液相色譜法分離幾種酸性化合物的探究

1、液相色譜法分離幾種酸性化合物的探究攵鵬 王嘉希 蔡文靜王志強(qiáng) 唐曉彤武漢武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院430072摘要：建立了用HPLC分離硫脲、苯甲酸、水楊酸、對(duì)氨基水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸等五種 物質(zhì)的分離條件，即40%體積甲醇與60%體積磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液為1mol/L，pH 為3.0，淋洗劑最終pH3.5，在反向鍵合硅膠柱為固定相，以230nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，得到了較 好的分離效果。并討論了優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。關(guān)鍵詞：高效液相色譜法芳香族羧酸優(yōu)化條件Abstract： build up the HPLC separation for thiourea, benzoic acid, sa

2、licylic acid, p-hydroxide benzoic acid, p-amino salicylic acid to alcohol and their separation conditions, witch is 40% volume methanol and 60% volume phosphate buffer, including phosphate buffer 1 mol/L, pH 3.0, and drench lotion final pH lower than 3.5, in reverse bonded silica gel column for stat

3、ionary phase, with 230nm wavelength for detection and finally obtained a good separation effect. What more, discussed the optimization condition for the influence of experimental results.芳香族羧酸的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，在許多藥品、食品以及化妝品中都含有一定量的一 種或多種芳香族羧酸或其衍生物。但因其存在毒害性，對(duì)其在相關(guān)產(chǎn)品中的用量有嚴(yán)格的規(guī) 定，為了滿足制造工藝及控制質(zhì)量的要求，須了解產(chǎn)品中各種芳香酸的實(shí)際含

4、量，因此，建 立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的芳香族羧酸的分析方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)五種物質(zhì)的分離，提供了一 種可行的方案。1.方法概述：目前，文獻(xiàn)報(bào)道分析芳香族羧酸的方法主要有氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)， 離子色譜法(Ion Chromatography，IC)，離子排斥色譜法(Ion-Exclusion Chromatography，IEC)， 毛細(xì)管電泳法(Capillary Electrophoresis， CE)，高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)以及高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(High Perfor

5、mance Liquid Chromatography-Mass Spectrum， HPLC-Ms) Ul 本實(shí)驗(yàn)采用較為廣泛的 HPLC 法。1.1高效液相色譜法：高效液相色譜法同時(shí)具備分離效率高、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu) 點(diǎn)，應(yīng)用比較廣泛。在近年的文獻(xiàn)中多有報(bào)道，具有較好的應(yīng)用前景。1.2條件控制：對(duì)色譜法而言，條件選擇及其控制極為重要，高效液相色譜法中，分離效果受多種因素影響主要有：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：芳香羧酸由于苯環(huán)的存在通常在紫外波段具有較好的吸收， 硫脲在此區(qū)域也存在吸收，故實(shí)驗(yàn)采用此外吸收檢測(cè)器。但由于羧酸種類不同，導(dǎo)致各物質(zhì) 在具體吸收譜圖存在差異，采用不同的吸收波長(zhǎng)將會(huì)有不同

6、的實(shí)驗(yàn)效果。流動(dòng)相與固定相的選擇：色譜法的重點(diǎn)在于用不同的流動(dòng)相和固定相使樣品分離， 即各物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相的分配比例，本實(shí)驗(yàn)中提供C-18反向鍵合硅膠柱，不在探討范 圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相主要成分為甲醇-水體系，通過極性的改變而改變各成分保留值。流動(dòng)相pH值的選擇：由于本實(shí)驗(yàn)主要分離羧酸類物質(zhì)，都具有一定酸性，不同pH 環(huán)境下將有不同程度的解離，從而有不同的保留現(xiàn)象，這點(diǎn)在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案中極為重要。實(shí) 際實(shí)驗(yàn)過程中，用磷酸鹽緩沖體系代替水調(diào)節(jié)pH，找到最佳條件。由于用磷酸緩沖體系代 替水，改變比例時(shí)將會(huì)使pH隨之改變，故實(shí)際上兩個(gè)條件同時(shí)改變。3實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純，配成5mg/mL甲醇溶液作為母液

7、。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間的限制，本實(shí)驗(yàn)未能采用控制變量的方法逐步確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，由以 上分析，采用逐步優(yōu)化的方法，也得到了令人滿意的結(jié)果。2.1檢測(cè)波長(zhǎng)：由參考文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改254nm的檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。2.2流動(dòng)相條件優(yōu)化：圖一：甲醇-水90:10的中性溶液譜圖0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0 min圖二：甲醇-磷酸緩沖液50:50 （最終淋洗劑pH4.5）譜圖可以看到，圖一中各組分基本沒有分離。改變條件：甲醇-1mol/L，pH為4磷酸緩沖液50:50，得到譜圖2（如上）：可以看到部分組分已經(jīng)完全分離，但仍有未分離組分。單樣測(cè)定：以備確定

8、各峰成分并調(diào)節(jié)單樣用量以使峰面積基本一致，故先采用與上混樣各成分濃度相同的單樣進(jìn)行檢測(cè)，得到結(jié)果列于表組分濃度保留時(shí)間/min峰積分面積對(duì)氨基水楊酸0.1mg/mL2羥基苯甲酸0.02mg/mL2.7222236651硫脲0.05mg/mL1.7094044929水楊酸0.01mg/mL3.99911666337苯甲酸0.1mg/mL5.66445060106表一：甲醇-磷酸緩沖液50:50 （最終淋洗劑pH4.5）單樣保留行為依據(jù)單樣保留行為重新得到混樣進(jìn)行檢測(cè)：與上述條件相同下，得到譜圖3：0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56

9、.06.57.0min圖三：甲醇-磷酸緩沖液50:50 （最終淋洗劑pH4.5）,調(diào)整濃度后譜圖調(diào)整后濃度：對(duì)氨基水楊酸0.05mg/mL，對(duì)羥基苯甲酸0.10mg/mL，水楊酸0.05mg/mL，硫脲0.025mg/mL，苯甲酸0.025mg/mL?？梢钥吹?，峰面積基本一致，已基本可以分離。進(jìn)一步優(yōu)化：將磷酸緩沖液原pH改為3，甲醇-磷酸緩沖液50:50，進(jìn)行測(cè)試，得到譜圖4：0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0 min圖四：甲醇-磷酸緩沖液50:50 （最終淋洗劑pH3.5）譜圖可以看到，調(diào)節(jié)的效果并不明顯，只是增加了保留時(shí)間，說明此時(shí)pH已不是控制

10、因素。改變甲醇-水比例：由以上實(shí)驗(yàn)，最后改變流動(dòng)相比例，同時(shí)將各組分均稀釋一倍， 得到譜圖5：0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.016.017.018.019.0 min圖五：甲醇-磷酸緩沖液40:60 （最終淋洗劑pH3.1）譜圖從圖中可以看到，所有組分已經(jīng)實(shí)現(xiàn)完全分離。其中各組分保留數(shù)據(jù)列于表二：組分濃度mg/mL保留時(shí)間/min峰積分面積對(duì)氨基水楊酸0.0253.2778970218對(duì)羥基苯甲酸0.054.55011062896水楊酸0.02513.6766574008硫脲0.01251.7807193695苯甲酸0

11、.012518.1266221234表二：實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.實(shí)驗(yàn)討論：3.1 pH的影響，由于本實(shí)驗(yàn)多數(shù)物質(zhì)為羧酸類，有一定的酸性且酸性各不相同，故pH 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響十分明顯，若不進(jìn)行酸化，則各物質(zhì)均會(huì)有明顯的拖尾現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的準(zhǔn)確性，而不同的酸性以及硫脲的存在使得淋洗劑酸性不能過強(qiáng)，否則形成佯鹽，又使組 分物質(zhì)帶電而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。附：各酸性物質(zhì)離解常數(shù)：組分pKa1pR對(duì)氨基水楊酸3.25對(duì)羥基苯甲酸4.57水楊酸2.9812.38硫脲-苯甲酸4.20從現(xiàn)象線上看，當(dāng)pH值降低時(shí)，峰形趨向集中，即拖尾現(xiàn)象得到改善。同時(shí)，硫脲為 中性物質(zhì)，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)果為保留時(shí)間最短，可以說明在弱酸環(huán)境中，

12、硫脲結(jié)合一個(gè)質(zhì)子而呈 電正性反而保留時(shí)間最短。說明了 pH調(diào)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重大影響。當(dāng)pH從4.5變?yōu)?.5時(shí)，分離效果并未得到明顯提高，說明此時(shí)pH已不是控制因素， 若繼續(xù)降低降低pH并不能改善分離效果，反而此時(shí)會(huì)增加保留時(shí)間，增加試驗(yàn)成本，故本 實(shí)驗(yàn)pH調(diào)節(jié)在3-4之間即可。pH主要調(diào)節(jié)拖尾峰形，并對(duì)中性物質(zhì)改變保留行為，但對(duì)物質(zhì)分離作用并不明顯。3.2流動(dòng)相極性的影響，本實(shí)驗(yàn)HPLC分離主要原理即為不同極性的淋洗劑對(duì)物質(zhì)有不 同的保留行為，關(guān)鍵即在極性調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)極性比例由甲醇含量90，到50，再到40，可以 看到分離效果有了明顯提升。極性較低時(shí)，所有物質(zhì)保留時(shí)間均在3min之前，完全達(dá)

13、不到分離效果，增加極性后， 在50:50的淋洗劑下，已能使保留性質(zhì)最相近的兩種物質(zhì)分離度在0.5以上，而在40:60的 淋洗劑條件下則可以使各組分完全分離，分離度最低也在2以上。說明調(diào)節(jié)極性是最主要的 調(diào)節(jié)措施。同時(shí)可以觀察到，極性的增加使保留時(shí)間延長(zhǎng)，增加了試驗(yàn)成本，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí) 驗(yàn)在甲醇與水比例為40:60時(shí)即可達(dá)到分離效果。3.3肩峰，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了明顯的肩峰，甚至肩峰成為劈叉峰，由于排除了物質(zhì)不純，未 分離的可能，擬探討原因如下：柱子老化與缺陷，由于可能存在的柱子老化與缺陷原因，使柱效并不能平均分配于各 個(gè)部分，但進(jìn)樣樣品均勻分布，從而產(chǎn)生保留時(shí)間差產(chǎn)生肩峰。對(duì)比譜圖，可以發(fā)現(xiàn)，隨

14、著pH降低，肩峰現(xiàn)象更加明顯，而組分中出現(xiàn)肩峰的各物 質(zhì)均為羧酸，硫脲沒有這樣的現(xiàn)象，故而，肩峰的出現(xiàn)應(yīng)當(dāng)與酸性有關(guān)。應(yīng)當(dāng)在疏水作用外 還有其他作用力存在。3.4保留時(shí)間，如上所述，除外部因素對(duì)實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間有影響外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到， 保留時(shí)間主要影響因素是物質(zhì)極性，極性越大則保留時(shí)間越短，但極性不是唯一因素，在較 高強(qiáng)度的酸度下，硫脲作為中性物質(zhì)，其保留時(shí)間最短，說明了pH的調(diào)節(jié)結(jié)果。4.結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)用HPLC分離硫脲、苯甲酸、水楊酸、對(duì)氨基水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸等五 種物質(zhì)，得到可行分離條件為40%體積甲醇與60%體積磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液為 1mol/L，pH為3.0，淋洗劑最終pH3.1，以C-18反向鍵合硅膠柱為固定相，以230nm為檢 測(cè)波長(zhǎng)，得到了較好的分離效果。