酶的生物改造市公開課獲獎?wù)n件

1、 酶生物改造 酶定向進(jìn)化研究進(jìn)展第1頁第1頁介 紹 提 綱定向進(jìn)化技術(shù)概述定向進(jìn)化技術(shù)應(yīng)用定向進(jìn)化辦法第2頁第2頁 1、酶分子改造辦法基于序列理性設(shè)計：化學(xué)修飾和定點突變 利用已知酶分子特性、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功效之間關(guān)系，以及氨基酸殘基功效等信息，對酶分子進(jìn)行改造；利用基因操作模擬自然進(jìn)化非理性設(shè)計：定向進(jìn)化 不需要準(zhǔn)確酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機突變、基因重組等辦法模擬自然進(jìn)化機制在體外改造酶基因，并定向篩選出所需突變酶； 一、定向進(jìn)化概述第3頁第3頁實例：木糖異構(gòu)酶定點突變改造第4頁第4頁實例：木糖異構(gòu)酶定點突變改造突變前蛋白與木糖復(fù)合物模型 突變后蛋白與木糖復(fù)合物模型 氨基酸殘基與木糖之間距

2、離比突變前下降，不利于體積更大葡萄糖底物，易于結(jié)合底物木糖，對木糖活性提升第5頁第5頁 2、生物自然進(jìn)化不足自然進(jìn)化過程： 突變自然選擇遺傳后代自然進(jìn)化結(jié)果： 生物多樣性 基因多樣性：為完畢同一功效所表現(xiàn)出 多個基因或同一個基因（同源性）不足：周期長，效率低 ； 可控性差； 第6頁第6頁 基因工程技術(shù)使得人類快速篩選工業(yè)菌種成為也許，在幾天和數(shù)月內(nèi)即可完畢；還能夠讓人類按照自己意愿和需要改造菌種，甚至能夠產(chǎn)生自然界中原本不存在全新酶，以適應(yīng)大工業(yè)生產(chǎn)需要。-哲理上,認(rèn)可了人類對蛋白質(zhì)認(rèn)知嚴(yán)重不足;-技術(shù)上,將大自然已經(jīng)實踐了幾億年達(dá)爾文進(jìn)化原理應(yīng)用于試管中,以隨機突變與隨機雜交辦法來改變蛋白質(zhì)

3、性能,再輔以篩選來取得優(yōu)秀變種。 (Frances Arnold, Caltech, 1993) 第7頁第7頁3、酶定向進(jìn)化技術(shù)定義： 從一個或多個已經(jīng)存在親本酶（天然或人為取得）出發(fā)，通過基因突變和重組，構(gòu)建一個人工突變基因庫，通過篩選最后取得預(yù)先盼望含有一些特性進(jìn)化酶； 所謂酶體外定向進(jìn)化，又稱試驗分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)非合理設(shè)計，它不需事先理解酶空間結(jié)構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊條件，模擬自然進(jìn)化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)突變酶。 第8頁第8頁4、定向進(jìn)化原理在待進(jìn)化酶基因PCR擴增反應(yīng)中，利用Taq DNA聚合酶不含有3-5校對功效性質(zhì)，

4、配適當(dāng)當(dāng)條件，以很低比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向選擇辦法，選出所需性質(zhì)優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其它突變體。定向進(jìn)化基本規(guī)則是“獲取你所篩選突變體”。定向進(jìn)化=隨機突變+選擇。前者是人為引起，后者雖相稱于環(huán)境，但只作用于突變后分子群，起著選擇某一方向進(jìn)化而排除其它方向突變作用，整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行第9頁第9頁蛋白質(zhì)穩(wěn)定性活性有機溶液中活性不同底物利用酸堿度蛋白質(zhì)表示親和性 專一性1234性能代數(shù)達(dá)到目隨機突變隨機雜交篩選目的蛋白酶定向進(jìn)化過程和應(yīng)用范圍第10頁第10頁二、酶定向進(jìn)化應(yīng)用第11頁第11頁酶定向進(jìn)化典型例子枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性分子進(jìn)化第12

5、頁第12頁內(nèi)酰胺酶活性提升了32,000倍；半乳糖苷酶底物特異性提升了1000倍，且活性提升66倍；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶對支鏈氧代氨基酸活性提升105倍且對纈氨酸催化效率提升2.1106倍等。定向進(jìn)化成功例子第13頁第13頁成功例子Reetz等 (1997) 將脂酶水解對硝基-2-甲基癸酯對映體選擇性提升了40倍You和Arnold (1996) 提升了枯草桿菌蛋白酶E表示水平和在有機溶劑中活性，使酶總活力提升了500倍Zhao和Arnold（1998）在保持酶活力不變條件下將枯草桿菌蛋白酶E作用溫度提升了17度第14頁第14頁三、酶定向進(jìn)化基本過程隨機突變 不同定向進(jìn)化方法構(gòu)建突變基因文庫 載體選

6、擇，基因重組，組建基因文庫突變基因篩選 平板篩選法，熒光篩選法，表面展示法 第15頁第15頁1、定向進(jìn)化辦法無性進(jìn)化辦法：易錯PCR法，盒式誘變有性進(jìn)化辦法 1）DNA改組法（DNA Shuffling) 2）體外隨機重組法（RPR) 3）交錯延伸法(StEP)基因家族同源重組外顯子改組雜合進(jìn)化第16頁第16頁無性進(jìn)化：易錯PCR辦法 第17頁第17頁無性進(jìn)化：易錯PCR辦法 辦法：向單一酶分子基因內(nèi)隨機引入突變(在PCR擴增過程中調(diào)整反應(yīng)條件），制造突變酶庫以便篩選；特點：遺傳改變僅發(fā)生在單一分子內(nèi)部，屬于無性進(jìn)化 改變4種底物濃度比，或減少一個dNTP量（降至5-10）,加入dITP來代替

7、被減少dNTP. 緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提升鎂離子濃度（常規(guī)PCR時濃度為0.5-2.5mmol/L）； 添加一定濃度錳離子；第18頁第18頁易錯PCR辦法實例 1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中，定向進(jìn)化枯草桿菌蛋白酶E活力取得成功，在60和85DMF中，活力分別提升256和131倍；長處：操作簡便，隨機突變豐富；缺點：正突變概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選工作量大；合用范圍：適合用于較小基因定向進(jìn)化第19頁第19頁有性進(jìn)化：DNA改組辦法（1994，Stemmer)第20頁第20頁有性進(jìn)化：DNA改組辦法方法：從正突變基因庫中分離得到DNA序列

8、用酶隨機切割，得到隨機片斷經(jīng)不加引物多次PCR循環(huán)，取得全長基因，實現(xiàn)優(yōu)勢突變組合；特點：遺傳改變僅發(fā)生在來自不同基因片斷之間 重組，因此稱為有性進(jìn)化；實例：對內(nèi)酰胺酶進(jìn)行DNA改組，3次循環(huán)得到進(jìn) 化酶反抗生物素頭孢噻嗚抗性增加3倍；優(yōu)點：將已經(jīng)有正突變基因結(jié)合，正突變效率高；缺點：無引物PCR之前必須把DNase I去除潔凈，以 防突變基因被切割；第21頁第21頁有性進(jìn)化：體外隨機重組法（1998，Arnold)能以單鏈DNA為模板，以隨機序列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，再除去模板，互為模板和引物進(jìn)行裝配和擴增第22頁第22頁有性進(jìn)化:交錯延伸法（1997，Arnold)將常規(guī)退火和延伸合并成一步

9、，縮短反應(yīng)時間第23頁第23頁基因家族同源重組辦法：單一酶分子基因進(jìn)化過程中集中有利突變速度較慢，從自然存在基因家族出發(fā)，由于基因之間存在明顯差別，所得突變庫表達(dá)了基因多樣性和增長了有利突變概率；實例：Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素4個同源基因，分別進(jìn)行單獨進(jìn)化和同源重組，結(jié)果單獨進(jìn)化抗性提升8倍、而同源重組比其中2種微生物分別提升270和540倍； 國內(nèi)海藻糖酶法制備即采用該辦法；特點：由于定向進(jìn)化高效性，被認(rèn)為是DNA改組發(fā)展方向；第24頁第24頁The Molecular Breeding directed molecular evolution process第25頁第

10、25頁 對一組同源蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行比較，以一 定原則程序計算出各氨基酸序列共有序列； 人工合成同序基因后重組表示。 Martin Lehmann等（）把這種辦法應(yīng)用在真菌植酸酶家族設(shè)計合成了同源植酸酶基因，并表示出具熱穩(wěn)定性同源植酸酶。第26頁第26頁外顯子改組真核基因中外顯子編碼一個折疊結(jié)構(gòu)域，故內(nèi)含子（轉(zhuǎn)錄后被剪切剩下外顯子）間重組，可使獨立外顯子組裝成編碼新蛋白質(zhì)基因，可造成蛋白質(zhì)快速進(jìn)化；在自然界中，不同分子內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，造成不同外顯子結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)有效路徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一個分子間內(nèi)含子同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段

11、上；第27頁第27頁雜合進(jìn)化把來自不同酶分子中結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分子進(jìn)行組合或互換，以產(chǎn)生含有所需性質(zhì)酶雜合體。纖維素酶定向進(jìn)化第28頁第28頁2.基因文庫構(gòu)建定義：通過DNA重組技術(shù)將隨機突變?nèi)〉酶鞣N突變基因與適宜載體進(jìn)行重組，取得重組載體；再通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化等辦法將重組載體轉(zhuǎn)入適當(dāng)細(xì)胞或進(jìn)行體外包裝成為有感染活性重組噬菌體，形成突變基因文庫。載體選擇：質(zhì)粒載體 噬菌體DNA載體: 噬菌體、M13噬菌體 黏粒載體：人工構(gòu)建載體 噬菌粒載體第29頁第29頁基因重組： 體外通過DNA連接酶作用，將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA過程。重組辦法：黏性末端連接 平頭末端連接 修飾末端連接組裝突變

12、基因文庫 將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成為有感染活性重組噬菌體過程。組裝辦法：重組質(zhì)粒載體-轉(zhuǎn)化（原核和真核） 重組噬菌體載體-包裝 第30頁第30頁3、基因突變庫篩選辦法目的 依據(jù)定向進(jìn)化要求，在一定環(huán)境要求下進(jìn)行篩選，從突變基因文庫中得到所需突變基因。難點 突變庫容量大，普通達(dá)到106，工作量巨大關(guān)鍵 高通量篩選：通量大，效率高辦法 平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細(xì)胞表面展示法第31頁第31頁平板篩選辦法依據(jù)細(xì)胞生長情況篩選熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性： pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)第32頁第32頁平板篩選辦法依據(jù)顏色改變篩選

13、大腸桿菌-半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體DNA載體（藍(lán)色）反應(yīng)產(chǎn)物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚脂肪酶篩選海因酶篩選第33頁第33頁平板篩選辦法依據(jù)透明圈大小篩選淀粉酶進(jìn)化：淀粉平板培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶進(jìn)化：血纖維蛋白培養(yǎng)基第34頁第34頁熒光篩選辦法利用本身熒光激發(fā)特性 生成產(chǎn)物本身是含有熒光激發(fā)特性物質(zhì)利用熒光匯報基因辣根過氧化合物酶和單加氧酶融合基因： 原理：萘萘酚醌類化合物（能激發(fā)熒光）綠色熒光蛋白基因：獲諾貝爾化學(xué)獎 第35頁第35頁諾貝爾化學(xué)獎簡介獲獎 諾貝爾化學(xué)獎授予日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁沙爾菲，以及美國華裔科學(xué)家錢永健。他們?nèi)擞捎谠诰G色熒光蛋白（）研究和應(yīng)用方面

14、做出突出奉獻(xiàn)將各分得13諾貝爾化學(xué)獎獎金。 第36頁第36頁諾貝爾化學(xué)獎簡介評論 生物學(xué)有些現(xiàn)象只能在打壞細(xì)胞以后才干做，因此事實上是從“死物”上來推測生物情況。而下村修、錢永健和馬丁沙爾菲創(chuàng)造用熒光分子標(biāo)識其它分子辦法，使科學(xué)家們能在活細(xì)胞、活生物上直接觀測一些生物現(xiàn)象。因此，能夠說是把一些“死物學(xué)”變成了真正“生物學(xué) （北大饒毅）綠熒光水母通過體內(nèi)綠色熒光蛋白發(fā)光科學(xué)家在線形蟲體內(nèi)植入綠色熒光蛋白質(zhì)第37頁第37頁綠色熒光蛋白應(yīng)用分子標(biāo)識：GFP標(biāo)識微管結(jié)構(gòu)第38頁第38頁綠色熒光蛋白應(yīng)用 分子標(biāo)識： FISH分析菌株（a）未加探針；（b）DAPI染色（c）-探針雜交（d）Msint-12

15、68探針雜交菌株Y1；（e）Msint-1268探針雜交M. trichosporium OB3b第39頁第39頁綠色熒光蛋白應(yīng)用藥物篩選第40頁第40頁綠色熒光蛋白應(yīng)用融合表示：線粒體中表示GFP第41頁第41頁綠色熒光蛋白應(yīng)用生物傳感器： GFP在植物研究中應(yīng)用第42頁第42頁噬菌體表面展示法 內(nèi)涵 利用絲狀噬菌體外膜結(jié)構(gòu)蛋白與一些特定外源蛋白或多肽分子形成穩(wěn)定復(fù)合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌體表面一個分子展示技術(shù) 特點 有效性高，是前景遼闊篩選辦法第43頁第43頁噬菌體顯示篩選模式第44頁第44頁噬菌體顯示幾種類型第45頁第45頁M13噬菌體pIII和pVIII顯示第46頁第46頁酵母

16、細(xì)胞表面展示法 通過錨定在酵母細(xì)胞表面特點蛋白質(zhì)與一些外源蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母細(xì)胞表面一個分子展示技術(shù)。第47頁第47頁核糖體顯示技術(shù)第48頁第48頁RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)第49頁第49頁RNA-蛋白質(zhì)融合第50頁第50頁寡霉素與核苷酸連接第51頁第51頁Myc ds-DNA富集第52頁第52頁實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性定向進(jìn)化第53頁第53頁高通量篩選辦法建立生物信息學(xué)技術(shù)手段建立天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性改造研究內(nèi)容及執(zhí)行情況第54頁第54頁 高通量篩選辦法建立 基于酶聯(lián)免疫分析辦法，選取醫(yī)用檢測試劑盒作為檢測試劑，建立了快速高效酶活性檢測辦法，結(jié)合使用96

17、孔酶標(biāo)板，形成了酶高通量篩選辦法。 建立了改進(jìn)可高通量操作質(zhì)?？焖贆z測辦法，改進(jìn)后質(zhì)?？鞕z工作量為原辦法1/3左右，可用于高通量篩選和鑒定所構(gòu)建基因工程菌。第55頁第55頁生物催化數(shù)據(jù)整合和信息分析峰值運算速度達(dá)3000億次/秒集群系統(tǒng) 基因表示 蛋白質(zhì)表示 蛋白質(zhì)-DNA互相作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用 基因和其它功效互相作用 蛋白質(zhì)定位 網(wǎng)絡(luò)調(diào)整 功效注解 生物信息學(xué)技術(shù)手段建立第56頁第56頁天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性改造第57頁第57頁天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用酶法制備L苯丙氨酸關(guān)鍵酶 ； L-苯丙氨酸主要用途 氨基酸輸液 L-苯丙氨酸是人體八大必須氨基酸之一，是氨基酸輸液主要成份； 甜味劑合成 由L-苯丙氨酸和L天冬氨酸合成阿斯巴甜是二十世紀(jì)九十年代以來最受關(guān)注非糖型肽類甜味劑，形成了對L-苯丙氨酸強烈需求； 第58頁第58頁肉桂酸酶法苯丙酮酸酶法第59頁第59頁結(jié)構(gòu)分析軟件Rasmol 分析酶三維結(jié)構(gòu)序列分析軟件Clustal W分析酶一維結(jié)構(gòu)利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)分析第60頁第60頁應(yīng)用DeepView（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件）確立天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性相關(guān)功