蛋白質(zhì)研究技術(shù)課件

1、蛋白質(zhì)研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子顆粒大小1100nm之間,屬膠體顆粒范圍蛋白質(zhì)的膠體原因： 表面形成水化層 表面同種電荷的斥力蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體 當破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時，蛋白質(zhì)就會從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀(一) 蛋白質(zhì)的沉淀概念: 應用:(1) 蛋白質(zhì)分離純化 (2) 解毒 (3) 臨床檢驗 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）； 2、酸堿（等電點沉淀）； 3、有機溶劑沉淀； 4、重金屬鹽類沉淀；5、生物堿試劑沉淀6、加熱變性沉淀(1) 鹽析法( salting ou

2、t) 常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 使蛋白質(zhì)沉淀的方法 概念：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉 淀稱為鹽析 特點：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性 作用原理: 鹽離子與水親和力極強，奪去蛋白質(zhì)的 水化層，減少分子間靜電斥力(2) 有機溶劑沉淀法 注意事項: 必須在低溫下操作 盡量縮短處理的時間 及時將蛋白質(zhì)中殘存的有機溶劑除去 缺點：常會使蛋白質(zhì)變性常會使蛋白質(zhì)變性 原理: 使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電 常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導致蛋白質(zhì)分 子聚集而沉淀 常用有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮 (二) 蛋白質(zhì)的凝固概念：變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的 現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)

3、的凝固，凝固作用本質(zhì)上是 蛋白質(zhì)變性后進一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K超濾：利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質(zhì)通 過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在 膜上，稱為超過濾透析：將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流 動的適當?shù)木彌_液（如純水）中，小分子 雜質(zhì)（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出， 而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化（三）透析和超濾透析工作圖半透膜原理磁力攪拌器透析袋+ +圓盤電泳平板電泳(四) 電 泳電泳的應用：蛋白質(zhì)分子量的測定：SDS, Native蛋白質(zhì)等電點的測定： Isoelectric Focusing 蛋白質(zhì)組學研究：雙向電泳 樣品處理染色

4、電泳蛋白質(zhì)分子量的測定（ SDS ）(四) 電 泳(四) 電 泳蛋白質(zhì)等電點的測定實驗條件的選擇2468101214等電點-體系 pH蛋白質(zhì)帶負電荷+蛋白質(zhì)帶正電荷 根據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇適宜的pH值和緩沖體系0實驗條件的選擇P+P0P-P2-P3-P3-P2-P-P+P0P3-P2-P-P+P0 根據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇合適的洗脫條件疏水作用色譜原理：根據(jù)蛋白質(zhì)與吸附劑之間的弱疏水性 作用的差別進行蛋白質(zhì)的分步洗脫各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑常用的疏水性配基： 苯基、短鏈烷基C3C8）、 烷氨基、聚乙二醇和聚醚疏水吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修

5、飾密度應根據(jù)配基的疏水性而異，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難 疏水作用色譜的洗脫一般采用降低緩沖液中的鹽濃度來 洗脫蛋白也可以采用加入少量的有機溶劑來洗脫，如反相色譜疏水作用色譜Fraction凝膠過濾色譜概念： 當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù) 它們分子大小不同而進行分離的技術(shù)，又可稱作排 阻色譜或者分子篩色譜原理： 凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物 流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠 孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被 洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入 凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較 慢，最后被洗脫出來常用凝膠：

6、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 、聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂糖凝膠（ Sepharose）凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的應用生物大分子的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細胞及顆粒的分離親和色譜原理：利用化學方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異 結(jié)合的化合物（稱配體）連接到固相載體 上，當待提純的生物大分子通過此層析柱 時，可以與載體上的配體特異的結(jié)合而留在 柱上，其他物質(zhì)則不能結(jié)合，然后用適當方 法使生物大分子從配體上洗脫下來，從而達 到分離提純的目的 特點：純化效率高，提純度可達幾千倍配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體洗脫結(jié)合耦聯(lián)作用機

7、理金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配 基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固 定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有 的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生 特異螯合作用而進行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特點：體系復雜: 含量低、組分多、干擾大水溶液體系： 接近生理狀態(tài)，盡量避免 使用有機溶劑低溫操作： 防止蛋白變性和失活必要的添加劑： 蛋白酶抑制劑、還原劑專業(yè)的儀器設(shè)備：制備型 蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分離提純的原則： 純度、活性和產(chǎn)量蛋白質(zhì)分離提純的一般步驟： 破碎細胞 蛋白提取 粗細分級 鑒定分離純化技術(shù) 綜合

8、運用各種方法和技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化方法按蛋白質(zhì)性質(zhì)分類 溶解度： 沉淀(鹽析、有機溶劑、等電點) 分子大小、形狀：離心、超濾、透析、 凝膠過濾層析 分子大小、電荷：電泳、離子交換層析 分子間作用力： 親和層析、金屬鰲合層析、 疏水作用層析蛋白質(zhì)分離純化方法按純化方法分類 沉淀：鹽析、有機溶劑、等電點 電泳：凝膠電泳、等電聚焦 離心：常規(guī)、密度梯度 過濾：超濾、透析 層析：離子交換、凝膠過濾、親和層析、 疏水作用蛋白分離純化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻譯后修飾（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的裝配 (Interactions and asse

9、mbly) 三維結(jié)構(gòu) (3-dimensional structure) 生物功能分析 (Analysis of biological function) 藥物開發(fā) (Drug development) 從有機體中獲得純的蛋白要盡可能的用較少 的步驟，盡可能少的丟失活力分離純化策略 細胞與組織(材料來源有限，但是蛋白是天然的 狀態(tài)) 折疊均一, 可溶（主要指非膜蛋白） 可通過差速離心分離細胞組份 純化可用色譜方法（chromatography）從哪兒開始 ？ cDNA克?。槟壳暗鞍讈碓吹闹饕椒ǎ堑鞍滓仔纬砂w（inclusion body） 重組蛋白基因在大腸桿菌、昆蟲細胞、 哺 乳

10、動物細胞或植物細胞中表達 也用差速離心及色譜方法純化 在重組的蛋白中可以添加Tags以便于純化從哪兒開始 ？破碎細胞上 清 沉淀(丟棄)離心細胞裂解細胞裂解物,蛋白 核酸及小分子 多步純化(包括鹽析、過濾、層析等)不需要的分子 純蛋白從組織細胞中進行蛋白分離流程圖蛋白質(zhì)粗分離 I：從組織細胞 - 提 取 哪個物種合適？ 豐度及活力特點 大小，成本及物種的可獲得狀況 哪個組織合適 ? 對于特定的細胞哪個組織豐富 組織中哪種細胞中有這類蛋白 純化過程中的作為應該與特定的方案相關(guān) 非常有益的信息 大小、組成影響組織提取的因素 緩沖液（ Buffer ） 離子強度（ Inoic strength ）

11、金屬離子螯合劑（ Metal ion chelators） 還原劑（ Reducing agents ） 蛋白酶抑制劑（ Protease inhibitors ） 溫度（ Temperature ） 組織的破碎方式（ Tissue disruption ）組織破碎(Tissue disruption) 除去不要的組織 攪碎 勻漿（homogenization） 研磨 (vessel for extraction)細胞破碎(Cell Disruption) 化學破碎: 堿、有機溶劑、去污劑 酶學手段: 溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶 (常適用于含細胞壁的細菌及植物細胞) 物理方法: 滲透壓震蕩、凍

12、溶 機械方法: 超聲、勻漿、濕磨、壓力初步純化 - 熱變性 不同的蛋白有 不同的熱穩(wěn)定 性，且有些蛋 白可以在熱變 性以后再復性 鈣調(diào)蛋白是能 通過熱變性而 獲得純化的一 個很好例子天然結(jié)構(gòu)(%)一般蛋白0 () 100鈣調(diào)蛋白初步純化 - 沉淀鹽析：減少蛋白質(zhì)表面的水化層 硫酸銨、尿素等電點沉淀：降低蛋白質(zhì)分子的荷電狀態(tài) 改變體系pH值至pI附近有機溶劑沉淀：減少蛋白表面水化層，增加疏水性 降低水的介電常數(shù)，降低蛋白溶解性 甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇蛋白質(zhì)粗分離 II：表達蛋白 重組基因的表達 可獲得大量的蛋白 可進行突變 - structure/activity studies 可引入具有

13、光譜特性的物質(zhì) 可引入穩(wěn)定同位素 15N 、 2H 、 13C (for NMR) 蛋白融合體 便于純化及免疫學研究菌體細胞破碎總蛋白純蛋白性質(zhì)分析培養(yǎng)介質(zhì)細胞碎片非目的蛋白離心、過濾物理、化學、酶學方法多步純化步驟重組蛋白分離純化蛋白質(zhì)的精細純化 基本策略： 綜合運用各種層析技術(shù)，尤其是特異性比較高的方法，如親和層析，可以大大減少純化的步驟和工作量，提高產(chǎn)品的純度蛋白質(zhì)的鑒定定性分析： 分子量: 凝膠電泳、質(zhì)譜 (可同時鑒定分子量和純度) 活性: 根據(jù)蛋白質(zhì)的功能選用不同的活 性檢測方法SDS測定蛋白質(zhì)的分子量和純度 MALDI-TOF-MS測定蛋白質(zhì)的分子量和純度 蛋白質(zhì)的鑒定定量分析： Folin-酚試劑法（Lowry法）： A500nm 靈敏度高、是常用的方法 考馬斯亮藍染色法（Bradford法）：A595nm 簡單迅速、干擾少、靈敏度高(1g) 紫外檢測法：濃度(mg/mL)= 1.45A280nm-0.74A260nm 簡單快速、不破壞樣品、