǎn)掌握蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)、膠體性質(zhì)、兩性性質(zhì)、沉淀和復(fù)性。3、難點(diǎn)是蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、掌握一級(jí)結(jié)構(gòu)分析測(cè)定的方法，肽平面的概念，二、三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)，了解四級(jí)結(jié)構(gòu)的基本概念。4、了解蛋白質(zhì)分離、純化的方法，掌握蛋白質(zhì)分離分析鑒定的技術(shù)原理。第一節(jié) 概述一、蛋白質(zhì)的概念1、重要性蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)是生物 體重要組成成分器官與組織蛋白質(zhì)含量（）器官與組織蛋白質(zhì)含量（）皮膚63心臟60骨骼28肝57腦、

2、神經(jīng)45肺62消化道63腎72體液組織85脾84胰47蛋白質(zhì)是一切生物體中普遍存在的，由許多氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物，其種類繁多，各具有一定的相對(duì)分子質(zhì)量，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能；是表達(dá)生物遺傳形狀的一類主要物質(zhì)。蛋白質(zhì)是由20種左右的氨基酸通過肽鍵相互連接而成的一類具有特定的空間構(gòu)象的生物學(xué)活性的高分子有機(jī)化合物，它廣泛存在于生物界；是塑造一切組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)必不可少的組成成分，是生命的支柱。2、元素組成蛋白質(zhì)是含氮元素恒定的生命物質(zhì)蛋白質(zhì)的元素組成：C、H、O、N（16）、(S)、(P、Cu、Mn、Mo、Co、Zn、Mg、Ca)100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g %

3、)= 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100二、蛋白質(zhì)的分類1、依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類 球狀蛋白質(zhì) 纖維狀蛋白質(zhì)2、依據(jù)蛋白質(zhì)分子的化學(xué)組成： 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì) 結(jié)合蛋白質(zhì)再分別根據(jù)溶解性質(zhì)和輔基成分分為若干小類。結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)部分非蛋白質(zhì)部分 （輔基）類 別特點(diǎn)及分布舉例簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)清蛋白溶于水，需飽和硫酸銨才能沉淀。廣泛分布于一切生物體中血清清蛋白、乳清蛋白球蛋白微溶于水，溶于稀鹽溶液，需半飽和硫酸銨沉淀。分布普遍血清球蛋白、肌球蛋白、大豆球蛋白等谷蛋白不溶于水、醇及中性鹽溶液，易溶于稀酸或稀堿。各種谷物中米谷蛋白、麥谷蛋白醇溶谷蛋白不溶于水，溶于7080乙醇中玉米蛋白精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，是

4、堿性蛋白，含His.Arg多蛙精蛋白組蛋白溶于水及稀酸，能溶于氨水，堿性蛋白，含His.Lys多小牛胸腺組蛋白硬蛋白不溶于水、鹽、稀酸或稀堿溶液。分布于動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織，毛、發(fā)、蹄、角等角蛋白、膠原、彈性蛋白、絲心蛋白等結(jié)合蛋白質(zhì)核蛋白輔基是核酸。存在于一切細(xì)胞中核糖體、脫氧核糖核蛋白體脂蛋白與脂類結(jié)合而成。廣泛分布于一切細(xì)胞中卵黃蛋白、血清-脂蛋白糖蛋白與糖類結(jié)合而成粘蛋白、-球蛋白、膜蛋白等磷蛋白以絲蘇殘基的-OH與磷酸成酯鍵結(jié)合而成。乳、蛋等生物材料中酪蛋白、卵黃蛋白血紅素蛋白輔基為血紅素。存在于一切生物體中血紅蛋白、細(xì)胞色素等黃蛋白輔基為FAD或FMN。存在于一切生物體中琥珀酸脫氫酶、

5、D-氨基酸氧化酶等金屬蛋白與金屬元素直接結(jié)合鐵蛋白、乙醇脫氫酶(含鋅)、黃嘌呤氧化酶(含鉬、鐵)一、氨基酸的結(jié)構(gòu)性質(zhì)1、結(jié)構(gòu)通式或結(jié)構(gòu)通式除pro外，均為-氨基酸；具有光學(xué)異構(gòu)體（Gly除外），為L(zhǎng)氨基酸。 2、常見氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。二、氨基酸的分類（1）根據(jù)酸堿性質(zhì)酸性氨基酸：Glu、Asp；堿性氨基酸：Arg、Lys、His；（Arg：胍基；His：咪唑基）中性氨基酸：15種?！颈匦璋被帷浚喝耍?種：異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨蘇、色氨酸、擷氨酸、蛋氨酸 （Ile、Leu、Lys、Ph

6、e、Thy、Val、蛋氨酸）必需氨基酸缺乏癥：尿頻、水腫、貧血、腹脹、肌肉萎縮、肝萎縮等。三、氨基酸的性質(zhì)氨基酸的一般物理性質(zhì) 常見氨基酸均為無色結(jié)晶,其形狀因構(gòu)型而異。溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)極高，一般在200以上。味感：其味隨不同氨基酸有所不同。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，1、兩性性質(zhì)（1）氨基酸的兼性離子（偶極離子）形式氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)主要時(shí)以兩性離子的形式存在。 氨基酸在水中的兩性離子既能像酸一樣放出質(zhì)子，也能像堿一樣接受質(zhì)子，氨基酸具有酸

7、堿性質(zhì)，是一類兩性電解質(zhì)。As an acid（proton donor）：As a base（proton acceptor）： 由曲線求K1和K2：曲線A，在pH值2.34處有一拐點(diǎn)，即R=Ro ， pK2=2.34。 曲線B，在pH值9.6處有一拐點(diǎn)。即Ro=R-時(shí)，則pK2= 9.6。 曲線上任一點(diǎn)的pH值 等電點(diǎn)H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97GlyK1=Gly H+Gly+K2=Gly- H+GlypI時(shí)，Gly+ = Gly- Gly H+K1=Gly K2H+ 在等電點(diǎn)以上的任何pH，氨基酸帶凈

8、負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)；結(jié)論： 在低于等電點(diǎn)的任何pH，氨基酸帶凈正電荷，在電場(chǎng)中將向負(fù)極移動(dòng)。 在一定pH范圍內(nèi)，氨基酸溶液的pH離等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，氨基酸所攜帶的凈電荷愈大。各種氨基酸都具有特定的等電點(diǎn)：酸性氨基酸：酸性范圍中性氨基酸：pI7，6堿性氨基酸：堿性范圍2、紫外吸收在近紫外區(qū)(220-300nm)只有Phe 、 Tyr和Trp有吸收光的能力。Phe的max257nm， Tyr的max275nm，Trp的max280nm，色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法

9、。3、化學(xué)性質(zhì)（1）氨基的反應(yīng)：與甲醛的反應(yīng) 甲醛滴定法在中性pH值條件下，甲醛與氨基酸反應(yīng)，再用酚酞作指示劑，用NaOH滴定 不僅用于測(cè)定氨基酸含量，也常用來測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度。與2、4一二硝基氟苯的反應(yīng) DNFBDNP-氨基酸（黃色）脫氨基反應(yīng) 藍(lán)紫色化合物在570nm下有最大的吸收率，氨基酸含量與光密度成正比。成肽反應(yīng) * 肽鍵(peptide bond)是由一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽* 肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(re

10、sidue)。* 由十個(gè)以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。（4）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)：巰基及二硫鍵 半胱氨酸 胱氨酸二硫鍵-HH+R-SH：HS-CH2CH2OH 巰基乙醇（mercaptoethanol） HS-CH2COOH 巰基乙酸（mercaptoacetic acid） HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT） 特殊側(cè)鏈基團(tuán)參與的反應(yīng)第三節(jié) 肽一、肽的概念1、結(jié)構(gòu)肽：氨基酸通過肽鍵連接形成的鏈狀化合物稱為肽。肽鍵：由一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基

11、縮合失水而形成的酰胺鍵。 多肽與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到1000000甚至更大。幾個(gè)相關(guān)的概念通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。N端氨基酸殘基氨基酸殘基C端肽鏈書寫方式：N端C端 注：肽鏈可以是鏈狀、環(huán)狀或分支狀。 肽鏈的N-端與C-端：氨基酸順序：在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序，氨基酸的順序是從N-端

12、的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。上述五肽可簡(jiǎn)寫表示為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu 肽鏈的表示法上述五肽可命名為：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 肽鍵的特點(diǎn)肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。 肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。組成肽鍵的原子處于同一平面。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。肽的理化性質(zhì) 兩性解離與等電點(diǎn) 由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。pK1，pK2。R基的pK變化不大。 肽的等電點(diǎn)：肽所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值。 (2) 肽的化學(xué)性質(zhì) 肽的化學(xué)性質(zhì)與

13、氨基酸相似，如兩性解離、等電點(diǎn)等，但肽有與氨基酸不同的特殊反應(yīng) 二、 生物活性肽二、生物活性肽具有特殊的生理功能的多肽活性肽。如：神經(jīng)肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)為了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)敘述的方便，人為地將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)又稱初級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的三度空間排列稱蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。 一、蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)（primary structure） 1一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念（1）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序（sequence）。 （2）維持一級(jí)結(jié)構(gòu)的化

14、學(xué)鍵：肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。 （3）氨基酸順序書寫時(shí)，從 N-末端(N-terminus) 至 C-末端 (C-terminus).N-末端分析C-末端分析(1)肽鏈氨基酸末端分析目的：測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。末端AA的摩爾數(shù)與M之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法 N-末端分析二硝基氟苯法（FDNB法）二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）苯異硫腈法（Edman法）節(jié)首return氨肽酶法二硝基氟苯法（DNFB法）1945年由Sanger發(fā)明此法節(jié)首returnDNFB 肽鏈 (n) DNP-肽鏈(n) （H+） DNP-氨基酸 氨基

15、酸（n-1）苯異硫腈法（Edman法）節(jié)首returnPITC苯異硫腈，PTC苯氨基硫甲酰，PIH苯乙內(nèi)酰硫脲 PITC 肽鏈 (n) PTC-肽鏈(n) （H+） PIH-氨基酸 肽鏈（n-1）（繼續(xù)進(jìn)行）二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）靈敏度較高（比DNFB法提高100倍）此法優(yōu)點(diǎn)節(jié)首returnDNS-Cl 肽鏈 (n) DNS-肽鏈(n) DNS-氨基酸 氨基酸（n-1）氨肽酶多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解，外切酶氨肽酶法 SerTyrGly C-末端分析肼解法羧肽酶法節(jié)首return肼解法節(jié)首return肽鏈肼 （n-1）酰肼化合物C-末端氨基酸羧肽酶法多肽鏈的C-端逐個(gè)的向里水

16、解，外切酶主要方法根據(jù)氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線，可確定該肽鏈的C端氨基酸順序。節(jié)首return肽鏈間的結(jié)合非共價(jià)鍵血紅蛋白（四聚體）共價(jià)鍵結(jié)合胰島素（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離 節(jié)首非共價(jià)鍵連接的多肽鏈溫和條件下可以解離通過二硫鍵連接的多肽鏈需要較強(qiáng)的條件將二硫鍵切斷還原法氧化法蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離節(jié)首還原法將二硫鍵還原成巰基節(jié)首為防止巰基重新氧化，可用碘乙酸、碘乙酰胺等使其烷化節(jié)首return氧化法二硫鍵用過甲酸氧化為磺酸基而拆開節(jié)首return（3）氨基酸組成分析節(jié)首測(cè)定每條多肽鏈的AA組成，并計(jì)算出AA成分的分子數(shù)；酸水解、堿水解a)酸水解6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫酸,105

17、-110水解20小時(shí)。b)堿水解5 mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)?；瘜W(xué)裂解法酶水解法溴化氰法部分酸水解 （4）肽鏈的部分降解及肽段的分離節(jié)首溴化氰法Br-CN只斷裂由甲硫氨酸殘基的羧基參加形成的肽鍵 部分酸水解限時(shí)、限濃：稀酸：門冬氨酸羧肽鍵濃酸：羥基氨基酸氨肽鍵酶水解法常用的酶有:胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶等優(yōu)越性:較高專一性 水解產(chǎn)率較高（5）肽段的氨基酸順序測(cè)定節(jié)首主要方法：Edman降解法、酶解法等Edman降解（苯異硫腈法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。改進(jìn)Edman降解法：熒光

18、基團(tuán)或有色基團(tuán)標(biāo)記PITC，提高測(cè)定靈敏度氨基酸順序自動(dòng)分析儀：全部操作程序自動(dòng)化，一次可測(cè)60-80個(gè)氨基酸殘基。（6）肽段在多肽鏈中次序的推斷：肽段重疊法例如：所得資料：氨基末端殘基：H羧基末端殘基：S第一套肽段：QGS PS EQVE RLA HQWT第二套肽段：SEQ WTQG VERL APS HQ 末端肽段的確定：HQWT 和APS借助兩套肽段的順序重疊關(guān)系排出銜接次序：第一套肽段：HQWT QGS EQVE RLA PS第二套肽段：HQ WTQG SEQ VERL APS所以多肽鏈的順序：HQWTQGSEQVERLAPS（7）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 節(jié)首 將含二硫鍵的肽段進(jìn)行

19、酶解，分離出含二硫鍵的肽，對(duì)該肽進(jìn)行氧化或還原，切斷二硫鍵，生成二個(gè)小肽段，將這兩個(gè)小肽段與原肽鏈氨基酸順序進(jìn)行比較，即可確定二硫鍵位置。一級(jí)結(jié)構(gòu)舉例： 牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)由A（21個(gè)AA，11種），B（30AA，16種）組成，并通過Cys連結(jié)兩對(duì)-S-S-；二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 天然的蛋白質(zhì)分子并不是一條走向隨機(jī)的松散肽鏈，每一種都具有自己特定的空間結(jié)構(gòu)。線性的多肽鏈在空間中折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，這種空間結(jié)構(gòu)通常稱為蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)或分子構(gòu)象。1、概念（1）含義二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。多肽鏈并不是簡(jiǎn)單的線型，而是按照一定方式規(guī)則地旋轉(zhuǎn)或折疊。三級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子處于它的天然折

20、疊狀態(tài)的三維構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤繞、折疊。四級(jí)結(jié)構(gòu)：多亞基蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，實(shí)際上是具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈（亞基 ）以適當(dāng)方式聚合所呈現(xiàn)出的三維結(jié)構(gòu)。（2）維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵有氫鍵疏水鍵范德華力鹽鍵二硫鍵（3）蛋白質(zhì)中肽鏈的空間結(jié)構(gòu)原則 肽鍵有部分雙鍵的性質(zhì)，不能沿C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)；肽平面（酰胺平面）是剛性平面，肽平面的鍵長(zhǎng)和鍵長(zhǎng)一定。 肽平面之間可以旋轉(zhuǎn) 肽單位參與肽鍵的6個(gè)原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個(gè)原子構(gòu)成了所謂的肽單位 (peptide u

21、nit) 。2、二級(jí)結(jié)構(gòu)概念：二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)象 ：-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等(1) -螺旋 1950年美國(guó)Pauling等人在研究纖維狀蛋白質(zhì)時(shí)，提出了-螺旋，后來發(fā)現(xiàn)在球狀蛋白質(zhì)分子中也存在-螺旋。 3.613:13表示氫鍵封閉的環(huán)共包含13（33+4）個(gè)原子，3.6表示每圈螺旋含3.6個(gè)殘基，高度為0.54nm。每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，沿軸旋轉(zhuǎn)100。 維系螺旋的作用力是氫鍵：氫鍵是由肽鏈上的N-H（亞氨基）氫和它前面（N端）第四個(gè)殘基上的C=O氧之間形成，氫鍵與螺旋軸幾乎平行。 -螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)如下： R基在螺旋外側(cè)天然蛋白質(zhì)絕大部分是右手螺旋。 影響螺旋形成和穩(wěn)定

22、的因素 氨基酸的組成、電荷性質(zhì)和排列順序：在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸， -螺旋就不穩(wěn)定。在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro， -螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個(gè)彎曲或結(jié)節(jié)。 R側(cè)鏈的大小：Gly的R基太小，難以形成 -螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。 肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成 -螺旋。(2) -折疊、0.35nm。、肽鏈呈鋸齒狀，肽平面呈片裝。、氫鍵是維持折疊的作用力。肽鏈之間或一條肽鏈的不同肽段之間形成氫鍵，幾乎所有的肽鍵都參與鏈間氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸方向接近垂直。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：、 -折疊有平行和反平行的兩種形式:平行式：肽鏈

23、上的排列極性（NC）是相同的，即所有肽鏈的N末端都在同一方向上；另一種是反平行式，肽鏈的極性一順一倒，N末端間隔同向，反式更穩(wěn)定。、R基在肽平面上下交替出現(xiàn)。 折疊與螺旋的轉(zhuǎn)變(3) -轉(zhuǎn)角 (-turn) -轉(zhuǎn)角是指蛋白質(zhì)的分子的多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180的回折，在回折角上的結(jié)構(gòu)就稱-轉(zhuǎn)角，由四個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。第n個(gè)氨基酸殘基的C=O與第n+3個(gè)氨基酸殘基的NH之間形成氫鍵。Gly and Pro residuesoften occur in -turn沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過主鏈間及主鏈與側(cè)鏈間氫鍵維持其構(gòu)象。（）無規(guī)卷曲：螺旋折疊片轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲3、三級(jí)

24、結(jié)構(gòu)（1）概念：例子：1963年Kendrew等通過鯨肌紅蛋白的x-射線衍射分析，測(cè)得了它的空間結(jié)構(gòu)。 N 端 C端（2）構(gòu)象特點(diǎn)： 三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象近似球形。 親水表面，疏水核。分子中的親水基團(tuán)（具有極性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸殘基）相對(duì)集中在球形分子的表面，疏水基團(tuán)（非極性氨基酸殘基）相對(duì)集中在分子內(nèi)部。 穩(wěn)定性主要靠疏水相互作用維系，其它：氫鍵、二硫鍵、離子鍵和范德華力。 三級(jí)結(jié)構(gòu)形成了，蛋白質(zhì)分子的生物活性部位就形成了，在球形分子的表面往往有一個(gè)很深的裂縫，活性部位就在其中。 血紅素（鐵卟啉）4、四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)的涵義：亞基的概念（以、等命名）： 由亞基聚合而成的蛋白質(zhì)稱為寡聚蛋白。作用力：次級(jí)鍵

25、，主要疏水相互作用；其它氫鍵、離子鍵、范德華力舉例：血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容： 亞基的數(shù)目4條 種類2種四亞基兩兩相同，分別稱為1 、2、1、2；亞基的立體分布球形亞基的相互作用次級(jí)鍵血紅蛋白肌紅蛋白 血紅蛋白 血紅蛋白氨基酸序列大不相同，功能相似（載氧），結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)決定功能小結(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似，但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物，也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。一、蛋白質(zhì)分子的大小蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量 例如：根據(jù)血紅蛋白中Fe及牛血清蛋白中Try 的含量分別計(jì)算這兩種蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。 二

26、、兩性解離和等電點(diǎn) 1、兩性解離蛋白質(zhì)是多價(jià)解離的兩性電解質(zhì)1） 末端游離-NH3+,-COO-2） 側(cè)鏈可解離基團(tuán)-NH3+、-COO-、咪唑基、胍基、甚至極性側(cè)鏈的-OH和-SH2、等電點(diǎn)和等離子點(diǎn) 1）等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷與負(fù)電荷相等（凈電荷為零）時(shí)，環(huán)境中的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)由環(huán)境pH決定。每種蛋白質(zhì)都有特定的等電點(diǎn)，但等電點(diǎn)并非常數(shù)。 因溶液中鹽的種類和離子強(qiáng)度的影響而有所不同；2）等離子點(diǎn)（isoionic point） ：概念等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。 3、等電點(diǎn)的特征及應(yīng)用： 1） 特征：粘度、滲透壓、導(dǎo)電能力最小，可用于等電點(diǎn)的測(cè)定。2） 應(yīng)用

27、：溶解度最小 分離混和蛋白；凈電荷為零 等電聚焦三、膠體性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍；（2）蛋白質(zhì)分子表面的NH2、-COOH、OH等是親水基團(tuán)，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質(zhì)分子表面形成一個(gè)水化層。（3）蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)膒H值下，都帶有相同電性的表面電荷，表面電荷又吸附溶液中的異性電荷，形成所謂雙電層。 2、滲析和超濾利用蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)來分離純化蛋白質(zhì)。透析(dialysis)利用透析袋（半透膜）把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 超濾：應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過半透膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。四、沉淀作用 +-+-（沉淀）（疏水膠

28、體）（疏水膠體）1、穩(wěn)定元素：水化層和帶電層2、鹽析鹽溶？鹽析？在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來，常用的中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等。蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。分級(jí)鹽析：用于蛋白質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小這一特性，可以調(diào)溶液的pH，盡量接近它的等電點(diǎn)，而使蛋白質(zhì)沉淀。例如：利用等電點(diǎn)沉淀分離肌紅蛋白（pI=7.0）、牛胰島素（pI=5.3）、細(xì)胞色素C（pI=10.7）。五、變性作用 概念：在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。引

29、起變性的主要因素：強(qiáng)酸和強(qiáng)堿、尿素、胍、重金屬、生物堿、表面活性劑；加熱、劇烈振蕩、紫外線、超聲波等。1、變性的本質(zhì)蛋白質(zhì)變性學(xué)說：變性作用是天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的松解，即由原來有規(guī)則的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)殚_鏈的無規(guī)則松散結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)并未破壞，不涉及共價(jià)鍵（肽鍵和二硫鍵）的破壞?？赡孀冃裕喝?jí)結(jié)構(gòu)以上被破壞不可逆變性：二級(jí)結(jié)構(gòu)也能破壞2變性蛋白質(zhì)的特性 （1）生物活性全部或部分喪失 （2）一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露（3）一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變 （4）生化性質(zhì)的改變 應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性作用常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。六、 顏色反應(yīng)

30、一般顏色反應(yīng)，如茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。特殊顏色反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。雙縮脲 堿性CuSO4溶液 紫色第五節(jié) 蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測(cè)定一、分離純化的一般原則及基本步驟1、一般原則2、基本步驟 組織破碎 抽提 粗提（沉淀法、超濾法、萃取法） 精制（層析法、電泳法） 結(jié)晶 (1)生物組織的機(jī)械破碎(研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等)。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶

31、劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提， 酸性蛋白用稀堿性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提: 離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。(5)結(jié)晶：取得蛋白質(zhì)晶體并測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)。二、氨基酸的分離 1、蛋白質(zhì)的水解 1)酸水解6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫酸,105-110水解20小時(shí)。優(yōu)點(diǎn):不容易引起水解產(chǎn)物旋光性的變化。缺點(diǎn):Trp被沸酸完全破壞。2)堿水解5 mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。缺點(diǎn):水解過程中許多AA都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。水解產(chǎn)物旋光性變化。 優(yōu)點(diǎn):T

32、rp在水解中不受破壞。3）酶法水解：部分水解，需幾種酶協(xié)同作用制備氨基酸以酸水解為主，堿水解為輔。2、濾紙層析（濾紙為支柱物的分配層析) 層析系統(tǒng)組成：層析技術(shù)由三個(gè)基本條件構(gòu)成：水不溶性惰性支持物；流動(dòng)相（即溶劑系統(tǒng)）能攜帶溶質(zhì)沿支持物流動(dòng)；固定相是附著在支持物上的水或離子基團(tuán)。根據(jù)分離機(jī)理，可將層析法分為吸附層析、離子交換層析、分配層析、分子篩過濾層析及離子交換與分子篩效應(yīng)兩種機(jī)理相結(jié)合的層析，等等。分配定律和分配系數(shù)混合物在層析系統(tǒng)的分離決定于該混合物的組分在這兩相中的分配情況。濾紙層析是最常用的經(jīng)典的分配層析技術(shù)：固定相水；流動(dòng)性有機(jī)溶劑。分配定律：【P73】分配系數(shù)K=CA/CB；單

33、向紙層析圖Rf值比移值只要溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度和濾紙型號(hào)等實(shí)驗(yàn)條件確定，則每種氨基酸的Rf值是恒定的，借此可作物質(zhì)鑒定。雙向紙層析 濾紙層析機(jī)理：利用氨基酸的極性不同使混合物分離，若分子中極性基團(tuán)相同，而亞甲基數(shù)增加（分子量增大）則整個(gè)分子的極性相應(yīng)降低，Rf值隨之增大。 3、離子交換層析（1）概念：離子交換柱層析是將一種稱為離子交換樹脂的大分子聚合物（如聚苯乙烯）填裝于層析柱內(nèi)進(jìn)行層析的方法。分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂（酸性基團(tuán)） SO3H（強(qiáng)酸型）或COOH（弱酸型），解離出H+與環(huán)境中其他陽離子交換。陰離子交換樹脂（堿性基團(tuán)）N（CH3）3OH（強(qiáng)堿型）或NH3O

34、H（弱堿型）解離出OH-與環(huán)境中其他陰離子交換。(2)離子交換層析法的過程：上樣交換洗脫將氨基酸混合液（pH值23）上柱，pH值23時(shí)，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的H+發(fā)生交換而被“掛”在樹脂上，結(jié)合的牢固程度決定于（3）、）。為了使氨基酸從樹脂上洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步提高洗脫劑的pH值和鹽濃度（離子強(qiáng)度），這樣各種氨基酸將不同的速度被洗脫下來。（3）原理：離子交換樹脂使混合樣品中的各種氨基酸分離的原理是由兩種因素綜合作用的結(jié)果。 氨基酸與樹脂電離基團(tuán)的靜電相互作用，這種作用受環(huán)境pH值影響而變化； 氨基酸的R基團(tuán)與樹脂的非極性苯環(huán)的疏水相互作用，疏水性

35、強(qiáng)的R基團(tuán)與樹脂的親和力大。結(jié)合強(qiáng)度和洗脫順序（陽離子交換樹脂）：結(jié)合強(qiáng)度：堿性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸洗脫順序：酸性氨基酸中性氨基酸堿性氨基酸（4）氨基酸自動(dòng)分析儀（amino acid analyzer）原理為離子交換層析 4、薄層層析利用吸附性不同來實(shí)現(xiàn)氨基酸分離 將固體支持物均勻地涂在玻璃板或塑料板上，把待分析的混和物點(diǎn)樣到薄層上，然后選擇合適的溶劑展開達(dá)到分離的目的。5、電泳氨基酸帶電情況：pH值pI：；pH值 pI：0；pH值 pI：。所以，氨基酸分子在電場(chǎng)中會(huì)發(fā)生移動(dòng)。帶電微粒在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度主要取決于它所帶凈電荷量以及微粒的大小和形狀。QE=6r，= QE/6r例：pH值7

36、時(shí)，Ile(pI=6.02) 、Glu(pI=3.22)、Lys(pI=9.74)，在電場(chǎng)中如何分離。三、 蛋白質(zhì)分離純化的基本方法1、鹽析和等電點(diǎn)沉淀：穩(wěn)定因素：水化層和帶電層 在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來。 等電點(diǎn)沉淀法 蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。2離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素（CM-C），陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C）。 例：用陽離子交換樹脂分離：A 血紅蛋白（pI=6.7）；B胃蛋白酶（pI=2.2）；C細(xì)胞色素C （

37、pI=10.7）；D牛胰島素（pI=5.3）問：結(jié)合強(qiáng)度和洗脫順序。結(jié)合強(qiáng)度：CADB 洗脫順序：BDAC原理分子篩層析(gle filtratio chromatography) 。介質(zhì) 交聯(lián)葡萄糖、 瓊脂糖 （多孔的網(wǎng)狀 聚丙烯酰胺形成的凝膠珠 結(jié)構(gòu)） 3、凝膠過濾法利用生物大分子和其他物質(zhì)(配基)進(jìn)行特異性又可逆的結(jié)合這一性質(zhì)，對(duì)這些生物大分子物質(zhì)進(jìn)行層析分離的方法。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。4、親和層析法affinity chromatographyCH2 CH 2 CH2被吸附的蛋白質(zhì)分子瓊脂糖顆粒特異的配體連接臂步驟： 制備親和吸附劑 上柱、結(jié)合 分離 洗脫特點(diǎn)：親和層析條件溫和、

38、操作簡(jiǎn)單、快速、純化倍數(shù)高，甚至從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中一步就可以將高純度的蛋白質(zhì)分離出來，且活性物質(zhì)回收率高。但由于不是每種大分子均可以找到有效結(jié)合的配體，而且還要摸索配體和固體載體的結(jié)合、特異性吸附和洗脫條件，故使此方法的應(yīng)用受到一定限制。四、蛋白質(zhì)及氨基酸的分析測(cè)定 1、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（1）凱氏定氮法：靈敏度較低蛋白質(zhì)（）N6.25反應(yīng)式如下： 消化：蛋白質(zhì) + H2SO4（NH4）2SO4 + SO2+ CO2 + H2O蒸餾：（NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3（NH4）2B4O7 + 5H2O 滴定： （NH4）

39、2B4O7 + 2HCl + 5H2O2NH4Cl + 4H3BO3樣品中總氮量（克氮）(A-B)0.010014100/(C1000)A滴定樣品用去的HCl平均ml數(shù)；B滴定空白樣用去的HCl平均ml數(shù)；C樣品的克數(shù)；0.100HCl的當(dāng)量濃度。（2）雙縮脲法：樣品量0.2-1.7mg/L在堿性條件下，蛋白質(zhì)與CuSO4所生成的顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸組成無關(guān)。將樣品同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)同時(shí)試驗(yàn)，并于540-560nm波長(zhǎng)下側(cè)其光吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線即可求得蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲法最常用于需要快速但并不需要十分精確的測(cè)定。 方法與步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管從05編

40、號(hào)，按下表分別加入各試劑，每加一種試液均須混勻，加畢后于室溫放置30分鐘，然后以0號(hào)管作為空白對(duì)照管，540nm處測(cè)定各管A值。以標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白（mg）為橫坐標(biāo)，A 540值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣液測(cè)定可用牛奶中提取的酪蛋白配制溶液。未知酪蛋白濃度的樣品測(cè)定3管。方法步驟與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程的5號(hào)管相同，僅用未知濃度酪蛋白溶液1.0mL代替標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與未知濃度蛋白測(cè)定過程是同時(shí)進(jìn)行的。根據(jù)未知濃度酪蛋白試液的A540值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的蛋白毫克數(shù)，即為所測(cè)酪蛋白溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)。（3）Folin-Lowry法：實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法中，以L

41、orry等人發(fā)展的Folin-酚試劑法應(yīng)用最為普遍。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高，較紫外吸收法靈敏1020倍，雙縮脲法靈敏100倍；操作簡(jiǎn)單快速，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。但它的不足之處是反應(yīng)過程中受干擾因素較多。Folin-酚試劑由試劑A和試劑B兩部分組成。在Folin-酚試劑法中，蛋白質(zhì)中的肽鍵首先在堿性條件下與酒石酸鉀鈉-銅鹽溶液（試劑A）起作用生成紫色絡(luò)合物（類似雙縮脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸的存在，該絡(luò)合物在堿性條件下進(jìn)而與試劑B（磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成）形成藍(lán)色復(fù)合物，其呈色反應(yīng)顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。通過比色測(cè)定，參照已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。所生成藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此，在650nm或660nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，即可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 （4）紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)溶液在280nm處具有紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在此波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度呈正比關(guān)系，因此利用這一性質(zhì)可進(jìn)行蛋白