反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

1、反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展反義核酸是指能與特定RNA準(zhǔn)確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)1-3。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribzyes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)節(jié)作用因子，在抑制一些有害基因的表達(dá)和失控基因的過度表達(dá)上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的開展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點(diǎn)作一簡(jiǎn)要概述，著重闡述其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。1反義核酸的作用原理反義核酸目前有三種來源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡

2、聚核苷酸(antisenseligdexynletides，AN)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AN和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(P)和甲基化等修飾AN二類，其中以PSAN應(yīng)用最廣泛。AN設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)單，只要其順序與靶RNA局部順序互補(bǔ)即可，而對(duì)基因的讀碼框無要求；二是更具有實(shí)用價(jià)值的工人表達(dá)載體，包括單個(gè)基因和多個(gè)基因的結(jié)合反義表達(dá)載體3，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，通過轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前別離純化尚存在困難。1.1反義RNA和反義DNA反義RNA是指能和RNA完全互補(bǔ)的一段小分子RNA

3、或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過RNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用10：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過與靶RNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與RNA結(jié)合，另一方面其與RNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribzye，降解RNA3；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的RNA鏈延長(zhǎng)3。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后RNA的加工修飾，如5端加帽、3端加尾(plya)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟RNA由細(xì)

4、胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸。1.2核酶eh等發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過程中，可準(zhǔn)確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱之為核酶11,12。核酶廣泛存在于生物細(xì)胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種構(gòu)造。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區(qū)組成13。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補(bǔ)結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)那么可通過降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過程中并不消耗。核酶裂解分子依賴嚴(yán)格的空間構(gòu)造形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：、U、A)下游方向即3端12。核酶除天然存在外，也可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點(diǎn)、靶RNA周圍的序列和核酶

5、本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計(jì)合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達(dá)，特別是阻斷有害基因的表達(dá)成為可能。假如靶RNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達(dá)載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶RNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有非常誘人的前景，第一個(gè)應(yīng)用核酶進(jìn)展艾滋病基因治療的臨床方案已獲準(zhǔn)，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。2反義核酸的作用特點(diǎn)反義核酸作為基因

6、治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)。1)高度特異性：反義核酸藥物通過特異的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導(dǎo)彈。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變?nèi)f化，不可窮荊3)高效性：直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的天然順序信息，實(shí)際上是最合理的藥物設(shè)計(jì)。5)低毒、平安：反義核酸尚未發(fā)現(xiàn)其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長(zhǎng)有短，但最終都將被降解消除，這防止了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險(xiǎn)性。3反義核酸技術(shù)在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用反義核酸技術(shù)的飛速開展和成熟，使其逐

7、漸浸透并應(yīng)用到寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，豐富和開展了寄生蟲病的基因治療策略。反義核酸技術(shù)在抗寄生蟲病研究的應(yīng)用主要集中于原蟲類，如瘧原蟲、錐蟲和利什曼原蟲等，而且反義核酸中又以AN方面的報(bào)道最多。下面著重就AN在寄生蟲方面的研究應(yīng)用作用一簡(jiǎn)要闡述。3.1瘧原蟲瘧原蟲嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即無從頭合成途徑，依靠補(bǔ)救合成途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷。瘧原蟲的二氫葉酸復(fù)原酶(dihydrflateredutase，DHFR)和胸苷酸合酶(thyidylatesynthase，TS)結(jié)合形成雙功能蛋白(DHFR-TS)，這對(duì)于維持瘧原蟲四氫葉酸程度和DNA合成極為重要14，此酶也是瘧原蟲脫氧胸苷酸生物合成

8、唯一通路中必不可少的酶?？汞懰幹械目谷~酸代謝藥如乙胺嘧啶，就是通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制DHFR-TS來阻斷蟲體脫氧胸苷酸生物合成15。然而，隨著惡性瘧原蟲(Plasdiufaliparu)多藥抗性株的出現(xiàn)和廣為傳播，瘧疾的化療面臨重大挑戰(zhàn)，促使人們尋求新的抗瘧療法。目前，DHFR-TS是AN抗瘧作用首選靶基因。生物大分子進(jìn)入感染紅細(xì)胞中的瘧原蟲，必需穿透三層膜，即紅細(xì)胞膜、納蟲泡膜和蟲體的胞質(zhì)膜。研究說明，不能穿透紅細(xì)胞膜和納蟲泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗體和蛋白A等，可經(jīng)過納蟲微管(parasitphrusdut)進(jìn)入蟲體，蟲體通過胞吞作用直接從細(xì)胞外攝入大分子物質(zhì)16。因此，對(duì)于小分子的AN而

9、言，作用于感染紅細(xì)胞中的蟲體完全成為可能，下述眾多研究已充分證明了這一點(diǎn)。Rapaprt等(1992)研究發(fā)現(xiàn)17，以DHFR-TS為靶21ntPSAN能選擇性地進(jìn)入惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞，對(duì)體外培養(yǎng)的氯喹敏感株和耐藥株蟲體具有同等的抑制效果，而未感染瘧原蟲的紅細(xì)胞那么完全為不攝入AN，因此這對(duì)應(yīng)用反義核酸于抗瘧治療非常有利。諸多研究說明，AN越長(zhǎng)，對(duì)轉(zhuǎn)譯的抑制作用就越強(qiáng)；AN濃度越高，非特異性抑制作用越明顯，在低濃度時(shí)那么呈特異性抑制。Sartrius和Franklin(1991)以DHFR-TS的RNA為靶合成系列AN，利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，討論AN對(duì)體外轉(zhuǎn)譯的抑制作用18。在DHFR翻

10、譯起始位點(diǎn)處合成了6條2149nt不等長(zhǎng)的AN，在TS編碼區(qū)全成的30nt、39nt和49nt三條AN。當(dāng)AN長(zhǎng)度為30nt或更長(zhǎng)時(shí)，呈明顯轉(zhuǎn)譯抑制作用，抑制率可高達(dá)50以上。其中，TS編碼區(qū)的49ntaN(TS49)抑制效果最高，當(dāng)濃度在45l/L時(shí)的抑制率幾乎達(dá)90，主要是因?yàn)門S49與DHFR-TS靶RNA結(jié)合抑制TS合成，這從翻譯產(chǎn)物的分子量(55kDa)要比天然DHFR-TS(71kDa)小且無TS活性可看出。Raasay等和lark等研究說明，在較高濃度下，無論DHFR-TS正義還是反義的寡聚核苷酸(1K，2K)，均能抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞19,20。究其原因，可能與高濃度的AN帶有

11、較多的負(fù)電荷有關(guān)。Kanagaratna等(1998)分析了瘧原蟲裂殖子外表蛋白基因的反義和正義寡聚核苷酸對(duì)瘧原蟲體外生長(zhǎng)的影響21，無論AN單獨(dú)使用抑或與脂質(zhì)體混合使用，均未觀察到特異抑制效應(yīng)。但在一樣濃度范圍內(nèi)，反義和正義寡核苷酸以及具有多聚陰離子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞。當(dāng)寡聚核苷與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后負(fù)電荷被中和時(shí)，那么對(duì)裂殖子入侵紅細(xì)胞的抑制作用被取消。由此推測(cè)，寡聚核苷酸有可能借助其多聚陰離子特性干擾裂殖子與細(xì)胞上受體結(jié)合，多聚陰離子可能對(duì)瘧疾病治療有幫助。3.1.2AN不同修飾物對(duì)抗瘧作用影響最近，Barker等以DHFR-TS基因?yàn)榘?，比較了硫代磷酸酯化(PS)、磷

12、酸二酯化(P)和甲基化修飾AN，以及不同空間構(gòu)造AN對(duì)體外培養(yǎng)蟲體生長(zhǎng)抑制作用22。結(jié)果顯示，5和3端至少含有3個(gè)PS基因的P-PS雜合體AN、全部為PS修飾的AN，與局部PS修飾的AN抑制作用一樣。在低濃度下(1l/L)，P-PSaN和PSAN比PS-甲基化AN抑制率高25。此外，通過延長(zhǎng)AN序列增加干-環(huán)構(gòu)造形成，進(jìn)步AN的自我穩(wěn)定性，結(jié)果獲得2個(gè)有干-環(huán)構(gòu)造的AN(RB39、RB41)，其抑蟲生長(zhǎng)率比序列未延長(zhǎng)的AN約要高20。3.1.3AN不同靶基因?qū)汞懽饔糜绊慉N對(duì)不同基因的抑制作用不一致，這和該基因在蟲體代謝過程中是否起舉足輕重作用親密相關(guān)14。AN的抗瘧研究主要集中在DHFR-

13、TS基因，這固然與其在瘧原蟲核苷酸代謝中的特殊地位有關(guān)(見前述)。Barker等(1996)對(duì)惡性瘧原蟲耐藥株多個(gè)靶基因的AN作用進(jìn)展了比較研究23，方法是將PSaN參加到瘧原蟲體外培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時(shí)后，通過鏡檢和3氚-次黃嘌呤摻入試驗(yàn)觀察AN對(duì)蟲體的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果說明，抑制作用與AN濃度親密相關(guān)。當(dāng)AN濃度為1l/L時(shí)，AN呈非特異性抑制；當(dāng)濃度在0.50.005l/L范圍時(shí)，以DHFR-TS、二氫喋呤合成酶、核苷酸復(fù)原酶、裂殖體多基因家族和紅細(xì)胞結(jié)合抗原-175為靶的PSaN與對(duì)照組相比，均能特異地顯著抑制蟲體生長(zhǎng)(P0.0001)，而DNA聚合酶的PSaN抑制作用更弱，磷酸丙糖異

14、構(gòu)酶的PSAN抑制作用那么與對(duì)照組一樣。瘧原蟲感染紅細(xì)胞中，近75血紅蛋白被滋養(yǎng)體降解而形成大量對(duì)蟲體有害的血紅素，必須在消化泡中聚集成對(duì)蟲體無毒的瘧色素24,25。研究說明，惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRP和HRP有明顯的促進(jìn)瘧色素形成功能26。因此，如能特異阻斷這些基因表達(dá)，抑制瘧色素的形成，有可能使之成為一種抗瘧新途徑。HRP與HRP從同一祖先基因分化而來，二者高度同源，翻譯起始位點(diǎn)附核苷酸序列那么完全一樣27,28。3.2錐蟲屬于動(dòng)基體目的布氏錐蟲(TrypansaburEi)通過抗原不斷變異逃避宿主的免疫力，抗原變異是由于不同的變異體專一外表糖蛋白(variant-s

15、peifisurfaeglyprtein，VSG)基因呈連續(xù)表達(dá)所致，VSG基因表達(dá)產(chǎn)物在錐蟲外表形成外膜，覆蓋蟲體29,30。研究說明，VSGRNA可分為二局部31,32：一局部是各種變異體特有的主外顯子序列，占主要局部；另一局部是共同的5端小外顯子序列，通常為35個(gè)核苷酸長(zhǎng)，幾乎所有的VSGRNA均含有此序列。實(shí)際上，除VSG外，錐蟲的鈣調(diào)蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶RNA中也存在共同的5端小外顯子序列，這似乎是動(dòng)基體目寄生原蟲編碼基因的共同構(gòu)造特征32。由于宿主RNA無這種小外顯子序列，以小外顯子序列為靶的AN就很容易實(shí)現(xiàn)抑制眾多基因表達(dá)的效果，使反義核酸抗錐蟲感染成為可能。rneli

16、ssen等應(yīng)用麥胚提取物轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)、35S-甲硫氨酸摻入試驗(yàn)和蛋白質(zhì)SDS方法33，對(duì)與錐蟲小外顯子序列不同位點(diǎn)互補(bǔ)和不同長(zhǎng)度的AN體外轉(zhuǎn)譯抑制作用進(jìn)展了比較分析。結(jié)果所有AN均能抑制轉(zhuǎn)錄，且抑制程度與AN長(zhǎng)度和濃度有關(guān)，AN越長(zhǎng)，濃度越高那么抑制作用越強(qiáng)。如3個(gè)12nt和AN抑制率達(dá)3560，而22nt和34ntaN在濃度為1530l/L時(shí)對(duì)錐蟲總RNA轉(zhuǎn)錄抑制率高達(dá)95100。在同一轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，BV病毒(BresaiVirus)和無小外顯子序列的錐蟲磷酸甘油酸激酶RNA卻完全不受34ntAN的抑制，與錐蟲小外顯子序列不互補(bǔ)的18ntAN對(duì)錐蟲轉(zhuǎn)譯那么無任何影響。上述發(fā)現(xiàn)充分證明，以錐蟲5端小

17、外顯子RNA序列為靶的AN對(duì)轉(zhuǎn)譯具有特異抑制作用。alder等用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，也獲得上述相類似的結(jié)果31。Verspieren等研究說明34，小外顯子AN的二級(jí)構(gòu)造和堿基的修飾會(huì)直接影響其與靶RNA的親和性，從而間接影響AN的轉(zhuǎn)譯抑制效果。如上述與小外顯子第2位至第13位堿基互補(bǔ)的12ntaN，雖然抑制布氏錐蟲轉(zhuǎn)譯，但不能抑制活動(dòng)錐蟲(Trypansavivax)RNA轉(zhuǎn)譯，這顯然與二種蟲體的小外顯子第3位和第7位堿基不同有關(guān)。Verspieren等首次嘗試用吖啶衍生物(aridinederivative)修飾布氏錐蟲5端小外顯子序列的AN，觀察其對(duì)培養(yǎng)蟲體的殺傷作用35。結(jié)果說明，連

18、接有吖啶分子的9ntaN與一樣長(zhǎng)度但未連接吖啶分子的AN相比，能更為有效地抑制錐蟲蛋白質(zhì)的體外合成，且能有效地殺死體外培養(yǎng)蟲體。無論如何，未連接吖啶的9ntaN和雖連接吖啶但不與錐蟲5端小外顯子序列互補(bǔ)的9ntAN，均不能殺死培養(yǎng)蟲體。AN經(jīng)吖啶修飾后能進(jìn)步其殺錐蟲作用，推測(cè)可能與下述因素有關(guān)：一是通過吖啶修飾增加AN與靶RNA間的親和力，二是進(jìn)步對(duì)3端核酸外切酶的抗性，延長(zhǎng)其作用半衰期，三是促進(jìn)AN對(duì)活細(xì)胞膜的穿透。因此，對(duì)AN進(jìn)展吖啶修飾進(jìn)步其作用效率值得研究借鑒。3.3利什曼原蟲利什曼原蟲(LEishania)屬動(dòng)基體目寄生原蟲，其所有RNA的5端也均含有一共同的由35個(gè)核苷酸組成的小外

19、顯子(5-A-GUAUAUAAGUAUAGUUUUGUAUUUAUUG-3)，這為AN提供了極好的作用靶位37。Raazeilles等研究說明38，以小外顯子為靶的16ntPSAN(5-TGAT-GTTATATAG-3)能選擇性地殺死培養(yǎng)鼠巨噬細(xì)胞中無鞭毛體，而對(duì)宿主巨噬細(xì)胞無損害。當(dāng)16ntpSAN濃度為10l/L時(shí)，約30感染巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)后24小時(shí)好轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步進(jìn)步細(xì)胞對(duì)AN的攝入，將16ntpSAN與軟脂酸連接，并與人的低密度脂蛋白(LDL)混合，用于體外感染巨噬細(xì)胞測(cè)試。結(jié)果說明，當(dāng)濃度約為10l/L時(shí)，與LDL結(jié)合的16ntpSAN使415細(xì)胞治愈，而未結(jié)合LDL的16ntPSAN

20、只有254細(xì)胞治愈，推測(cè)LDL可能有利于細(xì)胞對(duì)AN的內(nèi)吞作用。與上述結(jié)果相似，haudhuri等報(bào)道以5端小外顯子序列為靶的17ntpSAN(5-TGATATTATATAGG-3)同樣能選擇性地高效殺死培養(yǎng)鼠感染巨噬細(xì)胞中的無鞭毛體，須對(duì)巨噬細(xì)胞無任何損傷38。為促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)17ntpSAN的攝取，haudhuri很巧妙地利用受體介導(dǎo)技術(shù)將AN特異呈遞到靶作用位點(diǎn)。由于哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞豐富的凈化受體(savengerreeptr)39,40，這些受體能特異結(jié)合并降解經(jīng)修飾的LDL，且與牛血清白蛋白(BSA)人工配體有很高的親和力，災(zāi)樣為AN特異作用于巨噬細(xì)胞創(chuàng)造了條件41。首先是用BSA覆蓋

21、已包裹17ntpSAN的脂質(zhì)體，后者通過BSA配體與巨噬細(xì)胞上凈化受體特異結(jié)合，攝入巨噬細(xì)胞內(nèi)后，隨著脂質(zhì)體的降解，AN即被釋放出來。利用這種受體介導(dǎo)呈遞技術(shù)，大大進(jìn)步了AN作用效果。在17ntpSAN濃度為10l/L時(shí)，有BSA和脂體包裹的AN能在5小時(shí)內(nèi)殺死90以上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的蟲體，而未進(jìn)展上述包裹的AN殺蟲率只有20。不難看出，這種由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為反義RNA定向轉(zhuǎn)運(yùn)提供了可靠運(yùn)載工具，它可將反義RNA定向、高效、低毒和平安地運(yùn)送到靶細(xì)胞中充分發(fā)揮作用，防止了細(xì)胞外降解、非特異性攝入和平安性等問題，無疑是非常有前景的開展方向41,42。Herauf等成功地應(yīng)用反義核酸技術(shù)分析環(huán)孢多

22、肽A(ylsprina，sA)與環(huán)孢多肽A結(jié)合蛋白(ylphilin)二者在利什曼原蟲感染中互相作用機(jī)制43。在此之前，sA對(duì)利什曼原蟲的作用是通過宿主細(xì)胞中ylphilin還是蟲體是的ylphilin介導(dǎo)，始終未能明了。為此，Herauf首先從利什曼原蟲別離純化了2個(gè)分子量分另為20kDa和22kDa的ylphilin，并進(jìn)展了N端測(cè)序。有趣的是，盡管它們的酶活性均受到sA抑制，但用sA預(yù)處理后的利什曼原蟲對(duì)巨噬細(xì)胞感染率并未降低，由此看來sA不能與利什曼原蟲自身ylphilin結(jié)合。為此，作者利用反義核酸技術(shù)和動(dòng)物模型，首先合成針對(duì)鼠宿主巨噬細(xì)胞ylphilin的AN，并在感染蟲體前參加到

23、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)果巨噬細(xì)胞ylphilin的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)無鞭毛體的增殖均受到明顯抑制，充分證明宿主細(xì)胞ylphilin在蟲體的細(xì)胞內(nèi)增殖機(jī)制中發(fā)揮重要作用，首次說明宿主細(xì)胞ylphilin對(duì)細(xì)胞內(nèi)利什曼原蟲存活具有重要意義。3.4其它原蟲Ankri等利用反義RNA抑制溶組織內(nèi)阿米巴(entaebahistlytia)半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá)44，結(jié)果挑選并獲得一穩(wěn)定轉(zhuǎn)化蟲株，其半胱氨酸蛋白酶活性90被抑制。該轉(zhuǎn)化蟲株在Diand培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率正常，致細(xì)胞病變效應(yīng)和溶組織活性與對(duì)照組轉(zhuǎn)化蟲株一樣，但其吞噬作用那么明顯被抑制。4展望反義核酸在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用還剛剛起步，不可防止地碰地許多有待

24、解決的問題：1)目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅限于體外實(shí)驗(yàn)，多數(shù)處于體外培養(yǎng)程度，動(dòng)物模型和體內(nèi)的作用尚不得而知；2)現(xiàn)有研究多為AN，畢竟依賴人工合成，開展反義表達(dá)載體和ribzye于抗寄生蟲研究甚為必要；3)定向打靶問題。反義核酸如能專一地定向進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用，必將進(jìn)步其作用效果，開展諸如受體介導(dǎo)的定向轉(zhuǎn)移技術(shù)研究勢(shì)在必行?？傊捎诜戳x核酯具有許多其它藥物不可比較的特性，它在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用前景不可估量，特別是對(duì)于提示寄生蟲學(xué)中某些長(zhǎng)期懸而未決的機(jī)制具有很大潛力。隨著研究的不斷深化，當(dāng)人們成功地駕馭這種技術(shù)時(shí)，必將造福廣闊人類。參考文獻(xiàn)1IzantJGeintraubH.ell,1984;36(4)

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