DB12-T178-2003對(duì)蝦弧菌病(vibriosis)的檢疫規(guī)程

1、ICS65.105ICS65.105B50 備案號(hào)：DB天 津 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T 1782003對(duì)蝦弧菌病(Vibriosis)的檢疫規(guī)程The Quarantion Istruction for Penaeus Vibriosis2004-01-01 實(shí)施2003-11-25 2004-01-01 實(shí)施天津市技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T 1782003DB12/T 1782003本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由天津市水產(chǎn)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市水產(chǎn)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市水產(chǎn)研究所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李秀梅、付志茹、趙燕超 本標(biāo)準(zhǔn)于2003年11月發(fā)布DB12/T

2、 1782003DB12/T 1782003 對(duì)蝦弧菌病（Vibriosis）的檢疫規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了對(duì)蝦弧菌病的檢疫規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于天津地區(qū)對(duì)蝦弧菌病的檢疫，也適用于我國(guó)國(guó)內(nèi)地區(qū)間同種疫病的檢疫、診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的 修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究 是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB4789. 128食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分GB/T 6682-1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

3、180882000出入境動(dòng)物檢疫釆樣SN0173出口食品副溶血弧菌檢疫方法3準(zhǔn)備3.1設(shè)備和儀器設(shè)備和儀器見附錄A。3.2培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑的配制方法見附錄B。4采樣4.1采樣數(shù)量對(duì)無癥狀的蝦體釆樣：按照GB/T 18088-2000的規(guī)定執(zhí)行。對(duì)有癥狀的蝦體，隨機(jī)挑取不少于10 尾有發(fā)病癥狀的新鮮或?yàn)l死的個(gè)體。4.2采集部位懷疑有病原存在的組織或器官。5實(shí)驗(yàn)室用水要求按照GB/T 6682-1992的規(guī)定執(zhí)行。6臨床癥狀患病的幼蝦行動(dòng)遲緩、體表或附肢上易粘附臟物，眼球腫脹，由黑變褐，隨后潰爛脫落，僅留眼柄。 肝胰腺組織及血淋巴液中有大量弧菌。被感染的成蝦，身體消瘦，甲殼與肌肉間空隙加大

4、，頭胸甲的心 區(qū)上方成白色或淡桔紅色，附肢發(fā)紅，病重個(gè)體呈鮮紅色（紅腿病重者有的出現(xiàn)爛離）血淋巴液中弧菌 很多。7實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)7.1取樣針對(duì)患病的對(duì)蝦，眼部潰爛或紅肢或爛觥，直接用接種環(huán)無菌操作，從病灶取樣在TCBS培養(yǎng)基上劃 線接種；如果病灶不明顯，用75%酒精棉球擦凈被檢蝦體表，揭開頭胸甲，用接種環(huán)無菌操作，從肝胰 腺及血淋巴液中取組織塊放在TCBS培養(yǎng)基上，輕壓組織塊，在培養(yǎng)基上劃線接種。7.2培養(yǎng)倒置TCBS平皿，37C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，分別挑選不同顏色、大小和形狀的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接到普通 瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離純化培養(yǎng)。7.3取待檢菌作下列檢驗(yàn)菌體運(yùn)動(dòng)性觀察選厚薄在1. 11. 2

5、mm的干凈載玻片一塊，加一滴無菌水至載玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌菌苔少 許，涂抹在水滴中，加蓋玻片用400600倍的暗視野顯微鏡觀察菌體是否運(yùn)動(dòng)。菌體染色特性與形態(tài)觀察取干凈載玻片一塊，滴12滴無菌水，用接種環(huán)挑取待檢菌菌苔少許涂片，干燥后在火焰上通過 三次固定，滴加革藍(lán)氏染液，I液染Imin, II液染2min, 液脫色至酒精剛不出現(xiàn)藍(lán)紫色為止，IV 液染12min。用油鏡觀察染色特性和形態(tài)。氧化酶試驗(yàn)用滅菌接種環(huán)挑取普通瓊脂平板上分離純化培養(yǎng)的待檢菌涂于氧化酶紙片上或直接用紙片沾取菌 落，1020秒鐘觀察結(jié)果，陽性為紫紅色，陰性為無色或淡黃色?；【频募?xì)菌應(yīng)為氧化酶陽性，但弧 菌屬中的梅氏

6、弧菌例外，為氧化酶陰性，須予以區(qū)別對(duì)待。氧化-發(fā)酵試驗(yàn)即（0-F）試驗(yàn)將被檢菌接種到0-F生化管中，并加滅菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基液面，約加1cm,然后置滅菌平皿內(nèi)， 35C培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。如0-F生化管變黃色，則為發(fā)酵型細(xì)菌?；【频募?xì)菌應(yīng)為發(fā)酵型代謝。用弧菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-9V進(jìn)行檢驗(yàn)用接種環(huán)挑取在普通瓊脂平板上28C培養(yǎng)1824h的菌苔少許，分別加入生化鑒定管:賴氨酸、精 氨酸、鳥氨酸、葡萄糖產(chǎn)氣、蔗糖、甘露醇、水楊昔、6%氯化鈉、枸橡酸鹽中，進(jìn)行九項(xiàng)生化反應(yīng)。其 中賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸和氨基酸空白對(duì)照管都應(yīng)加入滅菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基液面，約加0.5cm, 然后置滅菌

7、平皿內(nèi)，經(jīng)35C過夜孵育后，將反應(yīng)結(jié)果記錄在鑒定單上，見表1,并按照所示的方法記取 由反應(yīng)結(jié)果得出的相應(yīng)編碼，得到一個(gè)三位數(shù)字，查檢索編碼表，確定鑒定結(jié)果。8判定主要致病弧菌的判定見表2。表2主要致病弧菌的判定名稱細(xì)菌在 TCBS培養(yǎng) 基上的菌 落顏色菌落形態(tài) 光澤菌體運(yùn)動(dòng) 情況革藍(lán)氏 染色生化管反 應(yīng)結(jié)果血清凝集試驗(yàn) 按 GB4789. 1 28食品衛(wèi)生檢 驗(yàn)方法微生物 學(xué)部分進(jìn)行副溶血弧菌藍(lán)綠角圓形，邊緣整齊，濕 潤(rùn)，稍混濁，半透明， 多數(shù)為尖形，半笠狀 直徑24mm活潑陰性依據(jù)得到 的相應(yīng)編 碼査檢索 編碼表不做非0-1群霍 亂弧菌桔紅色或 黃色菌落正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明運(yùn)

8、動(dòng)活潑 呈穿梭狀陰性同上不凝集0-1群霍亂 弧菌桔紅色或 黃色菌落正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明運(yùn)動(dòng)活潑 呈穿梭狀陰性同上凝集溶藻弧菌桔紅色或 黃色菌落 隨時(shí)間延 長(zhǎng)會(huì)變?yōu)?藍(lán)綠色正圓隆起，周緣光 滑，有光澤，半透明活潑陰性同上不做注：表中所列的病原，對(duì)海水魚蝦類均有一定的致病力，危害多種蝦類，可使對(duì)蝦的幼蝦、成蝦階 段感染發(fā)病，幼蝦階段表現(xiàn)為菌血癥，成蝦有爛眼病、紅腿病及爛觥病。凡是在組織器官中檢驗(yàn)出所列 病原菌的，即判定為弧菌病。附錄A（資料性附錄）設(shè)備和儀器顯微鏡（具油鏡和暗視野）、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿和接種環(huán)，以及水生動(dòng)物檢疫所用 的常規(guī)儀器和設(shè)備。附錄B（資料性附錄）試劑配制B. 1硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基： TOC o 1-5 h z 酵母浸膏5. 0g蛋白腺10.0g氯化鈉10.0g檸檬酸鈉10. 0g膽酸鈉（牛膽酸鈉也可）3.0g牛膽代粉（混合膽鹽代替也可）5.0g蔗糖20.0g檸檬酸鐵l.Og瓊脂18.0g漠麝香草酚藍(lán)0. 04g麝香草酚藍(lán)0. 04g蒸饞水1000ml除指示劑外,將各種成分加熱溶解，調(diào)整pH至8. 6后，加入指示劑。此培養(yǎng)基不必高壓滅菌，煮沸12min,待培養(yǎng)基稍涼后傾注平板。（可直接購置商品）B.2革藍(lán)氏染液：I、結(jié)晶紫酒精飽和