蛋白質分離與純化課件

1、蛋白質（酶）的分離與純化第一節(jié) 引言 蛋白質（酶）、核酸存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質（酶）是生物功能的執(zhí)行者，擔負著生物催化、物質運輸、運動、防御、調控及記憶、識別等多種生理功能； 核酸是遺傳信息的攜帶者，在生物體中指導各種蛋白質（酶）的合成。DNARNAProtein 蛋白質的分子量一般在100001000000 Da之間 1 Da1C12絕對質量/12 1.6610-27 kg一、分離純化的意義1 從生物材料中分離制備蛋白質（酶），研究其結構與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質有重大意義。2 工業(yè)生產的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性

2、的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。3 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。4 基因工程的需要蛋白質組學實驗室所需的條件蛋白質組研究相關網站 蛋白質組研究技術、信息等 發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用（新藥開發(fā)） 蛋白質組研究相關企業(yè)、各種儀器來源、新聞等teome.co.uk 各種蛋白質組研究相關信息http:/www.micromass.co.uk 介紹蛋白質鑒定的先進儀器http:/www.expasy.ch 蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，Swiss Institute of Bioinformatics .au 蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，Australian Proteome Analysis

3、Facilityhttp:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白質鑒定專家系統(tǒng)，Canadian Bioinformatics Resours 二、分離純化的要求1 純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作為研究蛋白質（酶）一級結構、空間結構，一級結構與功能的關系、工具酶和標準蛋白、分析用酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質制劑，達到一定純度即可，不要求均一。2 活性：要求大分子保持天然構象狀態(tài)，有高度的生物活性。3 收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。4 在制備時丟失的蛋白（酶）永遠不能在后面實驗中彌補。第二節(jié) 分離純化

4、的前處理選擇材料主要根據實驗目的而定。工業(yè)上通常選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的即可。實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關的結締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷凍保存。一、細胞破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分

5、泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破碎。微生物合成后分泌的酶有兩種 1. 胞外酶（分泌型酶） 是指可以穿過質膜的任何酶，大多數(shù)是水解酶，大多數(shù)工業(yè)用酶是胞外酶。 優(yōu)點：它比胞內酶容易回收、純化，不必 將細胞破碎，也不用去核酸，容易獲得高產。 常用的濃縮方法超濾法 使用超濾膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法。液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，適于蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。超濾膜及反滲透作用機制UltrafiltrationReverse osmosis大分子小分

6、子水水滲透壓反滲透純水鹽水純水超過濾除小分子雜質，分離、濃縮蛋白質加壓蛋白質溶液半透膜支持膜的柵板超濾液 盡可能減少蛋白水解/其它形式降解機械法（超聲波法、高壓法、機械勻漿法）化學法（去污劑法）物理法（液氮研磨法、循環(huán)凍融法、滲透法、玻璃珠破碎法）酶法胞內酶需要破碎細胞2.2 超聲波破碎法 用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50100mg菌體/mL濃度，在110kG頻率下處理1015min。缺點是在處理過程會產生大量的熱，應采取相應降溫措施。 影響因素：樣品濃度、超聲波頻率、功率、破 碎時間 操作：冰浴、間歇進行 適用于懸浮細胞

7、破碎。對超聲波敏感和核酸應慎用。原理：化學試劑改變或破壞細胞膜結構常用試劑：有機溶劑、表面活性劑 十二烷基磺酸鈉、去氧膽酸鈉3 化學破碎法提取蛋白質緩沖液中常用的表面活性劑 非離子表面活性劑 (溫和 ) Triton X-100：打破脂-脂相互作用和脂-蛋白質相互作用 陰離子表面活性劑 (more denaturing) SDS：打破蛋白質相互作用 脫氧膽酸鈉：打破蛋白質相互作用 How to isolate total protein 裂解細胞；溶解的蛋白質；必須使用含表面活性劑的蛋白質提取緩沖液來溶解膜蛋白細菌：用溶菌酶，能專一性的作用于肽多糖的-1,4糖苷鍵。酵母菌：蛋白酶（作用于蛋白質

8、-甘露聚糖），再加入葡聚糖酶，再改變滲透壓使細胞膜破裂，因為酵母壁厚，難破碎。霉菌：幾丁質酶植物細胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶混合使用。 4 酶破碎法 組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、

9、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。細胞破碎確認1.直接測定破碎前后的細胞數(shù)： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù) 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細胞與完整細胞。2.測定導電率： 利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。3.測定釋放的蛋白質量或酶活力： 測定破碎液中胞內蛋白質或目的酶的釋放量，估算破碎率。二、細胞器的分離細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內質網，植物細胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質。細胞器的分離一般采用離心法，即將破碎后的細胞在適當?shù)慕橘|中進行離

10、心，常用的介質有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質量大小的不同，經過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經多次分步離心后，即可獲得所需組分。三、提取1 提取的基本概念與影響因素 提取（抽提或萃?。航M織細胞破碎過程中，大量的胞內酶及細胞內含物被釋放出來，必須立即將其置于一定溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞。 主要影響因素：a 欲提取的物質在所用的溶劑中的溶解度；b 該物質向溶劑擴散的難易 溶解度大?。篴 溶劑（相似相溶）；b 溫度；c 等電點2 蛋白質和酶的提取 提取方法：水溶液提取、有機溶劑提取、混合提取 選擇方法

11、依據：存在部位、分子結構和溶解性質大多數(shù)蛋白質均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如2050m mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH7.07.5) 或0.1mol/L Tris-HCl (pH7.58.0) 緩沖液作提取液。對于一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。2.1 水溶液提取 水、稀鹽、稀酸、稀堿溶液 常用稀鹽溶液和緩沖液，應注意控制鹽濃度、溫度、pH 2.1.1 鹽濃度的選擇 通常在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質

12、的溶解度增加，這種現(xiàn)象稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析。 鹽溶一般用等滲鹽溶液。但根據溶解度，有些蛋白質要用較高濃度鹽溶液提取，而有些則用純水提取。2.1.2 pH的選擇 不在等電點附近，但不宜太高或太低。2.1.3 溫度的選擇 一般010（常用4），對于耐高溫的蛋白質和酶，可適當提高溫度，可使雜蛋白變性分離，有利于提取和進一步純化。2.1.4 添加底物或輔酶有利于酶的提取大部分蛋白質都可以溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中，因此，可采取不同溶劑提取分離和純化蛋白質。常用有機溶劑：乙醇、丙酮、丁

13、醇等注意：蛋白質提取應根據不同蛋白質的不同性質選用不同的提取條件2.2 有機溶劑提取第三節(jié) 分離純化從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。蛋白質的分離方法根據蛋白質的溶解度差異分離沉淀技術根據蛋白質分子大小的差異分離分子篩根據蛋白質的荷電差異分離離子交換根據蛋白質與某些物質的吸附差異吸附分離利用生物分子專一性結合的特性親和層析主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但效果不理想，通常只是作為初步的分離純

14、化，還需要結合其它的純化方法。一、粗分級分離沉淀分離：通過改變某些條件或加入某種物質，使溶液中某種溶質的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出的技術。包括鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復合沉淀法、金屬鹽沉淀法、選擇性變性沉淀等。原理：破壞親水膠體的兩個穩(wěn)定因素。沉淀及鹽析蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀膠體溶液的特點： 分子直徑在1100nm內 溶于水 不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液1. 鹽析沉淀 (salting out)向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽(NH4)2SO4，Na2SO4，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用是由于當鹽濃度較高時，鹽離子與水分

15、子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質分子表面的水化層。特點：蛋白質不變性。1.1 鹽的選擇 常用的鹽析劑是(NH4)2SO4，因為它的鹽析能力強，在水中的溶解度大，價格便宜，濃度高時也不會引起蛋白質活性喪失。 鹽析沉淀的蛋白質仍保持天然構象，即仍有活性。 蛋白質用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進一步精提純。脫鹽常用透析法。陰離子鹽析能力按下列順序遞減 ：SO4-2PO4-3Ac-1Cl-1NO3-1I-1陽離子鹽析能力按下列順序遞減 ：NH4+Mg+2Li+Na+K+ 25 (NH4)2SO4 飽和溶液

16、767g/L 0 (NH4)2SO4 飽和溶液 676g/L(NH4)2SO4是一 中性鹽，對蛋白質有相當好的安定作用。又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，為有效的鹽析工具。通常(NH4)2SO4的添加以百分飽和度表示（不是濃度百分比），例如大部分蛋白質可在80%(NH4)2SO4飽和度下沉淀。 因為(NH4)2SO4加入的體積很大，會改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計算。飽和度隨溫度變化稍有差異，25下的飽和濃度為4.1 M（硫酸銨767g/L）；0100%之間各飽和度的添加量要查表，而不是以767克直接乘以其百分比值(%)。各種蛋白質，因其表面的非極性區(qū)域分布不同，各在其特定的

17、(NH4)2SO4飽和濃度下沉淀，一般做為初步的純化。飽和硫酸銨溶液配法取760g800g (NH4)2SO4，放人7080蒸餾水1000mL中攪拌約20min，室溫靜置過液，硫酸銨結晶析出，即上清為飽和 (NH4)2SO4再用NH4OH調pH為7.0硫酸銨起始濃度%飽和度每升溶液需加入固體硫酸銨的克數(shù)0 時硫酸銨最終濃度%飽和度調整硫酸銨溶液飽和度計算表1067953260134108815427016413710982552701941661391118356280226197169141113845628025822920017214311586572902912622332041751

18、461178758290326296266237207179148118895930036133130127124121118115112090603003983683373062762452141841531239261310436406374343312280249218187156125936231047644441238134931728525422219015912795633205164844524203873553232912582261941611299765320559526493460427395362329296263230197164132996633060357053

19、65034694364023693353022682352011681341016734065061558154751247844541037634230827323920517113710368340697662627592557522488453418383348313279244209174139105703500510152025303540455055606570758085909510020 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100056114144176196209243277313351390430472516561662

20、767105786118137150183216251288326365406449494592694202959789112315519022526230034038242452061925304961931251581932302673073483904855833019306294127162198235273314356449546331243741071421772142522923334265223531639412916420023817831941150640316397132168205245285375469453265991341712102503394315033661

21、0113717621430239255336710314117926435360346910514322731465347010719027570357215323775361151988077157907910202530333540455055606570758090100硫酸銨起始濃度%飽和度每升溶液需加入固體硫酸銨的克數(shù)25 時硫酸銨最終濃度%飽和度調整硫酸銨溶液飽和度計算表 分子量大的蛋白質先沉淀，分子量小的蛋白質后沉淀，球蛋白的分子量2030萬，而白蛋白的分子量只有6.9萬，所以50%飽和度硫酸銨沉淀的是球蛋白，而白蛋白則留在上清液中。 一般是用濃度從低到高的(NH4)2SO4去沉

22、淀蛋白，可以直接在液體里加固體的(NH4)2SO4，到一定的濃度離心沉淀，上清繼續(xù)加(NH4)2SO4，再離心，上清再加(NH4)2SO4，然后用電泳檢測或者活性檢測沉淀的效果。如在尿酶抽提液中加入固體(NH4)2SO4，當飽和度達到35%時，尿酶基本仍留在溶液中；當飽和度達到55%時，尿酶幾乎全部沉淀出來。硫酸銨飽和度(25)025 2535 3545 4555 5565沉淀物中酶活性 0 112 6850 3020 27分級沉淀結果1.2 鹽析注意事項(1) (NH4)2SO4容易吸收空氣中的水分而結塊，因此使用前最好先把(NH4)2SO4磨碎，平鋪在烤箱（約60）內烘過，切勿過熱。(2)

23、 添加(NH4)2SO4時，要在冰浴中進行，不可一次把(NH4)2SO4倒入，而以小量分多次慢慢溶入，并不時攪拌，以免造成局部濃度過高。 (NH4)2SO4全加完后，再攪拌約1030 min，使溶解完全平衡，然后進行離心，注意所要的是沉淀或上清，要弄清楚！(3) 最后所得的沉淀溶解在最少量的緩沖液中，或者以沉淀形式保存，均 相當安定；但要記得其中所含的(NH4)2SO4，是否對下一步檢定或純化有影響，可以用透析法除去。2. 等電點沉淀蛋白質是兩性電解質，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質等電點時，蛋白質的溶解度最小。不同的蛋白質有不同的等電點，因此通過調節(jié)

24、溶液pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質分開，從而除去大量雜蛋白。氨基酸的縮寫與等電點7.59Histidine組氨酸10.76Arginine精氨酸9.84Lysine賴氨酸3.22Glutamic acid谷氨酸2.97Aspartic acid天冬氨酸5.60Threonine蘇氨酸5.65Glutamine谷氨酰氨5.41Asparagine天冬酰氨5.74Methionine蛋氨酸5.07Cysteine半胱氨酸5.66Tyrosine酪氨酸5.68Serine絲氨酸5.89Tryptophan色氨酸6.30Proline脯氨酸5.48Phenylalanine苯丙氨酸6

25、.02Isoleucine異亮氨酸5.98Leucine亮氨酸5.96Valine纈氨酸6.00Alanine丙氨酸5.97Glycine甘氨酸pI英文名中文名極性中性氨基酸非極性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸3. 有機溶劑沉淀與水互溶的極性有機溶劑能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。有機溶劑引起蛋白質變性的原因有兩個：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，促進了蛋白質分子的聚集沉淀。是極性有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，而使蛋白質分子沉淀。室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白質沉淀，而且伴隨著變性。若預先將有機溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質溶液中，防止有

26、機溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。不同的蛋白質由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機溶劑分離不同的蛋白質。有機溶劑可去除多糖、去污劑、鹽離子和外源帶電小分子等雜質。方法：三氯醋酸(TCA)沉淀法引起降解/修飾 TCA-丙酮沉淀法 丙酮沉淀法 條件：pH=pI特點：常在低溫下進行缺點：易變性操作：低溫，沉淀分離后快稀釋，添加少量無機鹽，pH接近pI，用量試驗確定，可先濃縮。4. 重金屬鹽沉淀原理：中和負電荷條件：pHpI特點：蛋白質變性5. 生物堿試劑與某些酸類沉淀原理：中和正電荷條件：pHpI特點：蛋白質變性常用酸類：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯

27、醋酸、硝酸、過氯酸等二、細分級分離一般蛋白質樣品經粗制分級后，體積較小的雜質大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有離子交換層析、分子篩層析、親和層析、疏水吸附層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。另外，結晶也是蛋白質分離純化的方法之一，制備的結晶物常常作為蛋白質結構分析之用。1. 透析 (dialysis)透析：將蛋白溶液裝入用半透膜制成的透析袋中，將蛋白質溶液中的小分子化合物除去的方法。原理：蛋白質是高分子化合物，不能透過半透膜。如在袋外放吸水劑（如聚乙二醇）還可達到濃縮的目的。應用：除鹽和濃縮 半透膜具有使小分子或離子透過而蛋白質

28、分子不能通過的特性。一般先用蒸餾水沖洗透析袋（也可用玻璃紙），用橡皮筋或細繩結扎透析袋的一端，檢查無破口后，加入擬脫鹽的蛋白液，排出空氣，留一定空隙。扎好另一端。 開始先用蒸餾水透析過夜，水量至少是蛋白液的50 倍，然后移至PBS或生理鹽水中，置4透析23d，每天換液二次以上，用氯化鋇溶液檢查SO42+，用奈氏（Nesslers）試劑檢查NH+。透析只用于除鹽類和小分子雜質透析只用于除鹽類和小分子雜質在300mL濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析蛋白質溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里透析過程2. 層析 (chromatography)離子交換層析：根據蛋白

29、質的電荷與層析載體（離子交換劑）電荷之間的相互作用而達到分離目的。應用：分離蛋白質羧甲基纖維素、二乙氨基乙基纖維素 (EDTA-纖維素)蛋白質溶液中帶正電荷的分子與陰離子載體作用，稱為陽離子交換，常用的固定化材質是羧甲基纖維素；反之，稱為陰離子交換，常用的固定化材質是EDTA-纖維素。帶有電荷的離子或分子的小珠加入蛋白質溶液羧甲基纖維素層 析（色譜）離子交換層析氨基酸在陽離子交換柱上的分離Separation of amino acids on a cation exchange column3. 分子篩層析（凝膠過濾）分子篩：根據多孔載體對不同大小、形狀的蛋白分子的排阻能力不同而將各個組分分

30、開的一種層析，又稱凝膠過濾層析。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快； 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內部，路程長，流 動慢。應用：分離蛋白質、除鹽gel chromatography 凝膠層析常用分子篩： 葡聚糖凝膠 (Sephadex) 型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質、小蛋白質，除鹽 瓊脂糖凝膠 (瑞典Sepharose、美國Bio-GelA) 孔徑大，用于分離大分子物質 聚丙烯酰胺凝膠 (Bio-GelP)緩沖溶液： 由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 調節(jié)酸和鹽的用

31、量，可配制不同pH的緩沖液。Sephadex G10 分離范圍 700Sephadex G15 分離范圍 1500Sephadex G25 分離范圍 10005000Sephadex G50 分離范圍 150030000 Sephadex G75 分離范圍 300080000 Sephadex G100 分離范圍 4000150000 Sephadex G150 分離范圍 5000300000 Sephadex G200 分離范圍 5000600000 適用于脫鹽、肽與其它小分子的分離 各種葡聚糖凝膠的分離范圍與用途G后面的數(shù)字為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，

32、同樣G-200克每克凝膠吸水20克。大分子小分子裝填難溶且高度水合的聚合物的小珠加入蛋白質溶液 比網孔大的蛋白質分子不能進入網孔，隨溶液先流下，比網孔小的蛋白質分子進入網孔，由于分子大小不同，流出的速度不同，達到分離的目的。凝膠過濾法的凝膠球凝膠層析凝膠色譜法分離蛋白質過程4. 親和層析 (Affinity chromatography) 許多蛋白質對一些化學基團具有專一性結合。能夠被生物大分子如蛋白質所識別并與之結合的基團稱為配基 (ligand)，如酶對它的作用物、底物具有特殊的親和力，抗原與抗體互為配基。當?shù)鞍踪|通過由配基充填的管柱時，特定的蛋白質將與配基吸附，其余蛋白質因無法吸附而被流

33、洗出。利用高鹽緩沖液洗脫與配基吸附的蛋白質。 間隔臂親和層析法的作用原理親和層析洗滌樣品洗脫加入擔體平衡走樣沖洗洗脫再生紙層析5. 電泳 (electrophoresis)電泳：蛋白質在電場中可向其所帶電荷相反的方向移動的現(xiàn)象。原理：由于不同的蛋白質帶電多少、分子量大小及分子形狀不同，因此在電場中泳動的速度就不同，從而可將蛋白質分離開。應用：分離蛋白質和測分子量。6. 超速離心 (ultracentrifugation)不同蛋白質的密度與形態(tài)各不相同，在離心力場中沉降的速度也不同，從而將其分離。蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù) (S) 表示。等于每單位離心場的速度（S = v/2r，v-沉降速

34、度，-離心轉子的角速度 (弧度/秒)，r-到旋轉中心的距離），1S=10-13秒。大多數(shù)蛋白質和核酸的沉降系數(shù)在4S40S之間，核糖體及其亞基在30S80S之間。密度梯度（區(qū)帶）離心6000080000轉/分重力60萬80萬倍S與蛋白質大體上和分子量成正比關系。S與蛋白質的密度和形狀相關，如分子量相同，緊密顆粒的摩擦系數(shù)小沉降快；而疏松顆粒的摩擦系數(shù)大沉降慢。應用：蛋白質的分離純化和測分子量。Isopycnic Equilibration(CsCl等密度平衡)Zone Centrifugation(蔗糖區(qū)帶離心)高 速 離 心Gravity Centrifugation(無梯度)高速離心與兩種

35、超高速離心法的比較樣品：多為蛋白質密度相似、分子量不同樣品：多為核酸密度不同、分子量相似一般的重力離心僅把顆粒與溶液分離開來超 速 離 心(Supercoiled)RNAPlasmid DNA(Open circular)Chromosomal DNAProteinDensityDensityDensityDensityLipids(濃度梯度)沉降方向沉降方向密度梯度離心滴加樣品4%8%12%16%20%塑料離心管蔗糖密度梯度（介質還可用：氯化銫、甘油等）蔗糖濃度%分子量由小 大 用氯化銫密度梯度超速離心兩天后，在紫外線照射下。 可觀察到質粒DNA的明亮熒光條帶。蛋白質（酶）的分離純化 性質

36、方法分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀電荷 電泳、離子交換層析吸附性質 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）對配體分子 親和層析的生物親和力組合純化硫酸銨沉淀凝膠過濾法離子交換法分子表面極性不同分子量大小不同分子靜電荷不同第四節(jié) 純度鑒定生物大分子經過分離提純，最后還要鑒定制品的純度。蛋白質和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法等。純的蛋白質在一定條件下進行電泳，將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質在離心場中，應以單一的沉降速度移動。選用任何單獨一種鑒定方法都

37、不能最后確定蛋白質的純度，必須同時采用23種不同的方法才能確定。蛋白質的定量分析考馬斯亮藍法 (Bradford法)Folin酚試劑法 (Lowry法)紫外吸收法雙縮脲法 (Biuret法)凱氏定氮法 (Kjedahl法)利用蛋白質的呈色反應，測量蛋白質濃度。 雙縮脲反應： Cu2+ 蛋白質 紫色絡合物 OH-蛋白質的呈色反應 顏色反應光吸收定量分析雙縮脲試劑加入前的尿液樣。陽性(+)陰性(-)未知樣A，B和C顏色反應光吸收定量分析酚試劑反應： 磷鎢酸 蛋白質 藍色化合物 磷鉬酸蛋白質的呈色反應 米倫試劑反應： 米倫試劑 蛋白質 紅色沉淀 顏色反應光吸收定量分析蛋白質的呈色反應 考馬斯亮藍反應

38、： 考馬斯亮藍 蛋白質 （R-250）紅藍色 （G-250）藍綠色 R250較敏感，定量實驗用，染膠效果較好，但脫色較難 。 G250常用的蛋白染料，定性試驗用。顏色反應光吸收定量分析蛋白質的呈色反應 考馬斯亮蘭法 (Bradford法) G250 465nm 595nm 標準曲線標準蛋白蛋白質(g)A7500204060801000.0000.1200.2540.3720.4800.601利用蛋白質的吸光度，測量蛋白質濃度。 標準曲線未知蛋白蛋白質(g)A75033920.2000.550酶的活力測定在酶的制備過程中，每一步驟都應測定留用以及準備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，以了解經過某

39、一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍。酶活力：催化反應的能力，表示樣品中酶 的濃度(u/mL酶液)；回收率：提純前與提純后酶的總活力之比；比活力：單位蛋白質（蛋白質或蛋白氮）所 含有的酶活力。 測定完成一定反應所需的時間 測定單位時間內酶催化的化學反應量（1）分光光度法： 利用底物/產物光吸收性質不同 選擇適當波長來測定。（2）熒光法： 利用底物/產物熒光性質的差別。紫外/可見光酶活力的測定方法（3）同位素測定方法： 放射性同位素標記底物， 經酶作用得到相應產物， 經適當分離，測定產物脈沖數(shù)即可。（4）電化學法： pH測定法，跟蹤反應過程中H+的變化等。 離子選擇電極法，用氧電極

40、測定一些耗氧 的酶反應。酶活力測定實例 確定反應條件 20、pH=7，底物濃度 6g/L（過量）， 加入2mg固體脂肪酶 確定活力單位 每小時催化1克底物 1u = 1g/h 測反應初速度 作產物甘油隨時間增加的曲線， 量出反應初速度值 ， 換算為脂肪的消耗速度。如8g/h 換算活力 8g/h / 1g/h = 8u 計算比活 8u/2mg酶蛋白 = 4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶 甘油 + 脂肪酸第五節(jié) 氨基酸順序分析 2. 由cDNA序列反推氨基酸序列：DNA 測序法： F. Sanger 每股 DNA 可讀出三種氨基酸序列1. 直接進行氨基酸測序： Edman degradationF. S

41、anger Insulin 胰島素 (A, B chains)胰島素的分子結構F. Sanger (Cambridge U) Insulin 胰島素 (A, B chains)SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chain 樣品的純度在97以上； 測定蛋白質的相對分子量； 測定肽鏈的數(shù)目； 測定氨基酸的組成； 氨基酸序列分析。1. 直接進行氨基酸測序SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳HPLC樣品純度的測定測定肽鏈的數(shù)目多肽鏈的拆分獲得單條線形多肽鏈 由多條多肽鏈組成的蛋白

42、質分子，必須先進行拆分。如：血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體等。任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子 環(huán)境氧濃度低時Hb快速釋出氧分子 動脈靜脈血紅蛋白對氧的運輸測定氨基酸的組成酸水解：破壞蛋白質的肽鍵柱層析：進行氨基酸定量分析，每個氨基酸的量與洗脫峰 的面積成比例。陽離子交換層析多肽鏈氨基酸序列分析 測定多肽鏈N-端與C-端的氨基酸殘基； 把肽鏈水解成肽段，再分離純化肽段； 測各肽段的氨基酸排列順序； 經過組合排列對比，得出完整肽鏈中氨基酸 順序。1.1 N-端與C-端氨基酸殘基的測定方法N末端分析： Sanger法 (二硝基氟苯法, D

43、NFB) 丹磺酰氯法 (DNS法) Edman法 (異硫氰酸苯酯法, PITC) 氨肽酶法 C末端分析： 還原法 肼解法 羧肽酶法N末端分析 1：Sanger法O2NFNO2DNFBH2N-CH-CAAR OO2NHN-CH-CAANO2R OO2NHN-CH-C-OHNO2R OAAN-末端氨基酸DNP衍生物DNP氨基酸（黃色）+二硝基氟苯H2OH+N末端分析 2：丹磺酰氯法N(CH3)2SO2Cl+水解H2N-CH-CAAR ON(CH3)2SO2- HN-CH-CAAR ON(CH3)2SO2- HN-CH-C-OHR O丹磺酰氯N-末端氨基酸丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（熒光）+AA

44、靈敏度最高決定N端氨基酸只有 N-端氨基酸會被丹磺酰氯修飾HCl hydrolysisTLC plate2Dchromatogram氨基酸水解液以紫外線顯色N-terminalTLCTLEN末端分析 3：Edman降解法 蛋白質N端的氨基酸與異硫氰酸苯酯 (PITC)反應，并一個一個按順序切下，生成易于檢測的苯氨基硫甲酰 (PTH) 氨基酸，利用液相色譜進行分析，從而測定蛋白質的氨基酸序列。 目前應用最廣泛pH 8.79.040環(huán)化H+水解，氨基酸抽提苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰多肽異硫氰酸苯酯多肽+PeptideN-PTH-1 21PTH-21 2Amino acidanalysisSecond cycle切除N-端氨基酸的剩余部分PTH-氨基酸裂解Edmandegradation+ PITC異硫氰酸苯酯 (PITC)苯氨基硫甲酰多肽苯氨基硫甲酰氨基酸1. 硼氫化鋰還原 生成相應的氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。2. 肼解法 多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉變?yōu)橄鄳孽ｋ禄衔铩ｋ陆庀聛淼腃末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。3. 羧肽酶法 在pH8.0, 30用羧肽酶處理，定期