實(shí)用組織化學(xué)技術(shù)-常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué)研究生-張國華20160504w3課件

1、實(shí)用組織化學(xué)技術(shù)中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院張國華細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)cytochemistry and histochemistry是以細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)為基礎(chǔ)，運(yùn)用物理的和化學(xué)的技術(shù)方法顯示細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中各種化學(xué)成分，并對這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定性、定位、定量（半定量），從而分析研究生物在生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞組織的代謝、機(jī)能及形態(tài)變化規(guī)律。其在醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。細(xì)胞和組織化學(xué)方法研究的范圍1. 組織細(xì)胞中的無機(jī)物質(zhì)：主要包括鉀、鈣、鋅、銅、汞等金屬；氯化物、磷酸鹽等鹽類；以及各種無機(jī)放射性物質(zhì)等。2. 組織細(xì)胞中的有機(jī)物質(zhì)：主要包括中性脂肪、磷脂類、膽固醇、中性和酸性粘多糖類、糖原、粘液蛋白、淀粉

2、、類淀粉物質(zhì)、黑色素、脂褐素、膽色素、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、各種維生素等。3. 組織細(xì)胞中各種酶類：如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶等-蛋白質(zhì)。細(xì)胞和組織化學(xué)方法的設(shè)計(jì)要求:1. 必須最大限度地保存細(xì)胞和組織中各種化學(xué)成分和/或酶的活性，以保證定性、定量研究；2. 必須最有效地保持細(xì)胞組織固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以保證化學(xué)成分和各種酶在細(xì)胞組織中的定位；3. 必須掌握被檢測的化學(xué)物質(zhì)特性，如水溶性、脂溶性、溶解度及特異反應(yīng)等；4. 必須掌握被檢測各種酶的特性，如酶的功能、酶存在的特定部位、酶反應(yīng)的適宜溫度和酸堿度、酶的特異激活劑和抑制劑、影響酶

3、活性的因素等；5. 必須做對照實(shí)驗(yàn)，借助陽性和陰性對照，正確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，注意識別假陽性結(jié)果。一、取材基本要求：取材是否正確、恰當(dāng)，直接影響切片的制作及正確診斷。1取材越快越新鮮越好，防止組織自溶、腐敗。2取材刀要鋒利，切取時刀口垂直地切??；嚴(yán)禁擠壓，嚴(yán)禁用鉗鑷鉗夾，以免使組織或細(xì)胞變形造成人為的損傷。3取材大小，一般長l-3厘米，寬1-2厘米，厚度為0.3-0.5厘米。科研用光鏡標(biāo)本不超過1cm 1cm 1cm，電鏡標(biāo)本直徑約0.5mm。過大材料在短時間內(nèi)不易固定透，影響效果。4 要兼顧病變部位與正常部位。 5 盡可能在低溫條件下操作，04。 各器官取材方法：腦：取材應(yīng)能反應(yīng)出腦各部位的變化

4、，一般采用冠狀切面法，全腦包括（橋腦、延腦、小腦和脊髓頸段及脈絡(luò)叢）。取材部位如下：額極； 中央前后回；海馬；內(nèi)囊； 丘腦； 枕葉；脈絡(luò)叢；中腦； 橋腦； 延髓； 小腦； 脊髓頸段。取材時要包括軟腦膜、室腦膜或軟脊膜（刀要鋒利）。垂體：取垂體時注意前、中、后葉和垂體柄都要兼顧，從前向后矢狀切。 心：一般悄況下將心房、瓣膜、心室一起取下。也可分別取一塊病變部位連同正常組織。也可單獨(dú)取心室肌，乳突肌組織。肺：常規(guī)取材應(yīng)包括左、右兩肺（五個肺葉），可根據(jù)病變需要決定取材塊數(shù)，特殊情況下為區(qū)別在哪個肺葉上取的材可用形狀做標(biāo)志，在記錄時記清楚。腎：取材包括被膜、皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂，并要求區(qū)別左、右腎。胰：

5、常規(guī)取胰體部，為長方形必要時加取胰頭、胰尾。肝：取長方形或三角形均可，帶被膜。脾：取材帶被膜。管腔臟器：取材時注意方向大、小腸：考慮環(huán)行肌肉，沿腸管的長軸?。v切）；食管：以橫切面為宜；胃：常規(guī)取材以胃底為好；氣管：橫切、縱切均要有?？傊芮慌K器的各層構(gòu)造都要取到。為了防止標(biāo)本入固定液后變形，將材料取下后（如剪開的大小腸、胃等組織）將漿膜面鋪在濾紙上，然后入固定液內(nèi)，這樣能防止或減少組織受壓變形與收縮。二、組織固定組織固定的意義：組織固定是做好切片的重要步驟之一，如果首次固定失敗，再重新固定也不如一次固定成功好，無法補(bǔ)救。迅速將檢材固定能有效地防止組織及細(xì)胞發(fā)生死后的一系列變化。固定的關(guān)鍵在于

6、取材后盡可能地及時地將取到的材料進(jìn)行固定，抑制其死后變化的進(jìn)展，盡力使組織接近于生前狀態(tài)。另外，在標(biāo)本制做過程中經(jīng)過許多步驟，為了防止組織成份的溶解消失，有必要及時轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，從而有利于保存。 組織固定的目的： 阻止死后變化，防止組織的自溶與腐敗。 使組織的結(jié)構(gòu)保存下來，如蛋白質(zhì)，脂肪、糖元、酶等各種成份與生活時的形態(tài)相仿。 便于染色，同時對組織有媒染作用，使不同的組織成份對染料有不同的親和力，使細(xì)胞各部易于受色。 能使組織硬化，為做薄切片打下基礎(chǔ)。 固定液：用以固定組織的藥劑。固定液分為兩大類： 單純固定液：僅由一種藥劑組成。 混合固定液（或復(fù)合固定液）：由二種以上的藥劑組成的固定液。

7、固定液選擇標(biāo)準(zhǔn)：具有強(qiáng)的穿透力，固定均勻，能迅速滲透組織內(nèi)部，使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持生活時期的相仿狀態(tài)。不使組織過度收縮與膨脹而變形。能迅速使組織中的蛋白質(zhì)，糖、脂肪等物質(zhì)凝固而成為不溶性物質(zhì)。使組織達(dá)到一定的硬度，便于切片制作、染色。X價格便宜，容易買到，同時要配制方便。 常用的單純固定液乙醇（酒精）alcohol 甲醛（福爾馬林）（緩沖液配制） formalin重鉻酸鉀 potassium bichromate 苦味酸 picric acid鋨酸 osmic acid 丙酮 acetone 冰醋酸 glacial acetic acid 多聚甲醛緩沖固定液 paraformaldehyde戊二

8、醛磷酸緩沖固定液 glutaric dialdehyde組織固定方法1. 原位固定法在活體情況下，采用快速邊取材邊滴加固定液，取出標(biāo)本后再浸泡固定30min-1h，以上操作應(yīng)在0-4下進(jìn)行。2. 浸透固定法固定液0-4，量應(yīng)是樣品40倍以上，浸泡30-90min或更長。3. 培養(yǎng)細(xì)胞和涂片固定法單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶只需將培養(yǎng)內(nèi)蓋片取出浸透固定即可。懸液培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)離心濃縮后涂片，或離心管內(nèi)加入固定液2000r/min約20 min離心成團(tuán)后制作切片。也可以向離心管內(nèi)加入膠凍再離心，切取離心管尖端膠凍固定。4. 灌注固定法通過心血管途徑將固定劑灌注到全身或某一器官，使生活的細(xì)胞在原位迅速固定后再取材，可

9、達(dá)到非常好的固定效果，尤其對于腦等需要很長取材時間的器官更有意義。麻醉或頸椎脫臼處死動物后，立即打開胸腹腔和心包，滴溜注射針刺入左心室或主動脈內(nèi)，剪開右心耳排血，立即用含有適量肝素的生理鹽水或緩沖液灌注，清洗血液；然后很快用固定液繼續(xù)灌注，大小鼠心灌注時其壓力約為100-150mmHg，灌流量約為5-10ml/min，灌注時間一般在5-20min左右，一般以觀察動物肝質(zhì)地變硬為準(zhǔn)。灌注固定完成后取材，并用固定液后固定2小時。灌注固定快速均勻， 可保存細(xì)胞組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)。三、水洗用水道流水洗滌，目的是將組織塊中的固定液取代出來，水洗一定要充分。水洗時間數(shù)小時至24小時。根據(jù)材料多少、大小可靈活掌

10、握水洗工具，可用水洗筐或用紗布包裹，要防止水流大將組織塊沖掉或丟失?？蒲杏眯〔牧弦部捎肞BS液多次浸泡洗滌，但要保證至少4-6小時的洗滌時間。四、脫水組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化，但達(dá)不到切薄片的硬度，必須進(jìn)行除固定液以外的其它處理，脫水就是繼固定后的重要步驟。經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水份，在這種情況下首先必須除去組織內(nèi)部的水份，這種除水的過程叫做脫水，脫水使用的藥劑稱為脫水劑。脫水必須逐漸依次從低濃度酒精開始到高濃度酒精，否則會引起組織強(qiáng)烈收縮變脆，不利制片，但脫水不徹底也很難浸蠟。常用脫水劑：酒精、丙酮、正丁醇等。1. 酒精一股是從70酒精開始，經(jīng)809095100I一100II，每步驟脫水

11、時間根據(jù)材料大小而靈活掌握，一般數(shù)小時到12小時，更換一次酒精。無水乙醇不適合用來配低濃度酒精，價格較貴。取95酒精70ml加蒸餾水25ml，配成70酒精95ml。80酒精取95酒精80ml加蒸餾水至95ml即可，依次類推。2. 丙酮脫水作用與酒精相似，雖然其脫水作用比酒精強(qiáng)，但對組織塊的收縮較嚴(yán)重，且價錢較貴，故不宜用于一股組織脫水。丙酮既有脫水作用，又有透明作用。用丙酮固定的材料要小，脫水1一8小時即可。 五、透明 組織塊脫水后需要透明，因?yàn)樗c蠟不能相交換，需要借助石蠟誘導(dǎo)劑的過渡。石蠟誘導(dǎo)劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài)，習(xí)慣上將石蠟誘導(dǎo)劑滲入組織內(nèi)的過程叫透明，而這種藥劑稱為透明劑。

12、透明的時間依組織塊的大小而定，一般采用20分鐘至1小時左右，如組織塊過大可延長透明時間，透明好的材料如同油炸的感覺，呈透明狀。 六、浸蠟與包理 浸蠟的目的是為了能制備一菲薄的切片做準(zhǔn)備。將透明好的組織塊浸到石蠟中，使石蠟滲透到組織細(xì)胞內(nèi)，將組織細(xì)胞內(nèi)的二甲苯完全徹底地取代出來，然后再用石蠟將組織包埋起來，冷卻后，切成小塊，修整好切面，再用切片機(jī)切極薄的切片，將這一過程稱為浸蠟與包埋。蠟的種類：主要有兩類： 蜂蠟：是動物體內(nèi)提取的蠟，顏色微黃，故也稱為黃蠟，溶點(diǎn)在54左右。特點(diǎn)是潤滑帶有粘性，冬天用量比夏天多。 石蠟：是由礦物質(zhì)中提取，質(zhì)地較疏松，色白。根據(jù)蠟的溶點(diǎn)不同又可分為軟蠟及硬蠟： 溶點(diǎn)

13、在50以下的石蠟稱為軟蠟。溶點(diǎn)在50以上的石蠟稱為硬蠟。兩種蠟可以摻合在一起使用（沒條件的情況下可用蠟燭來代替）。上海生物制品廠出的石蠟熔點(diǎn)有5254，5658，5860，6062這幾種。七、切片1、載玻片的準(zhǔn)備、粘附劑的使用：.商品化準(zhǔn)備好的載玻片：兩端帶有“”標(biāo)志，無須處理，直接使用；比較昂貴；.常規(guī)載玻皮的處理：鉻硫酸浸泡24小時，流水沖洗12小時，蒸餾水洗3遍，烘干，備用；玻片較干凈時，也可用稀鹽酸浸泡。 蛋白甘油：用雞蛋清（不要雞蛋黃）用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬笥脭?shù)層紗布過濾后加等量的甘油攪均勻加數(shù)顆麝香草酚（防腐）。載玻片上薄層涂抹后晾干，備用。主要用于常規(guī)組織學(xué)、組織化學(xué)染色用。 多聚賴

14、氨酸（poly-L-lycine, PLL） 多聚賴氨酸（M.W=300kD） 0.5g 蒸餾水 100ml配制方法：稱取多聚賴氨酸，配制0.5%的水溶液，充分混合即可。也可適當(dāng)稀釋配成0.01%-0.5%濃度。4保存，也可在-20備用。多聚賴氨酸可反復(fù)冰凍，效果無大影響。工作液常用稀釋10-50倍。主要用于免疫組織化學(xué)、原位雜交、TUNEL染色等。APES粘片劑（Vectabong試劑）（3-Amino propyltriethoxy silane）是一種新型玻片粘附劑，通過對玻璃表面的化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地粘貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時間較久。一個

15、試劑盒7ml可配成350ml（丙酮）工作液。 程序：干凈載玻片丙酮5min APES(1ml+50ml丙酮），將玻片用鑷子夾住浸入APES試劑1-2次純丙酮洗2次干燥，37過夜用鋁箔包好，RT存放，備用。鉻礬明膠液（略）甲醛-明膠液（略）注意：備用載玻片均要避免污染（尤其注意防塵）； 一般可保存半年以上。2、制作切片需要的工具：切片刀、磨切機(jī)、水浴鍋、干燥箱或烤片機(jī)（可用蠟箱代替使用）。還需載玻片、手術(shù)刀、毛筆一支、彎鑷子一個、托盤一個、大平皿一個、（展片使用）烤片盒或烤片架、蛋白甘油等。切片機(jī)：1. 切片機(jī)種類：有輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，滑行式切片機(jī)（滑動式），冰凍切片機(jī)，超薄切片機(jī)（電鏡用）等；2.

16、 構(gòu)造：任何一個類型的切片機(jī)都是由四個基本部分組成：刀臺；標(biāo)本臺；旋轉(zhuǎn)輪；控制切片厚度的微動裝置（標(biāo)有 l25或1一50的數(shù)字，每一數(shù)字代表一個微米用來顯示）。可根據(jù)需要厚度來調(diào)節(jié)，一般組織片都采用7。以上四部分共裝在一個鐵制的臺坐上，這樣就組成了各種類型的切片機(jī)，最常用的是石蠟切片機(jī)。切片操作：將切割修整好的蠟塊用普通刀片先將蠟塊切面暴露出來、修平，固定在切片機(jī)標(biāo)本臺上并擰緊螺旋。切片刀固定于刀臺上，擰緊固定刀的螺絲，同時調(diào)整刀與蠟塊的切片距離，使刀與蠟塊貼緊后再固定刀臺螺絲，刀的角度為25度角。調(diào)節(jié)微動裝置，調(diào)至切片所需厚度（一般為 6-7微米）修材。右手握旋轉(zhuǎn)輪搖把，按順時針方向均勻地?fù)u

17、動直到組織塊切面完整為止。如果以上各部操作正常，此時能切出一條完整的連續(xù)的蠟帶，用毛筆輕輕將蠟帶順刀口挑下，放在托盤內(nèi)待用。3、水浴鍋展片、撈片通電后將平皿內(nèi)水溫升至45左右，將已切好的薄片切割數(shù)片輕漂水中展平，不平時可用小彎鑷子輕輕展平，然后用涂有蛋白甘油等粘附劑的載片在水中選擇完整的切片以一定角度進(jìn)行撈片。注意事項(xiàng)： 1切片刀要鋒利，否則切片有切痕或組織破碎，甚至切不下來。2展切片時水溫要適當(dāng)，水溫低展不平切片，影響效果，有皺折；水溫過高切片入水后蠟片及組織熔化。八、染色 染色前準(zhǔn)備工作染色用的工具：12個染色缸或者盛各種不同濃度的酒精染色筐廣口瓶，染色缸及脫蠟、透明用的各二個二甲苯缸，蓋

18、片，帶磨口蓋的樹膠瓶一個，鑷子等。染色需要的試劑及染色液的配制：鹽酸酒精：主要是染色分色時用。一般采用0. 51的濃度，即在100ml的7080酒精中加人0.5或者1ml的濃鹽酸。 蘇木素（Hematoxylin）蘇木素為細(xì)胞核的染料，不經(jīng)氧化的蘇木素是不具有染色能力的。蘇木素的配方很多，一般組織化學(xué)染色所配制的蘇木素有二類：一類是自然氧化的蘇木素，另一類是加入氧化劑加速氧化的蘇木素。 伊紅（曙紅， Eosin）是細(xì)胞質(zhì)最常用的染料之一。外觀是紅色粉末。分兩種，一種是酒溶性伊紅，另一種為水溶性伊紅。使用前要看說明以免配錯。一般組織病理學(xué)切片染色，染細(xì)胞核用蘇木素，染細(xì)胞質(zhì)用伊紅，故稱之為HE染色（蘇木素-伊紅染色法）。染色方法及步驟（以HE染色為例） 1脫蠟，將干燥的切片入二甲苯I 10-20分鐘，然后移入二甲苯 10-20分鐘。2脫苯：用無水乙醇I 脫苯2-5分鐘，再經(jīng)無水乙醇II 2-5分鐘。3水化：再經(jīng)95908070酒精各1分鐘，入蒸餾水浸洗數(shù)分鐘，每步操作要輕。4染細(xì)胞核，將切片移入蘇木素染液中染