QC七大手法基因工程項(xiàng)目復(fù)習(xí)歸納重點(diǎn)資料

1、基因工程復(fù)習(xí)歸納第一章 緒論1.基因工程的定義：是指按照人們的愿望，通過嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體/宿主）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳、并表達(dá)出新的性狀的技術(shù)。2.基因工程概念的進(jìn)展：遺傳工程DNA重組技術(shù)分子/基因克隆（Molecular/Gene基因工程基因操作。應(yīng)用領(lǐng)域以“基因工程”、“DNA重組”為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達(dá)出胰島素1982：世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989：我

2、國第一個基因工程藥物rhIFN1b上市2003: 世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒-p53上市3.基因工程的三大關(guān)鍵元件基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細(xì)胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達(dá)載體）。宿主（受體）：，能攝取外源DNA、并能使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞（組織、器官或個體）。4.基因工程的差不多步驟（切、接、轉(zhuǎn)、增、檢（大腸桿菌是中心角色）（1）目的基因的獵?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，通過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。 （3）重

3、組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。 （4）克隆鑒定：選擇轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?。 （5）目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。 第二章 DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1. 限制性核酸內(nèi)切酶(要緊存在于原核細(xì)菌中，關(guān)心細(xì)菌限制外來DNA的入侵)。限制性核酸內(nèi)切酶的功能與類型要緊特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識不序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點(diǎn)距識不序列1kb處

4、識不序列內(nèi)距識不序列下游24-26bp處其中II型限制性核酸內(nèi)切酶：切割位點(diǎn)專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。特點(diǎn)：1.識不、并切割雙鏈DNA分子中特異序列的DNA內(nèi)切酶。2.識不序列為4-6堿基對的回文對稱結(jié)構(gòu)（旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)）。3.單體蛋白、僅有限制性內(nèi)切酶活性，無甲基化酶活性。4.切割產(chǎn)物末端：5突出末端、3突出末端、平頭末端.6.最適溫度：大多為37,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。8.當(dāng)反應(yīng)條件不適合時(shí)，識不和切割序列發(fā)生變化（星號反應(yīng)）。星活性（star activity）：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識不序列相似的序列，那個改變的專門性稱星活性。引起星活性的因素：

5、 高濃度甘油（5%）、 酶過量（100U/mg）、 低離子強(qiáng)度（pH8.0)、 有機(jī)溶劑、 用其它二價(jià)陽離子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。 II型限制性核酸內(nèi)切酶的命名具體規(guī)則是：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前兩個小寫字母構(gòu)成酶的差不多名稱，假如酶存在于一種專門的菌株中，則將株名的一個字母加在差不多名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還需用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。酶名稱的最后部分為羅馬數(shù)字，表示在該生物體發(fā)覺此酶的先后次序。例子：Eschericha（屬名）coli（種名）R （質(zhì)粒）大腸桿菌R質(zhì)粒EcoR I EcoR V

6、Haemophilus（屬名） influenzae（種名） d（株名） 嗜血流感桿菌d株- H i n d II H i n d III。羅馬數(shù)字表示同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶。專門性質(zhì)的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識不位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同的不同來源的酶識不相同序列，如HindIII HsuI: A / AGCTT同尾酶：是指識不位點(diǎn)不同，但切出的片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。同尾酶的切割產(chǎn)物互為粘性末端，并能連接，但連接后二個酶的識不序列均被破壞。2.DNA連接酶（

7、T4-DNA連接酶）功能：體外連接片段常用的連接酶： 連接酶參與連接反應(yīng)的基團(tuán)：端羥基和端磷酸基團(tuán)，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的差不多性質(zhì) ：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵、修復(fù)RNA-DNA雜合分子中DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵、連接多個平頭雙鏈DNA分子T4 DNA連接酶的活性單位定義：在 20l 反應(yīng)體系中于 16 ，使 Hind 切過的 l DNA （300g/ml，0.123.DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）差不多性質(zhì)：1. 53的DNA聚合酶活性 2. 53的核酸外切酶活性 3. 35的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶 I 的差不多用途：1.切口

8、平移標(biāo)記法 2.Nick translation 3.制備32P標(biāo)記的探針。所有的DNA聚合酶中只有此酶有該反應(yīng)。缺口平移標(biāo)記原理見ppt。大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenow酶的差不多用途：1. 補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端 2.DNA片段的同位素末端標(biāo)記 3.cDNA第二鏈的合成 4.雙脫氧末端終止法測定DNA序列。T4-DNA聚合酶差不多特性：1.53的DNA聚合酶活性

9、和35的核酸外切酶活性(極強(qiáng)) 2. 在無dNTP時(shí)，能夠從任何3-OH端外切 3.在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位差不多用途：1.切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端，該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低專門多。2.DNA片段的同位素末端標(biāo)記。依靠于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）差不多用途：1. 以RNA為模板合成cDNA鏈 2.雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈4.核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（Exo）【特異性地從5 端外切】；單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶【降

10、解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）&大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）二、用于克隆的載體1. 載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體應(yīng)具備的條件： 1.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn) 3. 具有較高的外源DNA的載裝能力 4. 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識不切割位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn) ) 5. 具有合適的篩選標(biāo)

11、記 2.載體類型：（1）依照要緊用途能夠分為：克隆載體和表達(dá)載體克隆載體：要緊用于在大腸桿菌細(xì)胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建基因文庫。克隆載體關(guān)鍵元件：A.多克隆位點(diǎn) B.篩選標(biāo)記基因 C.復(fù)制起始位點(diǎn) = 2 * GB3 表達(dá)載體：除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達(dá)用的啟動子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達(dá)目的基因。（2）按傳代特性分：自主復(fù)制型載體：含復(fù)制子，可獨(dú)立于宿主染色體外復(fù)制與傳代（穿梭載體：裝有針對兩種不同受體的復(fù)制起點(diǎn)，便于基因克?。?。 = 2 * GB3 整合型載體：不含復(fù)制子，需借助同源重組機(jī)制整合于宿主基因組。3.分子克隆載體常用類型

12、：（1）質(zhì)粒：15kb以下 嚴(yán)緊型復(fù)制操縱的質(zhì)粒：1 - 5 拷貝，如pSC101 松弛型復(fù)制操縱的質(zhì)粒：30 - 50 拷貝，如 ColE1氯霉素?cái)U(kuò)增：在宿主菌生長的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成、關(guān)閉要緊代謝途徑，以使松弛型質(zhì)粒 迅速大量擴(kuò)增（可達(dá)上千拷貝）的操作。質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：分子量小，便于操作；易于構(gòu)建，可作為其他宿主系統(tǒng)載體的骨架；用途廣泛；缺點(diǎn)：裝載量?。ㄐ∮?0kb），不能用來克隆大片段。重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：pBR322：松弛型復(fù)制；氯霉素可擴(kuò)增；拷貝數(shù) 50 100 / cell；用于基因克隆。還有pUC18/19；T載體，詳見ppt，了解一下。實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三

13、種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法：質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染；堿裂解法（最常用）：質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間；沸水浴法：質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便。質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)操縱系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，可導(dǎo)致子代細(xì)胞質(zhì)粒組成不同，且這種差異具隨機(jī)性，通過若干代后宿主細(xì)胞中處于數(shù)量弱勢的質(zhì)粒必定被淘汰，而僅剩強(qiáng)勢質(zhì)粒。質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，有的細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒 DN拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。結(jié)

14、構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DN的重排與缺失。 阻礙質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的要緊因素新陳代謝負(fù)荷對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)；拷貝數(shù)差度對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的阻礙低差度-穩(wěn)定 / 高差度-不穩(wěn)定；寄主重組體系對質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)形成重組質(zhì)粒二聚體，便會以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖。（2）lamda噬菌體DNA:25kb噬菌體是大腸桿菌的和氣型噬菌體，由外殼包裝蛋白和l-DNA組成。DNA重組技術(shù)一般需要噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)-DNA是線性雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸。-DNA兩端各帶有一個12bp的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體感染細(xì)菌以后，

15、雙鏈DNA分子通過COS位點(diǎn)成環(huán)狀。插入型載體：改造后的長度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體1.cI基因失活：cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。2. Lac Z基因插入失活：在lac Z基因上有EcoR I位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）。 取代型載體：長度為40kb，在非必需區(qū)域有酶切位點(diǎn)，距離為14kb。載量為10-25kb。用取代型載體克隆外源DNA可能需要通過哪些步驟？第一，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化載體，除去基因組中可取代的DNA區(qū)段。第二，將上述所得的 DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對重組體的D

16、N A分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的重組噬菌體。-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：1. -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 2.-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 3.重組l-DNA分子的篩選較為方便 4. 重組-DNA分子的提取較為簡便 5. -DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因。cos質(zhì)粒：lamda DNA的cos區(qū)和質(zhì)粒組成的載體: 31-45 kb（3）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：1.能像-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞2.能像質(zhì)粒那樣在

17、受體細(xì)胞中自主復(fù)制 3.重組操作簡便，篩選容易 4. 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 5.不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞.（4）人工染色體載體人工染色體實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。細(xì)菌人工染色體（BAC）:50-300kb,要緊用于基因文庫構(gòu)建易于發(fā)生重組、缺乏穩(wěn)定性、制備工藝繁瑣酵母人工染色體（YAC）: 350-400kb，要緊用于基因文庫構(gòu)建克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu)&構(gòu)建動植物基

18、因文庫三、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（1）受體（宿主）應(yīng)具備的條件1.限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（hsdR-） 2. 重組整合缺陷型用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA- ， recB-，recC- ）3. 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 4. 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型 5. 感染寄生缺陷型防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外。（2）各種基因工程受體（宿主）的特性A. 大腸桿菌遺傳背景清晰，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定。適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、基因文庫的構(gòu)建和外源基因的高效表達(dá)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的要緊受體菌。產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素。B. 枯草芽孢

19、桿菌遺傳背景清晰，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。適用于重組蛋白與多肽、特不是微生物來源的酶的高效分泌表達(dá)。C.鏈霉菌抗生素的要緊生產(chǎn)者，相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素。遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢。要緊用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良。D. 酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清晰，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高。適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌。E. 昆蟲細(xì)胞（家蠶，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）具有真核生

20、物的特征，外源基因表達(dá)量高，生殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定。DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。適用于真核生物基因的高效表達(dá)。F. 哺乳動物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO）與人的親緣關(guān)系近，表達(dá)系統(tǒng)完善，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢。適用于哺乳類動物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的要緊哺乳動物受體。G . 植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉） 農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用。遺傳操作繁瑣。適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良。實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體（宿主）：大腸桿菌

21、；真菌：酵母菌（畢赤酵母，漢森酵母，啤酒酵母）&絲狀真菌（黑曲霉、青霉）；哺乳動物細(xì)胞 CHO （3）大腸桿菌轉(zhuǎn)化常用方法感受態(tài)（compentent )：受體(宿主）細(xì)胞通過一些理化或生物學(xué)方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生臨時(shí)性的改變，成為能同意外源DNA進(jìn)入的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞（compentent cell )CaCl2法原理Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與其形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)

22、菌細(xì)胞現(xiàn)在的狀態(tài)即為感受態(tài)。具體大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化詳見ppt。電轉(zhuǎn)化法 熱激法轉(zhuǎn)化率的定義：每微克DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌能獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)。例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017 / 2686X660），也確實(shí)是講，每3400個pUC18分子才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞。 另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個大腸桿菌細(xì)胞，也確實(shí)是講，每200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納pUC18 DNA。 不同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率：Ca2

23、+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105 106 / mg DNA -DNA轉(zhuǎn)染107- 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化106 109 / mg DNA 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定流程1、篩選選擇性平板篩選2、重組子初步鑒定顯色、PCR、比大小、酶切、分子雜交、生物/免疫學(xué)活性3、重組子確證DNA序列分析4、外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測僅當(dāng)外源基因克隆于特定表達(dá)載體和宿主中時(shí)才需要。常規(guī)基因克隆則否。轉(zhuǎn)化子篩選方法：抗藥性篩選法

24、；營養(yǎng)缺陷型篩選法；顯色篩選法lacZ基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等；DNA電泳檢測【直接電泳檢測法；限制性酶切圖譜法；PCR擴(kuò)增檢測法】；原位雜交法（高通量篩選）；DNA序列分析雙脫氧末端終止測序法；外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測法【聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS）；酶聯(lián)免疫吸附法ELISA；免疫印記（Western blotting）；蛋白質(zhì)生物功能測定法（高通量篩選）淀粉酶基因；原位免疫沉淀法（高通量篩選）；放射免疫原位雜交鑒定】四、基因克隆基因文庫：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。依照構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因

25、組文庫（含有全部基因）&cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）。在高度分化的生物體中cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫基因克隆常用方法：鳥槍法差不多策略：染色體DNA的切斷：超聲波處理片段長度均一，大小可控，平頭末端；全酶切片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控；部分酶切片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。與載體連接：假如轉(zhuǎn)化子采納菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；假如轉(zhuǎn)化子采納基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體。轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞假如轉(zhuǎn)化子采納菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；假如轉(zhuǎn)化子采納

26、基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。篩選含有目的基因的目的重組子：菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）。cDNA法差不多策略：【cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成（自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、）】/雙鏈cDNA的克隆 離目的基因（完備分離程序、特異分離程序、差異分離程序）PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，依照該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物差不多策略：由Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有一個非模板依靠型的突出堿基，而且那個堿基幾乎總是A，因?yàn)門aq DNA聚合酶對

27、dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即能夠采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也能夠使用專門的T載體克隆。化學(xué)合成法（全基因合成）基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?，f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小?；蛭膸斓臉?gòu)建程序1.基因組DNA的制備：2.基因組DNA的切割：用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采納超聲波處理和制性內(nèi)限切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證

28、DNA片段之間存在部分重疊區(qū)；第二，保證DNA片段大小均一。連接前，上述處理的DNA片段必須依照載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體3.載體和受體的選擇：出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的-DNA或考斯質(zhì)粒；關(guān)于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒；用于基因文庫構(gòu)建的受體則依照載體使用大腸桿菌或酵母菌。4.從基因文庫中篩選目的基因：能夠采納專門的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟。原位雜交法。第三章 大腸桿菌基因工程一、大腸

29、桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)1.遺傳背景清晰（4405個ORF），便于基因操作 2.表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定3.優(yōu)良的工業(yè)性能：生殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便 4. 被美國FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）2.胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機(jī)制（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善 3.細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素二、大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)原理大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的差不多元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因 B、轉(zhuǎn)錄元件：啟動子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)D、克隆元件：克隆位點(diǎn)、

30、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須） ：信號肽、融合肽外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)原理A、啟動子 (Promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。是基因表達(dá)最關(guān)鍵和最強(qiáng)的表達(dá)調(diào)控元件，啟動子的強(qiáng)弱對表達(dá)水平有決定性阻礙。（沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。啟動子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無效），有組成型（組成型表達(dá)系統(tǒng)）和誘導(dǎo)型（誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)）二大類。原核基因啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成：（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游510bp，一般由68個堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或10區(qū)。（2）35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄

31、起始位點(diǎn)上游35bp處，故稱35區(qū)，一般由10個堿基組成。常用原核基因啟動子：【lac (乳糖啟動子)；trp (色氨酸啟動子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子Ptac = Ptrp 的-35區(qū)+ Plac的-10區(qū)）；T7啟動子】IPTG誘導(dǎo)；PL和PR(噬菌體的左向和右向啟動子)溫控（熱誘導(dǎo)），30/37培養(yǎng)， 42T7啟動子最成功的啟動子 A.強(qiáng)大的 T7 啟動子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，B.T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌RNA 聚合酶的快 5 倍 C.由于大腸桿菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要將外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌（采納D

32、E3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5啟動子操縱下，IPTG間接誘導(dǎo)）。B、終止子轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象：A.RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)接著轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 B.DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。防止轉(zhuǎn)錄過頭策略：A、采納強(qiáng)終止子大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7&噬菌體DNA上的T B、二聚體終止子串聯(lián)的專門結(jié)構(gòu)C、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） mRNA 5SD序列（Shine-Dalgarno）：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列（5UAAGGAGG 3），它通過識不大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域3D、質(zhì)?？截悢?shù) 策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個至數(shù)十個）&

33、調(diào)控重組質(zhì)粒的擴(kuò)增E密碼子 滿足宿主對密碼子偏愛性的策略:外源基因全合成 & 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略1、包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體：胞內(nèi)高效表達(dá)時(shí)，工程菌因大量合成異源蛋白質(zhì)所形成的水不溶性積聚物。性質(zhì)：致密（密度大于細(xì)胞碎片和所有細(xì)胞器）、還含有標(biāo)記蛋白、RNA聚合酶和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。包涵體形成緣故：大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)呈“還原”型環(huán)境，不不利于二硫鍵的形成，當(dāng)高效表達(dá)時(shí)，新合成肽形成二硫鍵的速度和折疊效率跟不上合成速度。表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：a)部分屬于折疊過程中的產(chǎn)物；b)部分為無序卷曲與聚攏，分子內(nèi)二硫鍵錯配; c)分

34、子間存在大量錯配二硫鍵。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：、便于表達(dá)產(chǎn)物分離包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來、利于表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用差不多上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中

35、的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%。包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的要緊任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。常采納高濃度變性劑：8M尿素、6MGuC打開各種次級鍵，以DTT等巰基試劑打開二硫鍵。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：促溶劑 最常用, 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素廉價(jià)，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)表面活性劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但阻礙復(fù)性和純化混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵

36、體的復(fù)性與重折疊：二硫鍵形成（將多肽鏈中被拆開的游離巰基氧化重新形成二硫鍵（關(guān)鍵）；通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)重折疊形成二硫鍵的方式要緊有：A化學(xué)氧化法需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 B二硫鍵交換需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好包涵體復(fù)性操作的方法：緩慢降低變性劑濃度，并盡量減低蛋白濃度。詳見老師ppt。包涵體的復(fù)性與重折疊的要緊挑戰(zhàn)是： 聚攏沉淀2、融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白

37、易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，能夠快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 缺點(diǎn)：融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品要緊的成本往往就在該工段用于融合蛋白構(gòu)建的Tag（5種）A、His6 易于親和層析、不阻礙目的蛋白結(jié)構(gòu)、無免疫原性 B、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST） 維持良好空間構(gòu)象 C、硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus D、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP） 促進(jìn)分泌 E、內(nèi)含肽（Intei

38、n)：類似內(nèi)含子的多肽，與目的能蛋白融合表達(dá)，在表達(dá)后可進(jìn)行自剪接，兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性。4目的蛋白的回收化學(xué)裂解法-溴化氰（CNBr）法原理： CNBr與Met的硫醚基反應(yīng)，生成高絲氨酸(HMS)殘基留于上游肽段C端基因操作：在二個多肽基因融合處設(shè)置Met的密碼子酶促裂解法原理：利用蛋白酶的專一性識不殘基與位點(diǎn)切開融合肽基因操作：在二個多肽基因融合處設(shè)置蛋白酶識不殘基的密碼子常用多殘基識不位點(diǎn)蛋白酶Thrombin(凝血酶） Leu-Val-Pro-ArgGly-SerEnterokinase（腸激酶） Asp-Asp-Asp-Asp-LysFactor Xa （X因子） Ile-G

39、lu/Asp-Gly-ArgPreScission（5切割！GE） Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnTEV protease（Invitrogen) Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlnGlyIntein（內(nèi)含肽，自切割，NEB） dithiothreitol cleavage ！3、分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制在信號肽牽引下跨膜，進(jìn)入周質(zhì)腔；B、信號肽酶切下信號肽，釋放目的蛋白于周質(zhì)腔。以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)A、分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質(zhì)為氧化型環(huán)境，利于二硫鍵形成）目的蛋白穩(wěn)定性高（周質(zhì)腔蛋白酶少）目的蛋白末端完整

40、相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 B分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因?qū)ｉT難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因即便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)水平通常要比包涵體方式低專門多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。要緊用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備。4、寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，易受蛋白酶攻擊，易降解，串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，可抗蛋白酶降解。目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增

41、加目的基因的拷貝數(shù) 目的產(chǎn)物回收困難四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化(1)工程菌構(gòu)建與分析(2)工程菌遺傳穩(wěn)定性分析 在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進(jìn)行一下三項(xiàng)分析： A、存在狀況：宏觀逃逸率 B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析 C、功能完整性：表達(dá)水平工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性（要緊）：整個重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失重組質(zhì)粒的逃逸：工程菌部分細(xì)胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象。重組質(zhì)粒逃逸的緣故目的基因本底表達(dá)

42、產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)關(guān)閉質(zhì)粒DNA合成途徑，啟動降解程序目的基因高效表達(dá)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng) 抗性標(biāo)記基因過表達(dá)，抗生素消耗過快。目的基因表達(dá)盒“轉(zhuǎn)錄過頭”，阻礙Ori區(qū)域。環(huán)境因素誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒滲漏高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率：工程菌培養(yǎng)液中丟失質(zhì)粒的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。宏觀逃逸率（%）=（非選擇性平板菌落數(shù)選擇性平板菌落數(shù)）/非選擇性平板菌落數(shù)100(3)發(fā)酵工藝研究工程菌生長與表達(dá)要緊阻礙因素1、培養(yǎng)基：阻礙菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、表達(dá)水平、產(chǎn)物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應(yīng)幸免外源基因表達(dá)的“葡萄糖效應(yīng)”。氮源：有

43、機(jī)氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿 無機(jī)氮： 氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 其他：無機(jī)鹽、微量元素維生素、生物素等2、菌齡與接種量菌齡：自接種起培養(yǎng)的時(shí)刻（小時(shí)） 阻礙停滯期、質(zhì)粒宏觀逃逸率接種量：是指接入的種子液體積占培養(yǎng)液體積的百分比 過小：延長菌體停滯期，質(zhì)粒宏觀逃逸率高過大：菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積存過多，抑制后期菌體的生長，降低表達(dá)水平。3、pH值、溫度與溶解氧 pH值：阻礙生長速度、表達(dá)水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適pH范圍在6.8-7.4，表達(dá)最適pH為6.0-6.5 溫度：阻礙生長速度、表達(dá)水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適37，較低溫度利于可溶溶解氧：阻礙生長速度和表達(dá)水平

44、4、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)與收菌時(shí)機(jī)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)：過早阻礙生物量、過晚阻礙表達(dá)水平。一般在生長曲線對數(shù)中期或?qū)?shù)后期進(jìn)行誘導(dǎo)收菌時(shí)機(jī)：過早阻礙表達(dá)水平、過晚阻礙產(chǎn)物穩(wěn)定性、可溶性、并造成白費(fèi)。一般在表達(dá)曲線平臺期（誘導(dǎo)后3-4小時(shí)）收菌工程菌搖瓶水終生長與表達(dá)試驗(yàn)要緊研究參數(shù)：培養(yǎng)基、接種量、pH值、溫度、誘導(dǎo)與收菌時(shí)機(jī)等要緊觀看指標(biāo)： 表達(dá)水平（%）、生物量、表達(dá)產(chǎn)物積存（包涵體形成）情況、質(zhì)粒宏觀逃逸率等結(jié)果：生長曲線與表達(dá)曲線(4)工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝研究工程菌發(fā)酵工藝差不多要求與重點(diǎn)問題：差不多要求：高表達(dá)、高生物量、便于放大、低成本重點(diǎn)問題：1）質(zhì)粒穩(wěn)定性問題2）表達(dá)與生長的矛盾問題（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)）3）發(fā)酵

45、方式問題：分批式or流加式發(fā)酵？常規(guī)發(fā)酵or高密度發(fā)酵？發(fā)酵方式： 1）批式發(fā)酵：較常用，高表達(dá)、但菌體量較少。 2）流加發(fā)酵：較常用，要緊補(bǔ)充碳源，菌體量大、表達(dá)水平下降，碳源流加時(shí)機(jī)和速度是關(guān)鍵。 高密度發(fā)酵：無機(jī)鹽介質(zhì)，通過碳源限制和流加實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。 3）連續(xù)發(fā)酵：少用，高表達(dá)、高總生物量、難操縱。 工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝流程（如圖所示）：(5)表達(dá)產(chǎn)物分離純化工藝研究表達(dá)產(chǎn)物分離純化原則：1）要建立一個方便靈敏的蛋白檢測方法，以估價(jià)每一步的提純程度；2）分離步驟要盡可能少，每一步便于工業(yè)放大；3）盡量采納柱層析技術(shù)，各步驟間樣品應(yīng)無需復(fù)雜處理；4）初步分離要快速、大規(guī)模，精純要高分辨率

46、；5）盡可能幸免帶入有害物質(zhì);6）每步需統(tǒng)計(jì)：得率、純度、純化倍數(shù)分離提純有三步策略：粗提、中度純化、精細(xì)純化 以下是粗提的圖示第四章 非腸道原核細(xì)菌基因工程芽孢桿菌基因工程1、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、強(qiáng)大的分泌功能：如蛋白酶、淀粉酶，20g/L 2、不形成包涵體，產(chǎn)物可正確折疊 3、非病原菌，無內(nèi)毒素和外毒素，被美國FDA認(rèn)定為GRAS（總體安全）系統(tǒng) 4、容易操作，背景清晰 5、易于培養(yǎng)、生長旺盛缺點(diǎn)：同源蛋白表達(dá)高（g/L)、異源蛋白低(mg/L)2、大腸桿菌與芽胞桿菌在表達(dá)外源基因方面的比較大腸桿菌芽胞桿菌 HYPERLINK file:/F:基因工程模式生物.exe t

47、_parent 模式生物是否革蘭氏染色G-G+表達(dá)產(chǎn)物的分泌功能極少大多數(shù)包涵體形成不形成表達(dá)水平高對同源蛋白高，異源蛋白較低生物安全性高高分離純化過程復(fù)雜：復(fù)性、去內(nèi)毒素簡單糖基化修飾無無3、高效表達(dá)原理1）異源啟動子：大腸桿菌系統(tǒng)的啟動子結(jié)構(gòu)與芽孢桿菌的高度相似，異源啟動子有效2）短小芽孢桿菌胞壁蛋白操縱子調(diào)控元件：中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白基因組成一個操縱子（cwp），由啟動子、SD序列和分泌信號肽序列組成的5端（0.6kb)序列可用于外源基因分泌表達(dá)。調(diào)控機(jī)制：完整的胞壁阻遏轉(zhuǎn)錄，生長平臺期胞壁蛋白的脫落和介質(zhì)中的低濃度的Mg+誘導(dǎo)（去阻遏）。3）利用枯草芽孢桿菌胞外果聚糖酶操縱子調(diào)

48、控元件果聚糖酶操縱子（sacB）由啟動子PsacB 、上游正調(diào)控序列DegQ和SacU、果聚糖酶基因(sacX)、下游終止子樣序列和抗終止蛋白SacY基因組成。第五章 真菌基因工程一、真菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)具有原核系統(tǒng)的操作簡便、分子生物學(xué)背景清晰的優(yōu)點(diǎn)，具有真核系統(tǒng)蛋白翻譯后加工和分泌系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，為GARS系統(tǒng)缺點(diǎn)：產(chǎn)物糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與高等真核的有差距二、釀酒酵母載體系統(tǒng)1、野生型質(zhì)粒：2質(zhì)粒（釀酒酵母）2、人工構(gòu)建質(zhì)粒: 5種 酵母附加型質(zhì)粒（YEp） 酵母復(fù)制型質(zhì)粒（YRp） 酵母著絲粒質(zhì)粒（YCp) 酵母人工染

49、色體（YAC） 酵母整合型質(zhì)粒（YIp）3、標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因/抗性基因宿主細(xì)胞：為氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突變子，要緊有：LEU-、TRP-、HIS-、URA-載體：攜帶相應(yīng)的合成基因，如：leu1/leu2、trp1、his3/his4 、ura3選擇壓力：不完全培養(yǎng)基，如：YNB、無機(jī)鹽培養(yǎng)基4、酵母菌轉(zhuǎn)化方法A、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：去壁的原生質(zhì)體原理：以PEG等滲緩沖液穩(wěn)定原生質(zhì)體，以Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞攝取外源DNA。特點(diǎn)：30%以上為多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率：可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%，但操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)峻制約。B、堿金屬離子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：帶壁

50、的完整細(xì)胞原理：通過堿金屬離子（如Li+等）、PEG和熱休克處理誘導(dǎo)細(xì)胞汲取外源DNA。特點(diǎn)：方法簡便，容易掌握，有用性強(qiáng)；汲取線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見。C、電激轉(zhuǎn)化法：細(xì)胞：帶壁完整細(xì)胞或原生質(zhì)體原理：通過電脈沖對細(xì)胞膜造成DNA攝取通道特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高（105 / mg DNA）、操作簡便、適用范圍廣5、用作外源基因表達(dá)的酵母宿主菌釀酒酵母：最成熟的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)水平低，產(chǎn)物過度糖基化甲醇酵母：能夠利用甲醇作唯一碳源，表達(dá)水平高，產(chǎn)物糖基化更合理畢赤酵母：巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）漢遜酵母：多型漢遜酵母（Hansen

51、ula polymorpha）其它酵母：已有60多種酵母菌建立了轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)6、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)糖基化位點(diǎn)：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進(jìn)行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。 O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進(jìn)行糖基化三、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子：指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母，如：畢赤酵母、 漢森酵母、假絲酵母甲醇氧化酶啟動子： A、目前已發(fā)覺的、最強(qiáng)的真核啟B、嚴(yán)謹(jǐn)

52、調(diào)控型啟動子： AOX1：甲醇誘導(dǎo)，葡萄糖阻遏，甘油脫阻遏 MOX：甲醇誘導(dǎo)，葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏2、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)A、表達(dá)水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150個甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達(dá)系統(tǒng)）E、可利用簡單無機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)操作簡單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化3、甲醇酵母二大宿主系統(tǒng)要緊特點(diǎn)項(xiàng)目 畢赤酵母 漢遜酵母最適溫度 30 37最適pH值 4.5 4.5甘油阻遏 是 否糖基化 部分過度 較正常高密度發(fā)酵 100g/L 100g

53、/L 選擇標(biāo)記 his4、G418、 Zeocin、Cu+ leu2、 his3 、ura3、 G4184、畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)載體與整合模式 SKIPIF 1 0 SKIPIF 1 0 5、多拷貝整合重組子篩選必要性： 目的基因表達(dá)盒的多拷貝整合是高效表達(dá)的基礎(chǔ)，但多拷貝整合是低概率事件（1-10%）G418抗性篩選： 表達(dá)載體引入卡拉霉素基因（Kanamycin）作二級篩選標(biāo)記，從His4+轉(zhuǎn)化子中篩選高G418抗性轉(zhuǎn)化子，抗性越高整合拷貝數(shù)越高。雜交篩選：菌落原位或Dot-Blotting雜交篩選 6、His+轉(zhuǎn)化子甲醇表型篩選必要性： A、不同目的基因的表達(dá)偏愛不同甲醇表型B、工程菌表達(dá)誘

54、導(dǎo)條件的優(yōu)化需要依據(jù)甲醇表型C、限切酶線性化方式誘導(dǎo)靶向整合（下表），但即使非AOX1取代型整合方式，也有可能因同源重組而破壞AOX1基因，產(chǎn)生MutS表型。線性化位點(diǎn)（限切位點(diǎn)）整合事件（位點(diǎn)）GS115株（AOX1野生）KM71株（AOX1缺失）SalI or StuI插入，his4His+Mut+His+MutsSacI插入，5AOX1His+Mut+His+MutsNotI or BglII取代，AOX1His+Muts His+Mut+Arg-7、轉(zhuǎn)化子PCR鑒定必要性： 證明外源基因確實(shí)整合在宿主基因組DNA，并排除意外丟失目的基因（機(jī)理不明）的 His+表型轉(zhuǎn)化子。PCR鑒定：以

55、GS115的His+轉(zhuǎn)化子為例 模板：轉(zhuǎn)化子基因組DNA 引物：Primer 5：來自5AOX1；Primer3 產(chǎn)物：a.目的基因（AOX1缺失，Muts 型轉(zhuǎn)化子） b.目的基因+完整AOX1基因（Mut+型轉(zhuǎn)化子）高密度發(fā)酵工藝流程與碳源操作種子液制備種子液制備基礎(chǔ)培養(yǎng)甘油流加期甲醇流加期收罐（固液分離）BMGY，至對數(shù)期，16-24hr，OD600=2-64%甘油+無機(jī)鹽培養(yǎng)基，至甘油耗盡，18-24hr以50%甘油限制性流加，增加細(xì)胞密度，4hr，180-220g/L以100%甲醇限制性流加，誘導(dǎo)表達(dá)，增加細(xì)胞密度，48-68hr，350-450g/L第六章 昆蟲基因工程1、DNA轉(zhuǎn)

56、座子的類型插入序列(IS)： 最簡單的轉(zhuǎn)座子稱為插入序列(Insertion sequence，IS)。IS家族有專門多成員，它們的結(jié)構(gòu)相似特征：兩端都有短5-9bp的正向重復(fù)序列（direct repeats, DR）（靶序列），略長15-25bp的反向重復(fù)序列（inverted repeats, IR）1kb左右的編碼區(qū)，它僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon）復(fù)合轉(zhuǎn)座子是由兩個重復(fù)序列夾著一個或多個結(jié)構(gòu)基因如某些抗藥性基因和其它基因組成。存在于R因子及其它質(zhì)粒中。復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩端的組件由IS和類IS組成。2、DNA轉(zhuǎn)座的一般模式轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和

57、非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分不作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座要緊是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。3、果蠅轉(zhuǎn)座元件Copia 反轉(zhuǎn)座子；FB 家族；P 元件P 因子P因子全長2 907 bp，兩端有31bp的反向重復(fù)序列。4個編碼區(qū)、3個內(nèi)含子。體細(xì)胞中，只有內(nèi)含子1、2被順利切除，產(chǎn)生前3個外顯子的功能型 mRNA，被翻譯成66KD的轉(zhuǎn)座阻遏蛋白一種轉(zhuǎn)座活性的抑制因子。生殖細(xì)胞中，內(nèi)含子3被切除，產(chǎn)

58、生的成熟mRNA包括全部4個外顯子并被翻譯成87KD的轉(zhuǎn)座酶，才能導(dǎo)致P因子轉(zhuǎn)座和配子不育。 P元件介導(dǎo)的果蠅雜交不育的緣故：P元件在染色體遺傳位點(diǎn)的插入往往會導(dǎo)致不育，這是由于專門多的P因子發(fā)生轉(zhuǎn)座，造成插入突變。含有P因子的雌果蠅與不管是否帶有P因子的雄果蠅雜交，由于P細(xì)胞型的存在抑制了轉(zhuǎn)座酶的合成或激活，表現(xiàn)出正常的生育能力。但當(dāng)雌果蠅為M型時(shí)，在卵中無阻遏物，如此導(dǎo)致了來自雄果蠅生殖細(xì)胞中的P因子轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)座酶。4、桿狀病毒1）桿狀病毒科分為包涵體桿狀病毒和非包涵體桿狀病毒2）宿主僅限于無脊椎動物3）桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子4）桿狀病毒基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄5

59、）雙相生活史第一時(shí)相：時(shí)刻：感染后的0-24小時(shí)。結(jié)果：產(chǎn)生大量的BV，出芽釋放，在蟲體內(nèi)傳播第二時(shí)相：時(shí)刻：感染24小時(shí)以后。結(jié)果：形成大量的ODV，被多角體蛋白包裹，最終形成多角體，經(jīng)口感染其它宿主。5、桿狀病毒高效表達(dá)系統(tǒng)1) 病毒基因組較大,能夠插入相當(dāng)大的外源DNA片段2)常采納多角體蛋白基因啟動子（polh-P）3）常采取轉(zhuǎn)移載體與野生病毒體內(nèi)重組方式構(gòu)建重組病毒4) 重組病毒多角體蛋白基因的編碼區(qū)被外源基因取代，喪失形成包涵體功能5）能夠家蠶或昆蟲細(xì)胞作表達(dá)宿主優(yōu)缺點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工系統(tǒng)接近于哺乳動物，表達(dá)水平高，但生產(chǎn)成本高。桿狀病毒表達(dá)外源基因流程亞克隆目的基因亞克隆目的

60、基因與桿粒進(jìn)行重組從大腸桿菌中分離重組桿粒，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞分離重組病毒用于基因表達(dá)第七章 高等動物基因工程高等動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等動物基因工程高等動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等動物基因工程技術(shù)動物工程動物工程細(xì)胞細(xì)胞蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物個體哺乳動哺乳動物遺傳性狀改良生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白物遺傳性狀改良1、 基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子-質(zhì)粒復(fù)合物法生物學(xué)方法動物病毒載體：腺病毒、 SV40、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病