試驗原理乙醇沉淀dna

1、堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA堿裂解法是較常用的質(zhì)粒DNA提取方法。其優(yōu)點(diǎn)是收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。實驗原理 溶液I: GTE50mM葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。25mM Tris-Cl（pH 8.0）10mM EDTA：是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，并抑制微生物生長。實驗原理溶液II: NaOH/SDS溶液0.2 N NaOH：是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向mice

2、lle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。由于質(zhì)粒和細(xì)菌染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂。因此，在裂解細(xì)菌時要注意：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下DNA片斷會慢慢斷裂；第二，混合必須輕柔，不然DNA也會斷裂。1% SDS（十二烷基磺酸鈉）：是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。實驗原理溶液III：醋酸鉀溶液，Ph4.8當(dāng)加入pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時， 質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速復(fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則難以復(fù)性。SDS遇到鉀離子后變成

3、十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高濃度的鹽使得沉淀更完全。SDS極易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。同時，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合，由于大腸桿菌的基因組DNA很長，很容易和變性的蛋白質(zhì)纏繞在一起。在離心時，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，變性蛋白質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA以可溶性狀態(tài)留在上清夜中。實驗原理酚/氯仿抽提可以通過酚、氯仿抽提去除殘留的蛋白質(zhì)。酚和氯仿都是蛋白質(zhì)的變性劑，但酚的變性作用要遠(yuǎn)大于氯仿。由于酚能溶解10%-15%的水

4、，因此在使用前要用Tris溶液飽和。以免減少抽提過程中DNA溶液的損失。水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；氯仿和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。由于酚與水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后會有少量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。實驗原理乙醇沉淀DNA回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，乙醇可以消除核酸的水化層，使帶負(fù)電

5、荷的磷酸基團(tuán)暴露出來。Na離子能與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。最常用的鹽是醋酸銨氯化鋰氯化鈉醋酸鈉。沉淀體系如果鹽濃度高，應(yīng)在室溫下沉淀。放到20，時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀。為了去除隨DNA沉淀的鹽，可用70%的乙醇洗滌沉淀。實驗原理DNA的溶解DNA沉淀經(jīng)過70%的乙醇洗滌后，在實驗臺上敞口放置一定時間，使殘余乙醇揮發(fā)掉。當(dāng)DNA沉淀仍有些潮濕的時候，用適當(dāng)緩沖液溶解便可溶得快速而且完全。完全干燥的DNA沉淀溶解緩慢且效率較低。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（20 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的

6、RNA會干擾電泳結(jié)果的。實驗步驟 取1.5ml過夜培養(yǎng)菌置于1.5ml離心管中，于微量離心機(jī)上以12000rpm離心1min。棄上清液。重復(fù)步驟1、2 。短暫離心后，盡量吸干上清液。沉淀中加100l溶液I，充分懸浮沉淀（用移液體器吹打懸浮或劇烈振蕩）。加入200l溶液 II(新鮮配置)，加蓋后緩慢顛倒離心管6次混勻（千萬不要振蕩），室溫防置不超過5 min 。加入150l預(yù)冷溶液III，緩慢顛倒6次混勻，置于冰浴15 min 。實驗步驟 微量離心機(jī)上以4，12000rpm離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的1.5ml離心管中。加入等體積酚/氯仿（1：1），震蕩1min。12000rpm,離心5min。小心轉(zhuǎn)移上層溶液至一新的離心管，棄去中層的蛋白質(zhì)和下層的有機(jī)相。加入等體積氯仿，震蕩1min 。12000rpm,離心5min。實驗步驟 小心轉(zhuǎn)移上層溶液至一新的離心管，加入 2 倍體積100%乙醇,混勻。室溫放置15min。12000g10min。去上清，用0.5ml70%乙醇淋洗沉淀(不要把沉淀懸浮起來)。12000g30秒。盡量去上清。在室溫下晾干沉淀。加入50lTE緩沖液（PH 8.0，含20g/mlRNaseA）溶解質(zhì)粒DNA 。80溫育20min 。-20保存。一、請完