中科大【生物化學與分子生物學實驗原理】重組蛋白的SDS-PAGE

1、實驗八 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量李衛(wèi)芳 汪文捷 王秀海1 實驗目的1.1 通過本實驗學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的基本原理。1.2 初步掌握應用此法測定蛋白質分子量的操作技術。1.3 掌握考馬斯亮藍染色技術。 紙電泳瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳毛細管電泳NativeSDSIEF2DClassification2 實驗原理SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），1967年由Shapiro等建立1969年由Weber和Osborn進一步完善用于測蛋白質亞基分子量 SDS電泳系統(tǒng)中引入了SDS和還原劑，如-巰基乙醇和二硫蘇糖醇（DTT） 。SDS 是一種陰離子

2、去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，使蛋白去折疊變性，多聚體解聚為亞基。還原劑能斷開鏈內和鏈間二硫鍵，使蛋白質以單鏈形式存在。解聚后的氨基酸側鏈與SDS充分結合形成蛋白質-SDS復合物。其形狀為長橢圓棒狀，短軸的長度都一樣，約為18 ，而長軸長度與蛋白質分子量成正比。 在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質的結合比為1.4g SDS/1 g蛋白質SDS的硫酸根帶負電，使各種蛋白質的SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，大大超過蛋白質分子原有的電荷，因而屏蔽了不同種類蛋白質分子之間原有的電荷差異，從而使蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而

3、與所帶電荷和形狀無關，這樣便能直接從電泳遷移率計算出蛋白質的分子量。 凝膠濃度與孔徑的關系：T濃度大，孔徑小，移動顆粒穿過網孔阻力大。T濃度小，孔徑大，移動顆粒穿過網孔阻力小。凝膠濃度與被分離物分子量的關系： 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的分子量也不同.在分子量15 KD-200 KD范圍內，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系，即：lgMW = K- bmRMW 為蛋白質分子量K為截距b為斜率mR為相對遷移率在一定條件下，K和b均為常數(shù)相對遷移率 =根據(jù)上述方程將已知分子量的標準蛋白質電泳遷移率與分子量的對數(shù)作圖，可制出一條標準曲線，測出同樣條件下待測蛋白質的電泳遷移率，即

4、可從標準曲線上查出其分子量本法測定分子量的誤差約為10%。考馬斯亮藍命名是為紀念1896年被英國占領的阿散提部落首府Kumasie（Coomassie）。染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纖維素膜電泳，并認為同樣可用于紙電泳，瓊脂糖電泳和淀粉凝膠電泳。1965年Meyer等將此方法應用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。 考馬斯亮藍染色技術考馬斯亮藍是一種氨基三苯甲烷染料，通過范德華力與NH3+的靜電引力，與蛋白質形成緊密而非共價結合的復合物。R-250即三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個SO3H基團，偏酸性，與氨基黑一樣結合到蛋白質的堿性基團上。G-250即二甲花青亮藍，呈藍綠色，是一種甲基

5、取代的三苯基甲烷。使用時，考馬斯亮藍在甲醇-冰醋酸-水 （50：10：40， V/V）混合液中的濃度通常為0.05%0.1%，而且應該在加冰醋酸和水之前將它們先溶于甲醇。靈敏度：考馬斯亮藍染色可以達到0.2 0.5 g（200 500 ng），最低可檢出0.1 g蛋白；通過考染條帶的深淺粗細，可以大致判斷該條帶有多少蛋白。銀染的靈敏度比考染高將近100倍，最低可以檢出2 ng蛋白。蛋白質完全變性二硫鍵全部還原與SDS充分結合 樣品處理目前使用最多的是Laemmli的Tris-甘氨酸系統(tǒng)，廣泛地用于蛋白質亞基分子量以及純度的測定。蛋白質的二硫鍵是否完全被還原。只有在蛋白質分子內的二硫鍵被徹底還原

6、的情況下，SDS才能定量地結合到蛋白質分子上去，并使之具有相同的構象。所以樣品處理時需加-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）。樣品處理液中SDS單體的濃度:為了保證蛋白質與SDS的充分結合，溶液中SDS的總量至少要比蛋白質高3-4倍，甚至10倍以上。樣品處理液的離子強度：應保持較低的離子強度（低于0.26），這樣才能保證SDS有較高的單體濃度，與蛋白質充分結合。若樣品的離子強度太高，需先透析或凝膠過濾除鹽。樣品中的蛋白質濃度需適當。濃度過高，易造成拖尾，甚至影響蛋白質遷移率與分子量對數(shù)的線性關系；濃度太低則不易檢測。通常根據(jù)樣品含有的蛋白質種類多少及所使用的檢測方法確定蛋白質濃度，如用考馬斯亮藍染

7、色，每種蛋白的濃度應為2030g/ml,若用銀染，則只需0.30.5g/ml。二硫蘇糖醇（DTT） 0.75g(或-巰基乙醇) 1ml10%SDS 10 ml1M Tris-Cl pH6.8 1.6 ml87%甘油 6.25 g0.05%溴酚藍 2mlddH2O 至20ml1 ml/管分裝，20保存。 樣品緩沖液（0.08M Tris-Cl， pH6.8） 5用樣品緩沖液（0.08M Tris-Cl， pH6.8）配制成每種標準蛋白質濃度均為0.5 g /ul的溶液，-20保存。使用前置室溫融化后，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。配置貯備溶液 A30%Acr/0.8%Bis 貯液： Acr30

8、g Bis0.8 g溶于去離子水，定容至100 ml。棕色瓶4保存。B.4分離膠緩沖液（1.5 M Tris-Cl pH 8.8；0.4% SDS）：Tris Base：181.8 g； SDS：4 g； ddH2O 750 mlHCl 加至pH 8.8ddH2O 至 1000 mlC.4濃縮膠緩沖液（1M Tris-Cl pH6.8 ；0.4% SDS ）：Tris Base：30.3 g； SDS：4 g； ddH2O 200 mlHCl 加至pH6.8 ddH2O 至250 mlD.10 % AP：AP 1gddH2O 至10 mlE.TEMEDF.10SDS電極緩沖液(PH8.3)：T

9、ris base (FW121.1) 250 mMGlycine (FW 75.1) 2MSDS (FW288.4) 1% (W/V) ddH2O to 100mL G.固定染色液：考馬斯亮藍R-250 0.58g 95%乙醇 250mL冰醋酸 50 ml ddH2O 200 ml L.脫色液：95%乙醇 250 ml冰醋酸 80 ml ddH2O1000 ml3.1 安裝垂直板電泳槽3.2 分離膠制備12%, 配5 ml,加至距梳齒0.5 cm，上覆蓋12 mm高的蒸餾水(或無水乙醇、水飽和的異丁醇) ，用于隔絕空氣，使膠面平整，靜置20 分鐘-30 分鐘使其聚合。3.3 濃縮膠制備5%，配

10、 2 ml,插入加樣梳，靜置20 分鐘-30 分鐘使其凝合。3. 試驗操作試劑用量 (mL)12%分離膠5%濃縮膠4分離膠緩沖液(PH8.8)1.254濃縮膠緩沖液(PH6.7)0.530% 丙烯酰胺貯液20.33ddH2O1.71.1510% 過硫酸胺（AP）0.050.02TEMED0.0050.0023.4 上樣與電泳 將電泳槽與電泳儀連接好， 上槽接負極，下槽接正極。 上下槽中加滿電極緩沖液， 移液槍或微量注射器加樣，每孔10 l。 電泳條件：開始電壓90 V,待樣品進入分離膠時，恒壓130 V，電泳約2 h,直至前沿距下端約0.2 cm。加樣：標準蛋白 (marker)：5 lE.C

11、oli lysis ：10 lPurified protein (OpuCC): 10 l注意：10 l電泳樣品加入2.5 l 5Loading Buffer(5LB)后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構。 3.5 凝膠板剝離與固定 電泳結束后，關閉電泳儀。用不銹鋼藥鏟撬開玻璃板，取出膠膜。4.7 染色與脫色 加入染色液，微波爐內煮沸 1.5-2 min；or 室溫下染色1 h；Or 60 水浴染色10 min。然后用脫色液脫色，更換脫色液3-4次，直至背景無色為止。4.1 電泳遷移率的計算4.2 標準曲線的制作 以各標準蛋白的相對遷移率為橫坐標，分子量的對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線。4.3 待測