高效液相色譜法湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)儀器部分課件

1、第十二章 高效液相色譜法分析化學(xué)（儀器分析部分） 12-1 高效液相色譜特點與儀器12-1-1 流程12-1-2 特點與應(yīng)用12-1-3 主要部件12-2 基本原理與主要分離類型12-3 固定相與流動相 12-3-1 液相色譜固定相 12-3-2 液相色譜流動相12-4 影響分離的因素12-5 離子色譜法12-6 超臨界色譜 12-6-1 超臨界流體色譜的特點與原理 12-6-2 超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程 12-6-3 超臨界流體色譜的應(yīng)用目 錄12-1 高效液相色譜特點與儀器12-1-1 流程12-1-2 特點與應(yīng)用1. 高效液相色譜法的特點 特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及

2、生化試樣的高效分離分析方法。2. 高效液相色譜法的應(yīng)用化合物的分離、鑒定、純化以及定量。 溶質(zhì)在液體中的擴散系數(shù)比氣體中約小105倍 液體粘度比氣體約大102倍 液體表面張力比氣體約大104倍 液體密度比氣體約大103倍 液體不可壓縮(2) 梯度淋洗裝置外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：(3) 進樣裝置(5) 液相色譜檢測器 a. 紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分

3、有機化合物有響應(yīng)。 特點： 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容積 8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 b. 光電二極管陣列檢測器 紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。c. 示差折光檢測器 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；d. 熒光檢測器 高

4、靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；激光誘導(dǎo)熒光(LIF)Laser Induced Fluorescence體積小，適合毛細(xì)管柱e. 電學(xué)和電化學(xué)檢測器： 安培檢測器、電導(dǎo)檢測器、庫侖檢測器、介電常數(shù)檢測器、極譜檢測器12-2 基本原理與主要分離類型1. 液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子

5、質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器 可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。稠環(huán)芳烴的分析 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器3. 離子交換色譜ion-exchange chromatogra

6、phy 固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。5. 離子對色譜 ion pair chromatography 原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流

7、動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配； 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子； 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+ X -后；在兩相間分配。 固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死

8、體積前出峰； 可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 6. 尺寸排斥色譜size- exclusion chromatography7. 親和色譜 Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。1. 液-固吸附分離固定相 種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5-10m；2. 液-液分配及離

9、子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體：由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體） 30-40m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1-2m的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；12-3 固定相與流動相12-3-1 液相色譜固定相（3）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN化學(xué)鍵合固

10、定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊； 耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫； 存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主； 4. 尺寸排斥分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機

11、械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。5親和色譜固定相Si-OHSi-OHOCNBrOSi-OHSi-O-CN+NHHOSi-OHSi-O-CHN(=NH)鏈霉親和素+生物素- 5 - (A)10GTATCACGAGGCCCTATGCG-33. 流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四

12、氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)4. 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。12-4 影響分離的因素1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中

13、的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。 2. 流速 流速大于0.5 cm/s時, Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。 3. 固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。

14、但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。4. 液相制備色譜 獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱（內(nèi)徑8mm，長度15 30cm），一次制備量.1mg；色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量； 對制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量； 超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。液相制備色譜的方法收集組分時，通常有以下情況： （1）可獲得良好分離，主峰 使用制備柱，超載提高效率； （2）兩主成分之間的小組分； 超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再

15、次分離制備。 以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象, 在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速發(fā)展。 傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。12-5 離子色譜法1. 離子色譜法原理 離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測器，快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。2. 離子色譜具有以下優(yōu)點（1）分析

16、速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；（2）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.010.05毫摩爾/克干樹脂。非抑制型: 當(dāng)進一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.0070.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。3. 離子色譜裝置離子色譜連續(xù)抑制裝置圖4 離子色譜的應(yīng)用陰離子分析: 雙

17、柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3250mm), 流動相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在350 ppm。1.概述 超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點:（1）可處理高沸點、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。12-6 超臨界色譜Supercritical Fluid Chromatograph12-6-1 超臨界流體色譜的特點與原理

18、2. 超臨界流體性質(zhì)（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數(shù)位于兩者之間。（2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。3.原理 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30

19、倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響小； 壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。 CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.09.0106 Pa，則： C16H34的保留時間 25min 5min。程序升壓HPLC與SFC比較1.結(jié)構(gòu)流程 12-6-2 超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程2.主要部件（1）SFC的高壓泵 無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量； （2）

20、SFC的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱； SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；（3）流動相 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3。CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；可加少量甲醇等改性；（4）檢測器 可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m 63m i.d. 毛細(xì)管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO2 ；柱溫：120 C； 程序升壓；12-6-3 超臨界流體色譜的應(yīng)用2.甘油三酸酯的分析

21、 四種組分僅雙鍵數(shù)目和位置不同，難分離； 色譜柱：DB-225 SFC毛細(xì)管柱； 流動相： CO2 ；從15MPa程序升壓到27MPa；2.5hr完全分離。目標(biāo) DNA附 錄 分子信標(biāo)核酸探針的合成與純化 分子信標(biāo)是個呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)、設(shè)計十分巧妙的短鏈DNA分子。由于它特殊的結(jié)構(gòu)，自從1996年被首次合成出來以后，它已經(jīng)被非常廣泛地應(yīng)用于PCR定量、基因分型、基因芯片、活細(xì)胞內(nèi)mRNA分析以及蛋白質(zhì)（酶）研究等領(lǐng)域。步驟： 采用固相合成法合成核酸探針； 利用HPLC對粗產(chǎn)物進行純化； 利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀對產(chǎn)物進行表證； 對產(chǎn)物進行雜交實驗來驗證其性能。采用固相合成法合成核酸探針POLYGEN 10 column DNA合成儀利用HPLC對粗產(chǎn)物進行純化EquilibrationSample applicationElutionRegenerationKTA purifier高效液相色譜儀色 譜