分子生物學(xué)實驗常規(guī)技術(shù)操作

1、- 15 -分子生物學(xué)試驗常規(guī)技術(shù)操作目錄質(zhì)粒提取小提質(zhì)粒小量快提質(zhì)粒鑒定：大提質(zhì)粒：酶切制備型酶切小量酶切鑒定DNA片段5”突出端的補(bǔ)平瓊脂糖凝膠電泳回收從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段小量膠回收DNA片段試劑盒操作見操作手冊無水乙醇沉淀回收連接一般連接平端動態(tài)連接轉(zhuǎn)化質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化連接物轉(zhuǎn)化制一般固體培育板涂板挑菌血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法) 哺乳動物細(xì)胞單克隆株分別常用溶液、培育基配制質(zhì)粒提?。盒√豳|(zhì)粒：本試驗室在常規(guī)條件下承受堿裂解法小量提取質(zhì)粒從平板上挑取單菌落或搖甘油菌(550uL)，接種于3mL LB液體培育基中加有相應(yīng)的抗生素，37振蕩培育至OD 2.0以上，但也無需過濃

2、。* 通常DH5菌株搖1214hr;JM101 78hr;ER2566 1012hr *取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管可取未滅菌的管中，12022rpm離心1530sec，棄上清。通常可取1.5mL菌液再離心一次，棄去上清后在紙上扣干。不要遺忘將用完的試管及管蓋放入指定處以備回收處理 *參加150uL溶液I，振蕩使菌體沉淀充分懸浮。務(wù)必懸浮完全 *參加150uL溶液II，馬上輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解?？捎^看到原渾濁的菌懸液變清變粘 *參加180uL溶液，馬上上下顛倒充分混勻710次，不宜太猛烈?？捎^看到白色團(tuán)片狀沉淀消滅。* (6)置冰浴10分鐘，也可置于-20中5min。(

3、7)12022rpm離心810分鐘。在離心過程中可取未滅菌的1.5mLEppendorf管，參加等體積(350400uL即可)酚- 氯仿-異戊醇25:24:1備用；取滅菌過的1.5mLEppendorf管，參加2倍體積(780uL 即可)的無水乙醇置于-20備用。加酚-氯仿-異戊醇時要留神，應(yīng)吸位于 下層的酚相，而不要帶入上層的Tris-cl保護(hù)液 *離心完將上清快速倒入已加好的酚-氯仿-異戊醇中, 充分混勻。留神不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中 * (10)12022rpm離心45分鐘。(11)吸水相，參加已加好的無水乙醇中,顛倒混勻幾次。* 留神不要吸入酚相，沒把握時寧愿放棄一些水相

4、 * (12)-20放置515分鐘。12022rpm離心10分鐘?？焖贄壣锨澹恋碛眠m量70%乙醇洗一次，于紙上扣干。留神不要將沉淀洗掉 *置于恒溫器上枯燥(55)至無色透亮或無乙醇?xì)馕?，一般大約510min。(16)參加3040uL 1TE緩沖液溶解沉淀，-20儲存?zhèn)溆?。做完試驗請?zhǔn)時整理試驗臺 *小量快提質(zhì)粒鑒定：目前較少承受取培育的菌液1mL，12022rpm 離心30s，收集菌體，在紙上扣干殘留培育液。(2)用50uL 無菌水充分懸浮菌體。(3)每管參加50uL酚-氯仿-異戊醇25：24：1并充分混勻。(4)12022rpm 離心10分鐘。(5)留神吸取5uL上清上樣電泳。(對于插入片

5、段足夠大的重組子，其遷移率應(yīng)低于未插入片段的比照質(zhì)粒。)* 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *大提質(zhì)粒：取50uL菌液，接種到34mL的LB培育基中，37振蕩培育至OD600為1.61.8。取0.5mL菌液接種到200mL LB培育基中，37振蕩培育至OD600為2.0以上，再參加氯霉素至170ug/mL，37連續(xù)振蕩培育1216hr。(3)將搖好的菌液4000rpm離心15min。(4)棄上清，放開離心管口倒置，盡量讓上清全部流盡。(5)用預(yù)冷的40mL STE充分懸浮菌體沉淀。(6)4，4000rpm離心10min。(7)棄上清，放開離心管口倒置，讓上清全部流盡。(8)用預(yù)冷的4mL溶液充分懸浮

6、菌體沉淀。(9)參加穎配制的溶液 8mL，上下顛倒幾次，液體會變得澄清，置于410min。(10)參加預(yù)冷的溶液 6mL，上下顛倒混勻后，4中放置30min。(11)4，12022rpm離心10min。(12)收集上清，加等體積的異丙醇，4放置30min。(13)4，10000rpm離心10min。(14)棄上清，用70的乙醇洗沉淀一次，室溫吹干，溶于1mL 1TE中。(15)加50uL RNaseA，37作用2小時。(16)加1mL配制的13的PEG8000溶液13%PEG8000，1.6M NaCl，充分混勻，4放置30min。(17)4，12022rpm離心15min。吸去上清，用400

7、uL 1TE溶解沉淀。加1/4體積4M LiCl，室溫放置5min，12022rpm離心5min。(20)取上清，用酚、酚氯仿-異戊醇各抽提一次。將水相轉(zhuǎn)入一的Eppendorf管中，參加1/10體積4M LiCl，2倍體積的無水乙醇，20放置30min。4，12022rpm離心10min，去上清，70的乙醇洗沉淀一次，室溫晾干。(23)加200uL 1TE溶解沉淀，測定質(zhì)粒DNA的濃度后于20保存?zhèn)溆谩? 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *酶切：制備型酶切：在滅菌過的0.5mL Eppendorf管中參加以下成分混合：留意：酶切時酶要在最終才加，加酶時要用的槍頭，動作要快速，酶不要在空氣中暴露過久

8、；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲存管上裝酶的部位；用完后要 蓋緊放回原處；要用酶或有問題時請找治理員xxy。留意：酶切時用酶量不能過大，過大會影響酶切并且可能會有星號效應(yīng)。引起酶切效果不佳的緣由一般多是質(zhì)粒沒有提 好。除個別特別位點(diǎn)或內(nèi)切酶外，酶切時間均不宜過長。DNA樣品 10反響緩沖液* Rnase AddH2O限制性內(nèi)切酶A30uL6uL 34uL 適量1uL(限制性內(nèi)切酶B1uL)反響總體積5070uL* 為了保證酶切效率(至少在75%以上)，需選用適宜的反響緩沖液，不同公司的酶切反響緩沖液根本上可以通用。但需留意有的要另外加BSA(10和100的都有)。37反響34小時(可依據(jù)所

9、使用酶的需要，選用適宜的酶切時間和溫度)。(3)取12uL電泳鑒定。做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *小量酶切鑒定在滅菌過的0.5mL Eppendorf管中參加以下成分混合：留意：酶切時酶要在最終才加，加酶時要用的槍頭，動作要快速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲存管上裝酶的部位；用完后要 蓋緊放回原處；要用酶或有問題時請找治理員xxy。留意：酶切時用酶量不能過大，過大會影響酶切并且可能會有星號效應(yīng)。引起酶切效果不佳的緣由一般多是質(zhì)粒沒有提 好。除個別特別位點(diǎn)或內(nèi)切酶外，酶切時間均不宜過長。留意：做小量酶切鑒定時要盡量選用較為廉價的酶DNA樣品10反響緩沖液*5uL1.5

10、uLRNase AddH O2限制性內(nèi)切酶A (限制性內(nèi)切酶B反響體積0.5uL適量0.1uL0.1uL)1520uL* 請依據(jù)保證酶切效率(至少在75%以上)的需要選用適宜的反響緩沖液，不同公司的酶切反響緩沖液根本上可以通用。但需留意有的要另外加BSA(10和100的都有)。37反響23小時(可依據(jù)所使用酶的需要，選用適宜的酶切時間和溫度)。(3)取12uL電泳鑒定。做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *DNA片段5”突出端的補(bǔ)平:在滅菌過的0.5mL Eppendorf管中參加以下成分混合：留意：酶要在最終才加，加酶時要用的槍頭，動作要快速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲

11、存管上裝酶的部位；用完后要蓋緊放回原處；要用酶或有問題時請找治理員xxy。欲處理的DNA樣品10Klenow buffer 10mMdNTPddH O2DNA聚合酶I(Klenow 大片段)反響體積2ug34uL 2uL 適量510U3040uL37反響1小時后，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收。* 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *瓊脂糖凝膠電泳：制備凝膠：依據(jù)需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定濃度的瓊脂糖凝膠。首先在電子天平上稱取肯定量的瓊脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，參加100mL1TAE, 再參加34uL溴化乙錠(EB),混勻，在微波爐中煮化(大約45min)，混勻后倒入插好樣品梳的凝膠槽中,

12、凝固后備用。溴化乙錠(EB)有潛在的致癌性，操作時要戴手套，并且留意不要污染其它操作區(qū) *在微波爐中煮化時要留神不要讓凝膠暴沸 *倒膠時不要倒太厚，一般可插入梳子5mm左右即可 *倒回收膠要使用專用的樣品梳和凝膠槽 *瓊脂糖凝膠(%)0.50.81.01.21.52.02.53.0線性DNA的有效分別范圍(kb)2301.5101.070.760.530.220.11.50.071.0分別不同大小的DNA片段請選用適宜濃度的瓊脂糖凝膠 *待膠凝固后，留神拔去梳子，拔出時留意不要破壞膠孔。用刀片切下所需的膠塊，放入加有足夠電泳緩沖液(1TAE)的電泳槽中，緩沖液面高于凝膠外表35mm即可。留意電

13、泳時使用的是 1TAE緩沖液，而母液是50的，配制時要留神 *在放入凝膠要上樣前，最好 檢查一下樣品孔是否有破損泄漏，尤其是上回收樣品之前 *可在一干凈手套上點(diǎn)滴適量(13uL)的3溴酚蘭上樣緩沖液(深綠色)，用槍移取適 量的樣品(110uL)與滴加好的溴酚蘭上樣緩沖液混合(可觀看到混合液變?yōu)樗{(lán)色)， 再將混合液留神參加膠上的樣品孔中。上樣要快速準(zhǔn)確，上樣量不要過大以致漫出樣品孔 *假設(shè)樣品要求無污染，可使用的滅菌槍頭上樣 *假設(shè)樣品無嚴(yán)格要求(如用來做小量酶切鑒定的樣品)，可用一個槍頭屢次上樣，但每次上樣前在電泳緩沖液中洗幾下 *接通電極進(jìn)展電泳，電壓一般可在140V200V。留意要接對正負(fù)

14、極，核酸是由負(fù)極向正極方向跑的 *翻開及關(guān)閉電泳儀時 請?zhí)貏e留意 ，不要用沾染有EB的手套接觸電泳儀 * (6)當(dāng)溴酚蘭遷移至足夠距離時(至少1cm),關(guān)閉電源，取出膠塊放到紫外燈下觀看。在紫外燈下觀看時要留意保護(hù)眼睛，不要用裸眼直接觀看 *一般質(zhì)粒樣品電泳時，電泳遷移率從跨快倒慢依次是： RNA、溴酚蘭、cccDNA、LcDNA、OcDNA那些始終跑不出孔的樣品多是染色體觀看完畢后，要準(zhǔn)時處理凝膠及手套，嚴(yán)禁隨處拋棄 *做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *回收：從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段將已經(jīng)電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物在適宜濃度的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)展電泳。最好換用的電泳緩沖液，即1TAE

15、*當(dāng)溴酚藍(lán)跑到肯定距離后(至少2cm以上)在長波紫外燈下觀看，用清洗過的刀片在目的片段前切下一與目的片段同長，寬度適當(dāng)(一般1cm左右)的膠塊。不要遺忘在膠下墊一個的塑料手套防止污染 *留神不要將回收膠切裂, 同時留意與目的帶相鄰的切面要盡量平坦 * (3)將切好的回收膠塊放在原回收膠槽內(nèi)，在切去膠塊處參加低熔點(diǎn)瓊脂糖膠，待其凝固后將其留神放回電泳槽連續(xù)進(jìn)展電泳。留神低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠塊與原回收膠塊的交界面易斷裂 *待目的帶完全進(jìn)入低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，在長波紫外燈下用清洗過的刀片切下含有所需DNA帶的凝膠條，置于的滅菌過的1.5mLEppendorf管中,加300uL TE。65水浴10min或

16、更長使膠塊完全溶化。馬上參加等體積(300-350uL)Tris-Cl飽和酚pH8.0,搖擺混勻。(7)12022rpm離心5min。(8)留神將水相移置另一1.5mLEppendorf管中，參加等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖擺混勻。* 留神不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時寧愿放棄一些上層水相 * (9)12022rpm離心5min。(10)留神將水相移置另一1.5mLEppendorf管中，參加2.53倍體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。* 留神不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時寧愿放棄一些上層水相 * (11)置液氮3分鐘，取出后可于-20放幾分鐘。留神防止管子爆裂。(12)12022rp

17、m離心10min?？焖贄壣锨?，一般在管底會有針尖大小的沉淀物，留神用無水乙醇后清洗后置于恒溫器上枯燥(55)510min至無乙醇?xì)馕?，再參?0uLddH O溶解。2取2uL電泳定量后20儲存?zhèn)溆谩? 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *小量膠回收DNA片段試劑盒操作見操作手冊將已電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物或其它產(chǎn)物在適宜濃度的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)展電泳。要換用的電泳緩沖液，即1TAE *當(dāng)溴酚藍(lán)跑到肯定距離后(至少2cm以上)在長波紫外燈下觀看，用清洗過的刀片切 取含目的DNA的瓊脂糖凝膠，盡可能小，置于一的已滅菌過的1.5mlEppendorf管?；厥漳z下要墊一個的塑料手套防止污染 *每100mg

18、凝膠參加300uL/450uL S1液，55OC溫育10min，每2min顛倒一次。務(wù)必完全溶解 *參加1/3 體積(100uL/150uL)異丙醇，混勻，55OC，溫育1min。(5)將混合液移入吸附柱，高速(10000rpm)離心1min，棄去收集管液。(6)往吸附柱中參加450ul W1，靜置1min，高速離心15sec，棄去收集管液。(7)重復(fù)步驟6一次，但無需靜置。棄去收集管液后再高速離心1min。將吸附柱放于一干凈的已滅菌的1.5mlEppendorf管，在吸附膜中心滴入3040ul T1 液或ddH O，室溫靜置1min，當(dāng)用ddH O溶解時可在37OC置5min。22高速離心1

19、min，棄去吸附柱。取2uL電泳定量后20儲存?zhèn)溆谩? 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *無水乙醇沉淀回收：將已確定的可回收產(chǎn)物溶于加有 300uL 1TE緩沖液的滅菌過的 1.5mLEppendorf 管。參加等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖擺混勻。(3)12022rpm離心5min。(4)留神將水相移置另一滅菌過的1.5mLEppendorf管中，參加2.53倍體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。* 留神不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時寧愿放棄一些上層水相 * (5)置液氮3分鐘，取出后可于-20放幾分鐘。留神防止管子爆裂。 (6)12022rpm離心10min?？焖贄壣锨澹话阍诠艿讜嗅樇獯笮?/p>

20、的沉淀物，留神用無水乙醇后清洗后置于恒溫器上枯燥(55)510min至無乙醇?xì)馕?，再參?0uLddH2O溶解。取2uL電泳定量后20儲存?zhèn)溆谩? 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *連接：一般連接：在滅菌過的0.5mLEppendorf管中參加以下成分混合：載體目的基因*10T4 Ligase Buffer T4 DNA連接酶ddH O2反響總體積0.51.5uL適量11.5uL1uL 適量1015uL*目的片段所需量(ng)=載體量(ng)目的片段長度3/載體長度(2)1416連接614小時。* 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *平端動態(tài)連接在滅菌過的0.5mLEppendorf管中參加以下成分混合:線

21、性化載體(平端酶SmaI/EcoRV/HincII處理目的片段10T4 Ligase Buffer相應(yīng)平端酶(SmaI/EcoRV/HincII)T4 DNA連接酶ddH2O反響總體積200ng適量* 2uL 58U10U適量20uL* 目的片段所需量(ng)=載體量(ng)目的片段長度3/載體長度25(SmaI) 或 37(EcoRV/HincII) 作用 34 小時，將內(nèi)切酶及連接酶滅活后轉(zhuǎn)化。做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *轉(zhuǎn)化質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化：依據(jù)需要，從超低溫冰箱中快速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中10min 以上，并請注明取出的日期時間。不要取出后馬上使用或使用已放置 6hr以

22、上的感受態(tài)細(xì)胞。在超凈工作臺內(nèi)取一轉(zhuǎn)化用1.5mlEppendorf管，先吸取20uL感受態(tài)細(xì)胞，再參加質(zhì)粒(假設(shè)質(zhì)粒濃度大，只要槍頭蘸一下即可，假設(shè)低可取12uL用于轉(zhuǎn)化)與之混合，混勻后冰浴15min。* 留神不要污染 * (3)42熱休克90120sec，取出快速置冰浴中2min。(4)參加200uL LB培育基無抗性,37振蕩培育15-30min。(5)取相應(yīng)抗性的平板置于37預(yù)熱。(6)振蕩培育1530min后取100uL菌液涂板。 (7)37培育適當(dāng)時間(菌株不同，培育溫度和時間均有不同)。通常DH5菌株培育1214hr;JM101 78hr;ER2566 1012hr；BL21

23、9-11hr GI724 30培育2024hr(IMC平板)* 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *連接物轉(zhuǎn)化：依據(jù)需要，從超低溫冰箱中快速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中15min 以上,并請注明取出的日期時間。不要馬上使用或使用已放置 6hr以上的感受態(tài)細(xì)胞。在超凈工作臺內(nèi)取一轉(zhuǎn)化用1.5ml Eppendorf管，吸取40uL感受態(tài)細(xì)胞和5uL連接物混合，混勻后冰浴30min。留神不要污染 * (3)42熱休克90120sec，取出快速置冰浴中2min。參加360uL LB培育基無抗性，37振蕩培育4060min。* 假設(shè)連接物需用藍(lán)白斑來鑒定，則在菌液涂板前30min，需預(yù)先在平板上

24、均勻涂布上適當(dāng)濃度的X-gal與IPTG，并在37中正放30min。*取相應(yīng)抗性的平板置于37預(yù)熱。(6)振蕩培育4060min后涂布平板。(7)37培育適當(dāng)時間(菌株不同，培育溫度和時間均有不同)。通常DH5菌株培育1214hr;JM101 78hr;ER2566 1012hr；BL21 9-11hr GI724 30培育2024hr(IMC平板)* 做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *制一般固體培育平板：固體瓊脂培育基的配制：本試驗室常用的是LB固體瓊脂平板，濃度為1.5%，即在100mL LB液體培育基中參加1.5g的瓊脂，滅菌后可使用。使用時取一瓶滅過菌的固體瓊脂培育基，放在電爐上留神煮化。在

25、電爐上煮化時肯定要留神看管，防止其暴沸 *有時會有局部固體瓊脂沉積在瓶底，在煮化時要留神不要煮焦 * (3)將固培冷卻至4560，在超凈工作臺內(nèi)按比例參加需要的抗生素，混勻。固培煮化后，可在流水下冷卻，但須留神玻璃會卒冷爆裂 *當(dāng)冷卻至手摸不燙時即可，冷卻過頭易于凝固 *在超凈工作臺內(nèi)按比例參加需要的抗生素，混勻后，將培育基倒入已滅菌過的平皿內(nèi)，厚度適當(dāng)。培育基不要倒太厚，一般35mm即可，也不要過薄，涂板時易涂破 * (5)平皿可正放在超凈工作臺內(nèi)，待其冷卻凝固后使用或放入冰箱4儲存?zhèn)溆?。在放入冰?前，要在平板上標(biāo)記清楚所加的抗生素 *做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *涂板：假設(shè)所要使用的平板儲

26、存于冰箱4，則使用前須預(yù)先取出放在室溫或37中預(yù)熱一段時間。取用平板時肯定要留意抗性 *平板預(yù)熱時最好倒置 *在超凈工作臺內(nèi)用槍將所要涂布的菌液移入平板。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一般只要涂100uL左右的菌液，連接物涂200400uL *將涂布器先在酒精燈的外焰上灼燒，再浸入乙醇中，取出后再通過燈焰，燃盡其上的乙醇，待其冷卻前方可使用。如平板的蓋子內(nèi)面上覆有水珠，可用于冷卻涂布器 *涂板時不要心急，肯定要等涂布器充分冷卻前方可使用 *用涂布器將平板上的菌液涂布均勻，平板倒置放在培育箱中培育，除 GI724(30) 外，其它菌株均在37中培育。做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *挑菌：待平板上的菌落長至足夠大即到達(dá)可挑

27、的水平。在超凈工作臺中，在滅菌過的試管內(nèi)倒入34mL滅菌過的培育基，培育基依據(jù)需要預(yù)先參加抗生素(由菌落所攜帶的質(zhì)粒上的抗性基因打算)?？股匾幢壤齾⒓优嘤?，并要加了抗生素的培育基上做清楚標(biāo)記，沒有用完的培育基要封好放入冰箱4，不要放在外面 *請盡量使用冰箱內(nèi)已加好抗生素的培育基 *用鑷子夾取滅菌過的牙簽挑取平板上的單菌落，在試管內(nèi)的培育基中蘸洗幾下，旋緊管蓋后再將牙簽丟棄于超凈臺外的收集桶內(nèi)，并請您扔準(zhǔn)。挑菌時不提倡將牙簽直接投入培育基中 *挑菌時肯定要挑清楚正常的單菌落 *挑過菌的牙簽肯定不能留在超凈工作臺中 *挑菌后請將裝滅菌牙簽的小燒杯封好，并準(zhǔn)時將工作臺清理干凈。接種過菌落的試管

28、放在搖床中在適宜溫度下?lián)u動培育，搖速一般170230r/min。試管要在搖床放好，有適當(dāng)?shù)膬A斜角度(45。左右) *要留意不同的菌株和搖菌目的，可能需要不同的溫度和搖速。*做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K 法)：將血清裝入的滅菌過的 1.5mL Eppendorf 管，每管 200uL。使用血清，尤其是未滅活的血清時要留意安全，不要污染環(huán)境 *一旦發(fā)生血清污染環(huán)境，請馬上用84 消毒液處理 * (2)在每管中參加STE156uL10% SDS40uL100Pro-K4uL然后在 56中水浴 2-3 小時，每幾分鐘(一般 510min)輕輕搖擺混勻一次。管子肯定要認(rèn)真蓋

29、嚴(yán)，防止泄漏及外面的水進(jìn)入 *(3)參加 400uL 的酚-氯仿-異戊醇，搖勻后靜置幾分鐘(510min)，不宜猛烈。(4)12022rpm 離心 10min。(5)留神將上清取出，參加兩倍體積以上(780uL 即可)的無水乙醇和終濃度為 0.2M 的NaAc(40uL)，置于液氮中 3min。* 留神不要吸入中間的蛋白和下層的酚相 * (6)取出后可先置于-20中放 2 分鐘以防止管子爆裂。(7)12022rpm 離心 10min?？焖贄壢o水乙醇，再用無水乙醇洗一下(也可不洗)，最好用滅菌槍頭吸干管內(nèi)液體 *在恒溫器(55)枯燥 5min 左右至無乙醇?xì)馕叮賲⒓?20uLddH2O 溶解

30、。-20儲存?zhèn)溆?。使用時不要頻繁的反復(fù)凍融操作過程中要嚴(yán)防污染 *做完試驗請準(zhǔn)時整理試驗臺 *哺乳動物細(xì)胞單克隆株分別：把轉(zhuǎn)染 72hr 后的細(xì)胞從六孔板中的用Verson 液消化洗下，經(jīng)稀釋后轉(zhuǎn)入 50mL 螺口玻璃培育瓶中培育，待細(xì)胞生長至根本貼壁時再參加含作用濃度為 400ug/mL G418 的完全培育基連續(xù)培育。以 23 天為間隔換液，如此培育一星期后可觀看到有大量細(xì)胞死亡，相應(yīng)降低G418 壓力連續(xù)培育 23 星期后，可觀看到有細(xì)胞克隆形成。將已形成細(xì)胞克隆的培育瓶置于顯微鏡下，觀看克隆的位置，并用記號筆將其標(biāo)出。(3)用鑷子夾取滅菌過的小濾紙片，在 Verson 中蘸濕后將其掩蓋

31、 在細(xì)胞克隆上，520s后取出在加有完全培育基(600uL/孔)的 24 孔板中刷洗數(shù)次，將附著上的細(xì)胞洗下。將轉(zhuǎn)移有細(xì)胞克隆的 24 孔板置于 5%CO 培育箱中 37進(jìn)展培育。2待 24 孔板中的細(xì)胞生長并到達(dá) 80%以上滿底后，分別取細(xì)胞培育上清進(jìn)展ELISA 檢測。將經(jīng)檢測可表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入50mL 螺口培育瓶中連續(xù)培育，并在適當(dāng)?shù)臅r候進(jìn)展傳代換液，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)展進(jìn)一步的鑒定。常用溶液、培育基配制LB培育基:每 1000mL 加分析純NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH 調(diào) pH 至 7.4(1000mL 一般加 450ul)，高壓蒸汽滅菌 15min 冷卻后使用。固體培育基:LB 培育基中參加瓊脂至 1.5，高壓滅菌后使用。溶液I:葡萄糖 50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。溶液II:NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用 ddH2O 現(xiàn)配現(xiàn)用。溶液:取 5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸 11.5mL，混合后加 ddH2O 至 100mL。0.1m