菠蘿蛋白酶的提取、初級(jí)純化及活性鑒定課件

1、菠蘿蛋白酶的提取、初級(jí)純化及活性鑒定 實(shí)驗(yàn)一一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康南到y(tǒng)地學(xué)習(xí)和掌握生命大分子物質(zhì)分離純化技術(shù)的原理及基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。熟練掌握飽和硫酸銨沉淀法、透析法、測(cè)定蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。1、生命大分子物質(zhì)分離純化的一般程序：（1）選擇有效成分含量豐富、穩(wěn)定性好的樣品材料。（2）材料處理。（3）確定分離純化的方法，使粗品的純度達(dá)到預(yù)定要求。（4）建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)手段。二、實(shí)驗(yàn)原理2、蛋白質(zhì)的分離純化方法：(一)沉淀法鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法等。在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當(dāng)鹽濃度增加到一定量時(shí)，其

2、溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時(shí)便從溶液中沉出，即為鹽析。 一般進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀時(shí)，選用的鹽是硫酸銨。優(yōu)點(diǎn)： 溶解度大，對(duì)溫度不敏感； 分級(jí)效果好； 有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用； 價(jià)格低廉。缺點(diǎn)：鹽濃度含量高。透析和超濾透析是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，扎緊袋口放在緩沖液中進(jìn)行的。超濾是利用壓力和離心力，借助于超濾膜將不同分子量的物質(zhì)分離的技術(shù)。 3、菠蘿蛋白酶活性測(cè)定酪蛋白 酪氨酸（275nm）菠蘿蛋白酶2、測(cè)酶活試劑（1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。 用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55水浴溶解，不停攪拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS

3、（0.1 mol/L pH7.8）。（2）激活劑 100ml（現(xiàn)配現(xiàn)用） 20 mmol/L半胱氨酸-鹽酸鹽，1 mmol/L EDTA-Na，用0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。3、透析袋處理 將10 cm長(zhǎng)的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氫鈉溶液中煮沸10min后，用干凈鑷子取出，經(jīng)蒸餾水煮沸、漂洗，即可使用。四.實(shí)驗(yàn)步驟1、粗酶提取生菠蘿皮（每一組） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8電動(dòng)攪拌24層紗布過濾于燒杯中分裝于離心管（10ml/管）2、酶活測(cè)定方法（每組）試劑對(duì)照(調(diào)零)實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)3TCA(ml)酪蛋白（ml）酶液（ml）激活劑（ml） 310.10.910.10.910.10.910.10.937 10min 水浴 TCA(ml) 333靜置 5min 濾紙過濾 A275石英比色杯 0酶活（U） 0酶活（U）平均值 酶活單位：在上述條件下(37,酶促反應(yīng)10min)，每10min增加0.01個(gè)光吸收值的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。3、透析去鹽把測(cè)酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中,系緊,置于PBS 0.