磷脂酶D交聯(lián)聚集體的制備及其酶學(xué)性能研究

1、PAGE 15 -磷脂酶D交聯(lián)聚集體的制備及其酶學(xué)性能研究酶催化因其較高的催化活性、特異性和溫和的反應(yīng)條件而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品加工、化學(xué)合成和生物降解等領(lǐng)域。其中,磷脂酶D(EC 3.1.4.4 phospholipase D,PLD)可以催化水解磷脂分子并生成磷脂酸和有機(jī)堿。在一定條件下PLD還能夠催化甘油、絲氨酸、膽堿、醇類(lèi)物質(zhì)等含羥基的化合物與磷脂酰基團(tuán)結(jié)合,形成新的磷脂1-2。PLD催化作用反應(yīng)式如圖1所示。雖然PLD存在于各種微生物、植物、動(dòng)物中,但來(lái)源于微生物的PLD具有對(duì)底物耐受性強(qiáng)、對(duì)堿基交換反應(yīng)催化活性高的特點(diǎn)3。圖1 PLD的催化水解和轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)的作用機(jī)理Fig.1

2、 Reaction mechanism of PLD-catalyzed hydrolysis and transphosphatidylation天然PLD存在成本較高、操作穩(wěn)定性低、回收再利用困難等缺陷,嚴(yán)重制約了其在工業(yè)上的應(yīng)用。酶固定化是解決上述問(wèn)題的有效手段之一。近年來(lái),關(guān)于PLD固定化的研究已有少量報(bào)道。MAO等4以環(huán)氧樹(shù)脂交聯(lián)法對(duì)Bacillussubtilis來(lái)源的PLD進(jìn)行固定化,但所得固定化酶底物轉(zhuǎn)化率和重復(fù)使用性都較差。通過(guò)對(duì)載體進(jìn)行改進(jìn),得到了以介孔SiO2/聚合物納米復(fù)合材料5、氨基功能化的中空介孔SiO2立方體6、分層空隙聚合物修飾的環(huán)氧樹(shù)脂7為載體的PLD固定化酶

3、,具有良好的操作穩(wěn)定性,且材料新穎,但載體成本較高,難于進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。上述PLD固定化酶中含有大量的非催化載體,降低了固定化酶的單位體積活性和催化效率,而且對(duì)于惰性基質(zhì)需要對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾后,才能與PLD進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián),制作成本較高8-9。因此,尋求一種操作簡(jiǎn)單、成本經(jīng)濟(jì)、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的PLD固定化方法受到越來(lái)越多的關(guān)注。交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一種無(wú)載體固定化技術(shù)。首先通過(guò)水溶性有機(jī)溶劑、中性鹽溶液或非離子型聚合物等沉淀劑將游離酶沉淀,然后加入雙功能試劑交聯(lián)得到不溶于水的酶聚集體。由于酶的沉淀過(guò)程中存

4、在的非共價(jià)作用力較弱,不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),從而保留了酶的大部分活性10-11。與有載體固定化相比,CLEAs具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、對(duì)酶純度要求低、單位體積活性高、特異性好、適用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn),且具有優(yōu)異的有機(jī)溶劑和高溫高壓耐受性,表現(xiàn)出良好的貯藏穩(wěn)定性和實(shí)際操作穩(wěn)定性10,12。另外,CLEAs自身酶負(fù)載量高,在制備過(guò)程中活性損失較小,有效避免了固體載體引入時(shí)可能造成的酶失活13。近年來(lái)CLEAs技術(shù)已用于固定多種不同的酶,比如脂肪酶、漆酶、-淀粉酶等,得到的CLEAs的穩(wěn)定性和催化性能都得到了不同程度的提高14-16。但目前尚未有利用CLEAs技術(shù)固定化PLD及其酶學(xué)性能研究的報(bào)道。因此,

5、本研究擬開(kāi)發(fā)一種高效的PLD-CLEAs的制備方法,并對(duì)所得固定化酶PLD-CLEAs的催化性能和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行全面的評(píng)估。首先考察沉淀和交聯(lián)條件對(duì)酶活性回收率的影響,對(duì)PLD-CLEAs的酶學(xué)性質(zhì)(催化活性、熱穩(wěn)定性、最適溫度和pH值、重復(fù)使用性)進(jìn)行研究,并與游離酶進(jìn)行探討和比較,以期得到一種高效的PLD固定化酶,為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料與試劑菌種：枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)WB600,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。試劑：膽堿氧化酶、過(guò)氧化物酶,Sigma-Aldrich；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、卡那霉素,北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂(phosphati

6、dylcholine,PC),上海源葉生物科技有限公司；硫酸銨、戊二醛、TritonX-100、MnCl2、NaCl,上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、NaOH,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司公司；乙腈、乙醇、乙醚、鹽酸,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。1.2 儀器與設(shè)備SYC-A水浴恒溫振蕩器,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Centrifuge 5418小型高速離心機(jī)、Heto Drywinner冷凍干燥機(jī),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；ZXGP-B2080臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司；Mul

7、tiskan Spectrum酶標(biāo)儀、FEI Apreo掃描電子顯微鏡美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 PLD的制備取1 L保藏于本實(shí)驗(yàn)室-80 冰箱的枯草芽胞桿菌,采用分段劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上,于37 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h,獲得單菌落。將單菌落轉(zhuǎn)移至含有50 g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(5 mL),置于恒溫空氣浴搖床中37 、220 r/min培養(yǎng)12 h；取5 mL菌液轉(zhuǎn)接入含有50 g/mL卡那霉素的250 mL培養(yǎng)液中,37 ,220 r/min培養(yǎng)48 h后,將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 離心10 m

8、in,上清液即為PLD粗酶液,凍干后備用。1.3.2 PLD-CLEAs的制備及優(yōu)化1.3.2.1 沉淀劑種類(lèi)和濃度對(duì)PLD-CLEAs酶活性的影響以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標(biāo),探討不同沉淀劑種類(lèi)和濃度對(duì)PLD活性的影響。取1 mL 100 mg/mL的游離PLD酶液,分別加入到4 mL不同體積分?jǐn)?shù)的預(yù)冷有機(jī)溶劑(乙醇和乙腈)和不同飽和度硫酸銨溶液中,PLD的質(zhì)量濃度為100 mg/mL,4 攪拌沉淀30 min。離心分離除去上清液,將沉淀用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)復(fù)溶后測(cè)定PLD的活性。1.3.2.2 交聯(lián)劑濃度對(duì)PLD-CLEAs酶活性

9、的影響以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標(biāo),探討不同戊二醛濃度對(duì)PLD-CLEAs活性的影響。取1 mL 100 mg/mL的游離PLD酶液,與4 mL硫酸銨溶液混合,硫酸銨飽和度為60%,于4 攪拌沉淀30 min。隨后分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛(0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%),在4 下攪拌交聯(lián)1 h。反應(yīng)結(jié)束后8 000 r/min離心分離5 min,收集沉淀物,用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復(fù)洗滌,獲得PLD-CLEAs并測(cè)定其活性。1.3.2.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)PLD-CLEAs酶活性的影響

10、以PLD-CLEAs的酶活性回收率作為優(yōu)化指標(biāo)，探討不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)PLD-CLEAs活性的影響。取適量?jī)龈傻腜LD酶粉，與4 mL硫酸銨溶液(飽和度60%)混合，PLD的質(zhì)量濃度為100 mg/mL，于4 攪拌沉淀30 min。隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%的戊二醛，在4 下分別攪拌反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心分離收集沉淀物，用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復(fù)洗滌，獲得PLD-CLEAs并測(cè)定其活性。1.3.3 酶活力測(cè)定PLD活性的測(cè)定參照HUANG等17的方法稍作改進(jìn)。以PC為底物,將一定量的PLD加入到含有0.2

11、3 mol/L MnCl2的Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0)中與底物溶液(4 mg/mL PC,乙醚8%,0.9 mol/L TritonX-100)充分混合,在45 、200 r/min反應(yīng)45 min后,煮沸5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)液于室溫條件下冷卻后,取300 L與500 L膽堿顯色液(膽堿氧化酶0.5 U/mL,過(guò)氧化物酶1 U/mL,4-安替比林0.5 mg/mL,苯酚0.25 mg/mL)混合,37 保溫30 min進(jìn)行顯色,使用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物在500 nm處的吸光值。根據(jù)氯化膽堿顯色后在500 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)體系中膽堿的物質(zhì)的量。一個(gè)酶活

12、力單位(U)定義為:測(cè)試條件下1 min水解PC釋放1 mol膽堿所需的PLD的量。固定化酶活性回收率計(jì)算如公式(1)所示：酶活性回收率(1)1.3.4 PLD-CLEAs的酶學(xué)性質(zhì)1.3.4.1 熱穩(wěn)定性首先測(cè)定了不同酶制劑在高溫(50 )下的熱穩(wěn)定性。用Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0)配制相同濃度的游離和固定化酶溶液,將酶溶液置于50 恒溫水浴振蕩器中保溫,200 r/min熱處理不同時(shí)間(0.56 h),按照1.3.3的方法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的酶活性。以酶液0 h時(shí)的催化活性為標(biāo)準(zhǔn),將其活性定義為100%。1.3.4.2 最適溫度的測(cè)定通過(guò)在不同溫度條件下測(cè)定酶活

13、力,確定固定化酶的最適反應(yīng)溫度。將游離和固定化酶溶液分別置于25、35、45、55、65 下進(jìn)行反應(yīng),不改變測(cè)定酶活力其他條件,對(duì)PLD和PLD-CLEAs的酶活力進(jìn)行測(cè)定。1.3.4.3 最適pH的測(cè)定將游離和固定化酶溶液置于不同pH的緩沖溶液體系(100 mmol/L,pH 5.010.0)中,底物溶液pH也對(duì)應(yīng)相應(yīng)的反應(yīng)pH值,對(duì)PLD和PLD-CLEAs的酶活力進(jìn)行測(cè)定。所使用的緩沖溶液分別是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.06.0)、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.08.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 10.0)。1.3.

14、4.4 固定化酶重復(fù)使用性研究配制一定濃度的固定化酶溶液,在最適反應(yīng)條件下以PC為底物測(cè)定其在500 nm處的吸光值,計(jì)算PLD-CLEAs的活性。將反應(yīng)溶液離心分離去上清液,用100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)反復(fù)洗滌,以除去未反應(yīng)的底物和產(chǎn)物；隨后將離心洗滌后的固定化酶重新分散于緩沖液中,加入新的底物進(jìn)行下一次的反應(yīng),如此重復(fù)10次。連續(xù)測(cè)定固定化酶在循環(huán)多次后的剩余酶活力,第1次使用時(shí)的酶活力定義為100%。2 結(jié)果與分析2.1 PLD游離酶的制備PLD粗酶液的SDS分析如圖2所示,在分子質(zhì)量約為60 kDa處,觀察到明顯的蛋白條帶,即為目的蛋白PLD。M-蛋白

15、質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1-PLD發(fā)酵上清液圖2 PLD的SDS分析Fig.2 SDSanalysis of the phospholipase D2.2 PLD-CLEAs的制備與優(yōu)化CLEAs的制備主要包括酶分子的沉淀和酶聚集體的交聯(lián),首先將溶解狀態(tài)的酶利用沉淀劑進(jìn)行物理沉淀形成酶聚集體,再加入交聯(lián)劑使之與酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成不溶的CLEAs。其中沉淀劑的種類(lèi)和濃度、交聯(lián)劑的濃度和交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間均對(duì)CLEAs的制備和酶學(xué)特性有重要影響。沉淀是制備CLEAs的第1步。常用的沉淀劑主要包括非離子型聚合物、水溶性有機(jī)溶劑和中性鹽。為考察沉淀劑種類(lèi)和濃度對(duì)酶沉淀過(guò)程中活性的影響,分別采用不同濃度的乙腈、乙醇、硫酸銨作

16、為沉淀劑對(duì)PLD進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn),隨后用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)對(duì)所得聚集體進(jìn)行復(fù)溶,測(cè)定溶解后的酶活力,并以未處理的PLD的酶活力為100%進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果如圖3。隨著沉淀劑濃度的增加,復(fù)溶后聚集體的酶活力回收呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),但峰值出現(xiàn)的階段有所變化。對(duì)于乙腈和乙醇,分別在體積分?jǐn)?shù)60%和70%時(shí)的酶活力回收率最高,為40.6%和59.2%。但所有濃度條件下的酶活力均低于初始酶活力的60%。酶的失活可能是由于有機(jī)溶劑與酶的非極性殘基之間的疏水相互作用而引起的構(gòu)象變化所導(dǎo)致的18。當(dāng)硫酸銨飽和度為60%80%時(shí),其酶活力均高于PLD的初始酶活力,且濃度為60%時(shí),酶活力回收率達(dá)

17、到最大值,為132.5%。研究表明,當(dāng)硫酸銨飽和度較高(60%)時(shí),會(huì)誘導(dǎo)酶分子形成一種高活化構(gòu)象,使酶分子獲得較高的活性,這種變化稱(chēng)為超活化19-20。因此,選取飽和度為60%的硫酸銨作為沉淀劑。圖3 沉淀劑的種類(lèi)和濃度對(duì)PLD-CLEAs酶活力回收率的影響Fig.3 Effects of precipitants type and concentration on PLD-CLEAs activity recovery戊二醛是CLEAs制備過(guò)程中最常用的雙功能交聯(lián)試劑。利用戊二醛作為交聯(lián)劑,并探索不同濃度的戊二醛對(duì)PLD-CLEAs活性回收率的影響,結(jié)果如圖4。圖4 戊二醛濃度對(duì)PLD-C

18、LEAs酶活力回收率的影響Fig.4 Effects of glutaraldehyde concentration on PLD-CLEAs activity recovery由圖4可知,戊二醛濃度較低時(shí),酶活力回收率較低,主要是因?yàn)榈蜐舛鹊奈於┖兔钢g的交聯(lián)不充分,所得交聯(lián)聚集體的酶損失較多；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.125%時(shí),PLD-CLEAs的酶活力回收率最高,但進(jìn)一步提高戊二醛濃度后,酶活力回收率開(kāi)始下降,可能是因?yàn)檩^小體積的戊二醛進(jìn)入到酶分子內(nèi)部并使其發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián),造成酶活性的損失21；且高交聯(lián)劑濃度下得到的大粒徑CLEAs會(huì)影響酶與底物的結(jié)合,從而降低了酶催化速率22。因此

19、,選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%的戊二醛為交聯(lián)劑。交聯(lián)時(shí)間是制備CLEAs的重要影響因素之一。圖5為不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)PLD-CLEAs酶活力回收率的影響。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍(0.53 h)內(nèi),PLD-CLEAs的酶活力回收率隨交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低,在1.5 h時(shí)達(dá)到最高值。在交聯(lián)前期,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶聚集體增多,得到的固定化酶的酶活力提高；交聯(lián)時(shí)間超過(guò)1.5 h后,過(guò)多的酶聚集在一起,導(dǎo)致PLD-CLEAs空間位阻變大,且由于大量酶活性位點(diǎn)被包埋在聚集體內(nèi)部而阻礙了酶與底物的接觸,造成酶活力回收率下降。因此,制備PLD-CLEAs的最佳交聯(lián)時(shí)間是1.5 h。圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)PLD-CLEAs酶活力

20、回收率的影響Fig.5 Effects of cross-linking time on PLD-CLEAs activity recovery通過(guò)對(duì)PLD-CLEAs制備過(guò)程中的影響因素分析表明,以60%的硫酸銨溶液作為沉淀劑沉淀30 min后,加入0.125%的戊二醛交聯(lián)1.5 h,PLD-CLEAs的酶活力回收率最高,為118.8%。這可能是由于酶分子經(jīng)60%硫酸銨誘導(dǎo)所形成的超活化結(jié)構(gòu),通過(guò)戊二醛交聯(lián),成功地將高活性的酶構(gòu)象保留了下來(lái)。2.3 PLD-CLEAs的特性分析2.3.1 最適催化溫度反應(yīng)溫度對(duì)PLD和PLD-CLEAs活性的影響見(jiàn)圖6。在2545 ,游離與固定化酶的活性均隨

21、溫度的升高而增大,在45 時(shí)兩者的酶活性均達(dá)到最高值,且在相同反應(yīng)溫度下PLD-CLEAs的酶活力較高。當(dāng)溫度45 時(shí),游離PLD的活性迅速下降,在65 時(shí)的活性回收率僅為47.8%,而PLD-CLEAs在65 時(shí)仍具有70.2%的酶活力。相較于游離酶,固定化酶提高了在較高溫度下的反應(yīng)活性,可能是由于戊二醛與酶分子之間的共價(jià)結(jié)合,提高了酶的剛性和構(gòu)象穩(wěn)定性,防止酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)變并保護(hù)酶結(jié)構(gòu)不被破壞,從而增強(qiáng)了酶抵抗外界條件的能力23。圖6 反應(yīng)溫度對(duì)游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the activities of free P

22、LD and PLD-CLEAs2.3.2 最適催化pH酶的固定化通常會(huì)導(dǎo)致酶構(gòu)象的變化,最適催化pH也會(huì)隨之發(fā)生變化。反應(yīng)pH對(duì)游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響見(jiàn)圖7,游離PLD的最適反應(yīng)pH值為8.0,交聯(lián)后的PLD-CLEAs的最適pH是7.0。在pH 5.09.0 PLD-CLEAs的酶活力均高于游離酶,說(shuō)明PLD的交聯(lián)固定化有利于穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)24；而當(dāng)pH9.0時(shí),游離酶的表現(xiàn)更好。表明得到的PLD-CLEAs在低pH條件下比游離酶的耐受性更好,拓寬了PLD的pH應(yīng)用范圍。圖7 反應(yīng)pH對(duì)游離PLD和PLD-CLEAs活性的影響Fig.7 Effect of pH on th

23、e activities of free PLD and PLD-CLEAs2.3.3 熱穩(wěn)定性為了更好地了解CLEAs對(duì)PLD熱穩(wěn)定性的影響,將游離PLD和PLD-CLEAs在50 下保溫不同時(shí)間(06 h)后,測(cè)定他們的剩余酶活力,結(jié)果如圖8。隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng),游離PLD和PLD-CLEAs的活性逐漸降低,但PLD-CLEAs的下降速率明顯小于游離酶的降低速率。保溫2.5 h時(shí),游離酶的活性?xún)H為初始活性的51.3%,而PLD-CLEA仍保留78.6%的初始活性；當(dāng)保溫6 h后,PLD-CLEA的酶活力回收率高達(dá)52.2%,游離PLD已基本失活。表明PLD經(jīng)戊二醛交聯(lián)后,PLD-CLEA的抗熱應(yīng)力能力明顯提高,這主要是因?yàn)槊阜肿娱g發(fā)生交聯(lián)之后,酶分子間的多位點(diǎn)的共價(jià)結(jié)合增強(qiáng)了酶的剛性,防止酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)變并保護(hù)酶結(jié)構(gòu)不被破壞,使其發(fā)生構(gòu)象變化和展開(kāi)的可能性變小,因而提高了其在高溫條件下的穩(wěn)定性25。圖8 游離PLD和PLD-CLEAs的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of free PLD and PLD-CL