牡蠣精氨酸激酶過敏原小鼠過敏模型的建立與分析

1、PAGE 11 -牡蠣精氨酸激酶過敏原小鼠過敏模型的建立與分析在主要的過敏食物中,貝類、魚、花生和堅(jiān)果更有可能引發(fā)危及生命的全身過敏反應(yīng)1。貝類過敏在西方國家中很常見,且逐漸在亞洲部分地區(qū)的兒童和成人中變得普遍2。目前已發(fā)現(xiàn)6種貝類過敏原,包括原肌球蛋白、肌漿鈣結(jié)合蛋白、精氨酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌漿蛋白輕鏈和肌鈣蛋白3-7?？乖状芜M(jìn)入機(jī)體后會誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗體,IgE與肥大細(xì)胞表面的FcR I受體結(jié)合,使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次暴露于相同抗原時,致敏細(xì)胞上的IgE會與其結(jié)合并導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺、類花生酸、蛋白酶和其他趨

2、化和促炎細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì),這些介質(zhì)會募集白細(xì)胞,同時引起平滑肌收縮、血管擴(kuò)張、黏液高分泌和血管通透性增加等生理病理學(xué)變化,這也是過敏癥狀的發(fā)病機(jī)制8-9。有證據(jù)表明,牡蠣的攝入、皮膚和黏膜接觸以及霧化牡蠣蛋白的吸入可導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種臨床癥狀10-12,而牡蠣中的精氨酸激酶(arginine kinase,AK)也被驗(yàn)證為過敏原。過敏原致敏性可以通過比較序列同源性、IgE結(jié)合、血清檢測、消化率和穩(wěn)定性來評估,目前蝦、蟹等過敏原的研究主要集中在這些方向,但合適的動物模型能更直接地確定蛋白質(zhì)的過敏反應(yīng)13,但至今未見牡蠣AK動物致敏模型的相關(guān)報道。過敏食物評價的常用動物模型有BALB/c小鼠、棕色

3、挪威大鼠、豚鼠等,BALB/c小鼠體積小,繁殖周期短,過敏原刺激后偏向Th2型細(xì)胞應(yīng)答且可以產(chǎn)生高效價的IgE,所以選擇該品系小鼠為IgE介導(dǎo)過敏反應(yīng)的研究對象14-15。小鼠的給藥途徑包括口服灌胃、腹腔注射和表皮致敏,口服灌胃能更好地模擬人體經(jīng)口攝入食物過敏原的實(shí)際情況,不過容易誘導(dǎo)免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素會使IL-4、IL-5顯著上升,而IL-2、IFN-基本無變化,并且能選擇性發(fā)生以Th2為主的過敏反應(yīng),所以將它作為黏膜佐劑可有效克服耐受現(xiàn)象16。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用提取純化的牡蠣AK和無毒的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit,CTB)致敏雌性BALB/c小

4、鼠,通過觀察BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)及體重,測定其血清中總IgE(tIgE)、特異性IgE(sIgE)水平和血漿中血項(xiàng)含量的變化,對空腸、肝臟、脾臟和腎臟進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后觀察病理變化,對空腸進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色來觀察肥大細(xì)胞脫顆粒情況,初步建立牡蠣AK BALB/c小鼠過敏模型,為理解貝類過敏的有關(guān)免疫機(jī)制和研發(fā)預(yù)防及治療食物過敏的藥物及治療策略提供有價值的依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料雌性BALB/c小鼠,6周齡,30只,維通利華動物公司,許可證號為SYXK(京)2022-0033；牡蠣AK經(jīng)過提取純化獲得；小鼠IgE酶聯(lián)免疫試劑

5、盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE、抗凝劑EDTA-K2、TMB顯色液、重組霍亂毒素B亞基,碧云天公司。以下所有實(shí)驗(yàn)得到中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院福利倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：20220002)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 BALB/c小鼠的致敏雌性BALB/c小鼠適應(yīng)1周后將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(20只)和PBS對照組(10只),致敏前取血作為陰性血清。使用口服灌胃與腹腔注射牡蠣AK兩種方式對實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行致敏(如圖1)：在第0、8、16、24、32、40天,實(shí)驗(yàn)組每只灌胃含有10 g CTB及600 g AK的200 L PBS進(jìn)行致敏；在第4、12、20、28、36天腹

6、腔注射200 L相同劑量的AK和CTB。在第45天用6 mg/mL的AK(200 L)分別進(jìn)行灌胃和腹腔注射激發(fā)。對照組灌胃等體積PBS(pH 7.4),步驟相同。分別于第16、28、36、40、45天內(nèi)取血,離心收集血清,用于檢測tIgE、sIgE；同時于第16、36、45天取血于7.5% EDTA-K2抗凝管中,離心收集血漿并冷凍于-80 ,用于測定血項(xiàng)水平的變化。圖1 BALB/c小鼠的致敏流程Fig.1 Sensitization procedure of BALB/c mice1.2.2 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)評估在第45天通過灌胃和腹腔注射高濃度牡蠣AK進(jìn)行激發(fā),激發(fā)后

7、2060 min進(jìn)行體溫測量,仔細(xì)察看小鼠全身過敏反應(yīng)現(xiàn)象,同時根據(jù)過敏評分表(表1)確定其表型過敏級數(shù)17-18。表1 過敏反應(yīng)級數(shù)Table 1 Allergy reaction grade平均過敏級數(shù)達(dá)到2級即確定發(fā)生表型過敏反應(yīng)。平均反應(yīng)級數(shù)和過敏率按公式(1)(2)計(jì)算：(1)(2)式中：平均過敏級數(shù)；Ad,過敏級數(shù)；RA,過敏率,%；n,過敏動物數(shù)量；N,總動物數(shù)量。1.2.3 BALB/c小鼠體重和血項(xiàng)指標(biāo)變化致敏期間每2周稱體重,計(jì)算平均體重。第16、36、45天分別取血于含有抗凝劑EDTA-K2的抗凝管中,使用血細(xì)胞分析儀對血漿中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞這3種血項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)

8、行計(jì)數(shù)。1.2.4 tIgE、sIgE水平的檢測利用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測量BALB/c小鼠血清中sIgE,用質(zhì)量濃度為50 g/mL的牡蠣AK包被96孔板,4 孵育過夜；添加300 L/孔的5%脫脂奶粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)37 封閉1 h；再取100 L 2%脫脂奶粉稀釋的BALB/c小鼠血清(15)加入孔中,室溫下孵育3 h；每孔添加100 L HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE(12 000),37 孵育1 h；用200 L TMB避光孵育20 min,然后添加50 L 2 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng),用酶標(biāo)

9、儀于450 nm測量OD值。每兩步之間都用PBST洗滌4次,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用ELISA試劑盒對BALB/c小鼠血清tIgE水平進(jìn)行測定。1.2.5 BALB/c小鼠臟器、腸道病理學(xué)分析第45天激發(fā)采血后,處死小鼠,取其空腸、肝臟、脾臟、腎臟,放入10%的多聚甲醛固定后修剪；用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水處理,石蠟包埋后切片并進(jìn)行HE染色,用顯微鏡觀察組織形態(tài)；空腸甲苯胺藍(lán)染色后觀察其肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS及OriginPro 8.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),P0.01差異極顯著(用*表示)；P0.05差異顯著(用*表示)。2 結(jié)果與分析2.

10、1 BALB/c小鼠的全身主動過敏反應(yīng)結(jié)果第45天口服激發(fā)30 min后,實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出04級過敏癥狀(圖2),其中有7只BALB/c小鼠不斷對鼻子、耳朵、頭周圍及腹部進(jìn)行抓撓,有5只眼或口周圍出現(xiàn)浮腫且毛發(fā)豎立；4只經(jīng)常喘息、側(cè)臥,有3只對外界刺激反應(yīng)遲鈍并伴有顫抖癥狀,僅有1只無明顯癥狀；對照組BALB/c小鼠均未出現(xiàn)過敏癥狀。盡管小鼠在不同過敏級別的數(shù)量上存在一些差異,但表明通過灌胃和腹腔注射AK的BALB/c小鼠從表型來看發(fā)生了過敏反應(yīng),且過敏率為95%。圖2 BALB/c小鼠的過敏反應(yīng)級數(shù)Fig.2 Allergic reaction level of BALB/c mice2.2 B

11、ALB/c小鼠體重和血項(xiàng)指標(biāo)變化2.2.1 BALB/c小鼠體重變化體重變化情況如圖3所示,所有BALB/c小鼠體重均逐漸增長,但與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組體重增加緩慢。在014 d內(nèi)差異不明顯,之后實(shí)驗(yàn)組小鼠體重明比對照組輕,第42天兩者平均體重差約0.5 g。這可能是因?yàn)檫^敏反應(yīng)使其消化吸收系統(tǒng)功能紊亂,影響了小鼠的健康狀態(tài),所以體重增長趨勢平緩。圖3 BALB/c小鼠體重變化Fig.3 Body weight changes of BALB/c mice2.2.2 BALB/c小鼠血項(xiàng)指標(biāo)變化情況當(dāng)同種過敏原再次進(jìn)入處于致敏狀態(tài)的機(jī)體時,機(jī)體內(nèi)細(xì)胞會隨之產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng),從而引起白細(xì)胞數(shù)目及

12、分類的變化。白細(xì)胞是不均一的細(xì)胞群,按照其形態(tài)、功能和來源部位分為：粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,粒細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞(桿狀核及分葉核)、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞,不同類型的白細(xì)胞以不同形式在機(jī)體中發(fā)揮防衛(wèi)作用19。從表2可知,隨著致敏時間的增加,實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加,而對照組基本無變化,在第36、45天呈現(xiàn)出顯著性升高,這說明BALB/c小鼠在免疫期間一直處于過敏狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞在第45天呈現(xiàn)出顯著差異,嗜酸性粒細(xì)胞在第36天開始呈現(xiàn)出極顯著差異,這兩種粒細(xì)胞數(shù)量整體呈增加趨勢。嗜酸性粒細(xì)胞在過敏反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用,該細(xì)胞會釋放有毒的顆粒蛋白和脂質(zhì)介質(zhì),引起組織損傷和功能障礙

13、,加劇炎癥反應(yīng),但也能吞噬抗原抗體復(fù)合物20。這3種血項(xiàng)指標(biāo)的變化也進(jìn)一步說明了實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠對AK產(chǎn)生過敏反應(yīng)。表2 BALB/c小鼠血項(xiàng)指標(biāo)變化Table 2 Changes in blood index of BALB/c mice2.3 血清中tIgE、sIgE的含量變化2.3.1 血清中tIgE的含量I型過敏機(jī)制由IgE介導(dǎo),如圖4所示,隨著免疫時間的增加,實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)tIgE水平也不斷升高,對照組基本維持在11 g/mL左右。與對照組相比,第28天實(shí)驗(yàn)組的tIgE含量開始明顯增加,之后呈上升趨勢,到第45天激發(fā)后實(shí)驗(yàn)組血清中tIgE水平達(dá)到41.06 g/mL,幾乎是對照

14、組的4倍。此外,與第16天比較后,實(shí)驗(yàn)組第45天tIgE含量表現(xiàn)出極顯著的升高。免疫期間實(shí)驗(yàn)組tIgE不斷增加,對照組不變,證明實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠處于較嚴(yán)重的過敏狀態(tài)。圖4 BALB/c小鼠血清總IgE含量Fig.4 Total serum IgE content in BALB/c mice2.3.2 血清中sIgE水平測定血清中sIgE含量是評價過敏原致敏性的重要檢測指標(biāo)。圖5顯示的是BALB/c小鼠在不同階段的血清sIgE水平變化情況,通過對血清sIgE抗體的檢測,能夠確定引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原種類和致敏效果。從第16天到第45天,實(shí)驗(yàn)組sIgE抗體含量逐漸升高,且明顯高于正常值。在激

15、發(fā)實(shí)驗(yàn)后,與對照組sIgE含量相比有顯著提高。因此,BALB/c小鼠的過敏反應(yīng)是由牡蠣AK引起的。圖5 BALB/c小鼠的sIgE變化Fig.5 sIgE changes in BALB/c mice將牡蠣過敏患者血清與BALB/c小鼠致敏血清的sIgE含量相比(圖6),發(fā)現(xiàn)患者、小鼠的致敏血清與對照組對比后都出現(xiàn)極顯著增加,但患者和鼠的過敏血清無顯著性差異,從而成功獲得其種屬特異性AK致敏血清。RC-對照組BALB/c小鼠血清；R-實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠血清；HC-正常人血清；H-對牡蠣過敏的人血清圖6 人和BALB/c小鼠的sIgE比較Fig.6 Comparison of sIgE be

16、tween human and BALB/c mice2.4 組織病理學(xué)染色分析空腸、脾臟、肝臟、腎臟的組織切片如圖7所示,對照組小鼠各臟器組織結(jié)構(gòu)正常,基本無明顯病理改變(圖7-a1圖7-d1)。實(shí)驗(yàn)組肝臟中央靜脈和肝竇都明顯擴(kuò)張充血,一些肝細(xì)胞索斷開、收縮且使血液相互融合從而產(chǎn)生淤血帶(圖7-a2)。實(shí)驗(yàn)組腸絨毛上皮脫落、紊亂,腸黏膜間質(zhì)中炎細(xì)胞局部浸潤,血管充血水腫,組織疏松(圖7-b2)。有研究發(fā)現(xiàn),在鼠灌胃致敏模擬食物過敏中,其腸道產(chǎn)生過敏癥狀,慢性炎癥導(dǎo)致屏障功能的調(diào)節(jié)和上皮滲透性的增加,小腸組織造成損傷,從而使腸道攝取更多的免疫完整的大分子21。實(shí)驗(yàn)組脾臟紅髓部分充血,邊緣竇有許

17、多淋巴灶(圖7-c2)。模型組腎臟患腎小球炎,血管球成分葉狀,基底膜稍有增厚,炎癥細(xì)胞增加(圖7-d2)。這也許是因?yàn)檫^敏反應(yīng)產(chǎn)生許多嗜酸性粒細(xì)胞,進(jìn)入腎臟后使BALB/c小鼠的器官發(fā)生病變。a-肝臟HE染色；b-空腸HE染色；c-脾臟HE染色；d-腎臟HE染色；e-空腸甲苯胺藍(lán)染色；1-對照組；2-實(shí)驗(yàn)組圖7 器官HE與甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果Fig.7 Results of organ HE and toluidine blue staining空腸組織經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后如圖7-e所示,肥大細(xì)胞顆粒呈藍(lán)紫色,胞核為藍(lán)色。對照組的小鼠腸道(圖7-e1)固有層肥大細(xì)胞較少、胞膜完整、輪廓清晰,只有很小一

18、部分脫顆粒,而模型組的腸(圖7-e2)固有層肥大細(xì)胞增加,很多肥大細(xì)胞脫顆粒后胞膜破損、輪廓模糊。肥大細(xì)胞是I型過敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞,IgE由B細(xì)胞受抗原刺激后分泌,肥大細(xì)胞表面的FcR I受體能夠結(jié)合IgE的Fc片段,當(dāng)抗原再次入侵時,IgE的Fab片段識別和結(jié)合抗原,抗原、IgE和FcR I之間的交聯(lián)導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放顆粒22-23。所以肥大細(xì)胞脫顆粒是過敏反應(yīng)研究的主要階段,其數(shù)量及脫顆粒情況能夠良好的反映組織過敏情況。病理觀察表明實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠空腸已產(chǎn)生明顯的過敏現(xiàn)象。3 結(jié)論由于經(jīng)濟(jì)全球化和人類飲食結(jié)構(gòu)的改變,牡蠣引起的過敏性疾病發(fā)病率正逐漸增加,這對人們的身體健康和生活質(zhì)量形成了極大的威脅。本研究利用天然牡蠣AK通過經(jīng)口灌胃與腹腔注射結(jié)合并添加CTB佐劑的方式致敏BALB/c小鼠,同時從表型過敏級數(shù)、體重方面證明實(shí)驗(yàn)組