研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法

1、引言在許多的細(xì)胞生命活動(dòng)中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問(wèn)題。重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們已分離到了許多重要的基因?，F(xiàn)在的關(guān)鍵問(wèn)題是需要揭示環(huán)境 因子及發(fā)育信號(hào)究竟是如何控制基因的轉(zhuǎn)錄活性。為此需要：a、鑒定分析參與基因表達(dá)調(diào)控的DNA元件；b、分離并鑒定這些順式元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子；這些問(wèn)題的研究都涉及到 DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法主要包括：a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)；b、DNase 1足跡實(shí)驗(yàn)；c、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)；d、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)；f、拉下實(shí)驗(yàn)。二、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)1、概念：凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Gel re

2、tardation assay),要叫做DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(DNA mobility shift assay ) 或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)(Band retardation assay)是在八十年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。2、原理：在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA分子向正電極移動(dòng)距離的大小是同其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果某種 DNA分子結(jié)合上一種特殊的蛋白質(zhì)，那么由于分子量的加大它在 凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，于是朝正極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)的縮短，因而在凝膠中出現(xiàn)滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理。3、過(guò)程：1)首先制備細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物(

3、理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子)2)用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段(含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn))3)這種被標(biāo)記的探針 DNA同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物4)在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5)最后進(jìn)行放射自顯影，分析電泳結(jié)果4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析：a、如果有放射性標(biāo)記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細(xì)胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；b、如果在凝膠的頂部出現(xiàn)放射性標(biāo)記的條帶，這就表明細(xì)胞提取物存在可與探針DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。5、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)(DNA competitiv

4、e assay)的具體做法如下：在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA (competitor DNA ),如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)， 那么由于競(jìng)爭(zhēng) DNA與探針DNA相比是極大 超量的，這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會(huì)被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài)，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶；如果反應(yīng)體系中加入的競(jìng)爭(zhēng)DNA并不能同探針DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會(huì)出現(xiàn)阻滯的條帶。6、應(yīng)用：a、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)可以用于鑒定在特殊類型細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中，是否存在能同某一特定的DNA （含

5、有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；b、DNA競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位；c、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的堿基突變可以研究此種突變競(jìng)爭(zhēng)性能及其轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合作用的影響；d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過(guò)親和層析來(lái)分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。 三、足跡實(shí)驗(yàn)1、定義：足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printing assay）,是一種用來(lái)檢測(cè)被特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列的位置及其核甘酸序列結(jié)構(gòu)的專門(mén)實(shí)驗(yàn)方法。2、原理：當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNasel酶的切割作用，而不會(huì)產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果

6、在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū)，俗稱為“足跡”。 3過(guò)程： 將待檢測(cè)的雙鏈 DNA分子在體外用32P作5 末端標(biāo)記，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其 中的一個(gè)末端，于是便得到了一條單鏈末端標(biāo)記的雙鏈DNA在體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（細(xì)胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在反應(yīng)混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂：a、如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與 DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使 DNase I消化之后，便會(huì)產(chǎn)生 出距離放射性標(biāo)記末端 1個(gè)核甘酸，2個(gè)核甘酸，3個(gè)核甘酸-等等一系列前后長(zhǎng)度均相 差一個(gè)核甘酸的不間斷的連續(xù)的

7、 DNA片段梯度群體；b、如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護(hù)免受DNase I酶的降解作用； 除去蛋白，加樣在 20%序列膠上進(jìn)行電泳分離，實(shí)驗(yàn)分兩組：a、實(shí)驗(yàn)組：DNA+蛋白質(zhì)混合物b、對(duì)照組：只有 DNA,未與蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行溫育 最后進(jìn)行放射性自顯影，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、結(jié)果判斷：實(shí)驗(yàn)組凝膠電泳顯示的序列，出現(xiàn)空白的區(qū)域表明是轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合部；與對(duì)照組序列比較，便可以得出蛋白質(zhì)結(jié)合部位的DNA區(qū)段相應(yīng)的核甘酸序列。5、其他的足跡實(shí)驗(yàn)方法：除了 DNase1足跡試驗(yàn)之外，目前還發(fā)展出了若干種其他類型的足跡實(shí)驗(yàn)，例如：a、自由羥基足跡實(shí)驗(yàn)；b

8、、菲咯咻銅足跡實(shí)驗(yàn)；c、DMS（硫酸二甲酯）足跡實(shí)驗(yàn)DMS（硫酸二甲酯）足跡實(shí)驗(yàn)的原理DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥(niǎo)喋吟（G）殘基甲基化，而六氫口比咤又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割。如果DNA分子中某一區(qū)段同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就可以避免發(fā)生G殘基的甲基化而免受六氫口比咤的切割作用。 四、甲基化干擾實(shí)驗(yàn) 1、概念： 甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（Methylation interference assay）是本據(jù) DMS （硫酸二甲酯）能夠使 DNA 分子中裸露的鳥(niǎo)喋吟（G）殘基甲基化，而六氫口比咤又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割這一原理設(shè)計(jì)的另一種研究蛋白質(zhì)同DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用這種技

9、術(shù)可以檢測(cè)靶 DNA中G殘基的優(yōu)先甲基化，對(duì)爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)的揭示出DNA與蛋白質(zhì)相互作用的模式。2、實(shí)驗(yàn)步驟：用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發(fā)生一個(gè)G堿基甲基化作用）同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，促進(jìn)使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行凝膠電泳形成兩種靶 DNA條帶：a、其一沒(méi)有同蛋白質(zhì)結(jié)合的 DNA正常電泳條帶b、其二同特異蛋白質(zhì)結(jié)合而呈現(xiàn)滯后的DNA電泳條帶將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，并用六氫毗咤進(jìn)行切割，結(jié)果為：a、甲基化的G殘基被切割：因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)只能夠同未發(fā)生甲基化的正常的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，所以在轉(zhuǎn)錄因子 DNA結(jié)合位點(diǎn)

10、序列中的 G殘基如果被DMS甲基化之后，轉(zhuǎn)錄因子就無(wú)法同其結(jié)合位點(diǎn)（順式元件）發(fā)生結(jié)合作用，從而使得結(jié)合位點(diǎn)中的G殘基同樣也要被六氫口比咤切割；b、不具有甲基化G殘基的靶DNA序列則不會(huì)被切割將結(jié)合蛋白質(zhì)的 DNA條帶和不結(jié)合蛋白質(zhì)的 DNA條帶，經(jīng)六氫口比咤切割作用之后，再進(jìn)行凝膠電泳作放射自顯影，讀片并分析結(jié)果3、結(jié)果判斷：a、同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶 DNA序列，經(jīng)六氫口比咤切割之后，電泳分離呈現(xiàn)兩條帶，有 一個(gè)空白區(qū)b、不同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶 DNA序列，經(jīng)六氫口比咤切割后，電泳分離呈現(xiàn)三條帶，沒(méi) 有空白區(qū)域的出現(xiàn)。4、應(yīng)用：a、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)中

11、的 G殘基之間的聯(lián)系；b、是足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡實(shí)驗(yàn)中 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置5、缺點(diǎn)：DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使 T和C殘基甲基化。五、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)上面討論的三種研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用的方法，有一個(gè)共同的不足之處在于它們是在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，因此人們就會(huì)考慮這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否能夠反映細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的真實(shí)生命過(guò) 程，即細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的真實(shí)的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用情況。為了解答這個(gè)問(wèn)題， 科學(xué)家就設(shè)計(jì)出了一種體內(nèi)足跡試驗(yàn)（in vivo foot-printing assay ）,該方法可以看做是體外 DMS足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)變種。1、原理：體內(nèi)

12、足跡試驗(yàn)的原理原則上同體外DMS足跡實(shí)驗(yàn)無(wú)本質(zhì)差別，即a、DMS能夠使G殘基甲基化；b、六氫口比咤能特異的切割甲基化的G殘基；c、同特異轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的識(shí)別序列中的G殘基由于受到蛋白質(zhì)的保護(hù)而不會(huì)被DMS甲基化，于是不會(huì)被六氫口比咤切割；d、同對(duì)照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會(huì)發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞DNA形成的序列梯中缺少 G 殘基沒(méi)有被切割的相應(yīng)條帶。2、過(guò)程：用有限數(shù)量的化學(xué)試劑 DMS處理完整的游離細(xì)胞，使?jié)B透到胞內(nèi)的DMS濃度恰好導(dǎo)致天然 染色體DNA的G殘基發(fā)生甲基化對(duì)這些經(jīng)過(guò)DMS處理的細(xì)胞提取 DNA,并在體外加入六氫口比咤作消化反應(yīng)PCR擴(kuò)增后作凝膠電泳分析，因?yàn)樵隗w外實(shí)驗(yàn)中用

13、的是克隆的DNA片段其數(shù)量足夠，而在體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的 DNA,其數(shù)量是微不足道的，所以需要經(jīng) PCR擴(kuò)增以獲得足夠數(shù)量的特異 DNA放射自顯影，讀片 并記錄讀片的結(jié)果3、結(jié)果判斷：a、能夠同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段其中G殘基受到保護(hù)因而不會(huì)被DMS甲基化避免了六氫口比咤的切割作用；b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫口比咤切割。六、拉下實(shí)驗(yàn)(Pull-down assay)拉下實(shí)驗(yàn)又叫做蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(binding assay in vitro ),是一種在試管中檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽(例

14、如生物素、6-His標(biāo)簽以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等)的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達(dá)為融合蛋白。分離純化融合蛋白并與磁珠結(jié)合，使之固相化之后，再與表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞提取物混合保溫適當(dāng)時(shí)間，例如在4c下保溫過(guò)夜，使目標(biāo)蛋白同已經(jīng)固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結(jié)合。離心收集與固定化的融合蛋白(即與磁珠相互結(jié)合的融合蛋白)中的誘餌蛋白相結(jié)合的目的蛋白，經(jīng)過(guò)煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物(例如磁珠)上脫離下來(lái)，收集樣品，再與目標(biāo)蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測(cè)出與誘餌蛋白的目標(biāo)的目標(biāo)蛋白。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)真核生物的基因組 DNA

15、以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究體內(nèi) DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的 基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與 DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因 表達(dá)的關(guān)

16、系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見(jiàn)，隨著 CHIP的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來(lái)越重 要的作用。染色體免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation , ChIP)是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來(lái)的方法， 也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，在過(guò)去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置

17、會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。 近年來(lái)，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通 路的一種非常有效的工具。它的原理是在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時(shí)，通過(guò)運(yùn)用對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來(lái)。IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以 及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“ prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的 pror

18、ein A預(yù)先結(jié)合固化在 argarose的beads上，使之與含有抗原的 溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須 使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié) 果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使 IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲 慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在 beads ,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。ChIP的一般流程：甲醛處理細(xì)胞-收集細(xì)胞，超聲破碎-加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合-加入ProteinA ,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀-對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行清洗， 除去一些非特異性結(jié)合-洗脫，得到富集的