國(guó)內(nèi)溶菌酶應(yīng)用發(fā)展陳邱

1、國(guó)內(nèi)溶菌酶應(yīng)用及發(fā)展陳邱國(guó)內(nèi)溶菌酶應(yīng)用及發(fā)展陳邱10/10國(guó)內(nèi)溶菌酶應(yīng)用及發(fā)展陳邱國(guó)的溶菌酶的應(yīng)用與發(fā)展溶菌酶,又稱胞壁質(zhì)酶。球蛋白G、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。最早對(duì)溶菌酶的研究起于Nicolle1907年宣告的枯草芽孢桿菌中的溶解子,1922年Fleming等發(fā)現(xiàn),在人的唾液、眼淚中存在有能夠溶解細(xì)胞壁殺死細(xì)菌的酶,因此被命名為溶菌酶1。1965年,英國(guó)的菲利普等用X衍射法對(duì)溶菌酶進(jìn)行研究分析,第一個(gè)完滿弄清了溶菌酶的立體結(jié)構(gòu)2。此后代們發(fā)現(xiàn)溶菌酶寬泛地存在于高等動(dòng)物組織及分泌物，植物及各樣微生物中,此中在新鮮的雞蛋清中含量最高。溶菌酶可選擇性地分解微生物細(xì)胞壁的同時(shí)不損壞其余組織,且自己

2、無(wú)毒無(wú)害,因此它是一種天然的安全性能很好的殺菌劑,防腐劑,將可應(yīng)用于食品防腐、醫(yī)藥制劑日用化工等行業(yè)。在我國(guó),溶菌酶的應(yīng)用圍和應(yīng)用量還比較有限,但能夠估計(jì)，溶菌將會(huì)是應(yīng)用于我國(guó)食品工業(yè)中一種重要的功能性食品增添劑。溶菌酶的結(jié)構(gòu)特色和抗菌作用系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特色與復(fù)雜性大部分雞蛋清溶菌酶是由129個(gè)氨基酸構(gòu)成的堿性球狀蛋白,相對(duì)分子量在1400018000。其等電點(diǎn)可達(dá)107,存在4個(gè)二硫鍵。正常條件下溶菌酶作用的最適溫度為4550。蛋清溶菌酶在低溫干燥下可長(zhǎng)久保留。其純品為白色粉末狀結(jié)晶,無(wú)臭、味甜,易溶于低濃度的食鹽水。在堿性條件下易被損壞,但在酸性溶液中其化學(xué)性質(zhì)堅(jiān)固,熱堅(jiān)固性很強(qiáng),在pH47時(shí),

3、100下辦理1min酶仍保持優(yōu)秀的活性,在pH3時(shí),100加熱辦理45min還能夠保持活性3。溶菌酶在水溶液中6215下,保持30min則完滿失活,在2015%的乙醇中,在6215下保持20min而不失活4。王瑋等5研究表示。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的堅(jiān)固性均跟著醇濃度的增大而提升。人溶菌酶分子量為14600,由130個(gè)氨基酸構(gòu)成,也存在4個(gè)二硫鍵,其酶活性比雞蛋清溶菌酶高2倍左右。在生產(chǎn)或應(yīng)用溶菌酶時(shí),因?yàn)楣に嚮颦h(huán)境的變化,極易造成酶的變性失活,因此必然采納一定的手段使蛋白復(fù)性，減少損失。史晉輝等7研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶濃度較低時(shí),017mol/L的鹽酸胍即可使溶菌酶完滿復(fù)性。其余,溶菌酶和

4、其它酶擁有相像的性質(zhì),Karuppiah等8研究表示,向復(fù)性溶液中加入合適的-環(huán)糊精,可使變性的碳酸脫水酶的復(fù)性率達(dá)到80%。董曉燕等9利用-環(huán)糊精和十六烷基三甲基溴化的聯(lián)合作用,在合適鹽酸胍濃度下,溶菌酶可完滿復(fù)性。王彥等利用離子互換色譜法研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)復(fù)性緩沖液中不含其余鹽類時(shí),脲濃度為210mol/L時(shí)復(fù)性產(chǎn)率最高,當(dāng)脲濃度高時(shí),硫酸銨能很好地提升溶菌酶的復(fù)性回收率。溶菌酶的抗菌作用系統(tǒng)目前已知的幾種溶菌酶有:-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶-1,3、-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸甘露糖酶脫、乙酰殼多糖酶11。參加細(xì)菌細(xì)胞壁溶解作用的溶菌酶大概可分為作用于糖苷鍵和作用于肽和酰胺部分

5、的兩類。-N-乙酰己糖胺酶、-1,3、1,6葡聚糖酶等主要作用于糖苷鍵,使糖苷鍵斷裂,損壞細(xì)胞壁的分子結(jié)構(gòu),而酰胺酶等則主要作用于多肽,使多肽斷裂。以-N-乙酰己糖胺酶為例,-N-乙酰己糖胺酶能夠催化水解細(xì)胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)與N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之間的-1,4糖苷鍵,使肽聚糖分子發(fā)生斷裂,使細(xì)胞壁外雙側(cè)浸透壓失衡,造成細(xì)胞破碎,致使微生物因細(xì)胞壁溶解而被殺死12氏陽(yáng)性菌因?yàn)槎呒?xì)胞壁中肽聚糖含量不一樣樣而存在差異,G+細(xì)胞壁含80%肽聚糖,而G-細(xì)胞壁只有在壁層含有少許肽聚糖。結(jié)晶法是傳統(tǒng)的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制備過(guò)程不是很煩雜。開(kāi)初MayerAbr

6、aham等研究并利用此法,于1937年獲得結(jié)晶狀物質(zhì)13,1945年Alderton等提出直接結(jié)晶法制備溶菌酶的方法14。景芝等15對(duì)傳統(tǒng)結(jié)晶法做出了改良,經(jīng)過(guò)調(diào)整透析液pH值,加入磷酸鹽,再調(diào)整其pH值,此后離心去除雜質(zhì)獲得純化液,使產(chǎn)率提高,活性增添。離子互換層析法離子互換層析法是依據(jù)各樣蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)的不一樣樣而與離子互換劑之間結(jié)協(xié)力的差異,從而將不一樣樣蛋白質(zhì)分其余技術(shù)。該法應(yīng)用于溶菌酶分別始于80年月,因?yàn)槠洳僮骱?jiǎn)單、高效、成本低、可自動(dòng)化連續(xù)操作的長(zhǎng)處,向來(lái)以來(lái)都是溶菌酶生產(chǎn)的常用方法16。目前外國(guó)常用的離子互換劑有Duolite-464、724、732弱酸性陽(yáng)離子互換樹(shù)脂、D9

7、03、201大孔離子互換樹(shù)脂、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基瓊脂糖等17。宋宏新等18采納724樹(shù)脂,裝柱后抽提液遲緩流入柱中,用緩沖液沖刷，再用硫酸銨洗脫,結(jié)果表示724樹(shù)脂的吸附率達(dá)到8315%。因?yàn)镈uolite-464特別合適于連續(xù)自動(dòng)化操作,因此利用它來(lái)分別純化溶菌酶,可獲得較高的產(chǎn)率。如LiChan等19用Duolite-464從性質(zhì)均一的蛋清溶液中分別溶菌酶,使溶菌酶的回收率達(dá)90%。親和層析法親和層析法是依據(jù)酶與作用底物的特異性親和能力,利用酶分子特有的專一性聯(lián)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分別方法20。它的應(yīng)用始于上世紀(jì)70年,因?yàn)榈孜锬軌驅(qū)Ｒ恍耘c溶菌酶聯(lián)合,從而與其余蛋白分別,是一種高

8、效的分別方法。目前利用親和層析法分別溶菌酶的報(bào)導(dǎo)很多,如HeLZ等21采納多步親和層析法分別純化溶菌酶,結(jié)果表示,利用三親和過(guò)濾系統(tǒng)從原猜中純化溶菌酶,與一步法比較產(chǎn)率從61%提升到96%。超濾超濾是一種新興分別純化技術(shù),利用控制超濾膜孔徑大小來(lái)濾過(guò)雜質(zhì),水及小分子物質(zhì)能夠經(jīng)過(guò),從而獲得產(chǎn)物。在反滲析及濃縮等工藝中寬泛應(yīng)用,同時(shí)在蛋白質(zhì)分別中應(yīng)用也開(kāi)始流行。與傳統(tǒng)生化分別技術(shù)比較,它的長(zhǎng)處是產(chǎn)品的產(chǎn)出量高、雜質(zhì)少、純度相對(duì)較高。在2000年,GhoshR等22采納小型的中空纖維超濾系統(tǒng)(30kDaMWCO,聚砜膜)從蛋清干粉中分別溶菌酶,溶菌酶選擇性透過(guò)膜,而其余大分子蛋白質(zhì)被膜所截留。溶菌酶

9、的粗提液經(jīng)過(guò)超濾技術(shù)后,有時(shí)部分雜質(zhì)如無(wú)機(jī)離子等未能所有除去若將超濾與結(jié)晶法,或是與離子互換法等聯(lián)合將獲得精制溶菌酶。鄒明朗等23報(bào)導(dǎo),超濾濃縮溶菌酶經(jīng)CM-SepharoseFF陽(yáng)離子互換柱后,純度提升2119倍。灝等24研究表示,將磷酸鹽緩沖液稀釋10倍,在24MPa下均質(zhì),利用截留相對(duì)分子質(zhì)量為30000的聚醚砜(PES)膜進(jìn)行超,溶菌酶制品活力達(dá)到14610u/mg溶菌酶活性的測(cè)定目前,外國(guó)對(duì)溶菌酶活性的測(cè)定方法,主要有比濁法、紫外分光光度法、比色測(cè)定法、瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法等,但上述各樣方法中均存在必然的弊端,如比濁法攪亂要素多,重復(fù)性差,對(duì)單個(gè)樣品測(cè)定速度快,比色法操作

10、簡(jiǎn)單但偏差較大,因此,各樣方法都在不斷改進(jìn)中。傳統(tǒng)方法測(cè)定溶菌酶活性時(shí)要將溶微球菌制成凍干粉,此過(guò)程不只步驟煩雜并且易造成細(xì)菌大批死亡,影響結(jié)果。玉萍等向溶壁微球菌直接加保護(hù)劑(20%的甘油)置于一般采納了近似的方法。采納聚苯乙烯微量反響板,成立了微量迅速比濁檢測(cè)溶菌酶的方法,使標(biāo)本用量減少,反響時(shí)間縮短,敏捷度較好。近來(lái)幾年來(lái),好多報(bào)導(dǎo)采納標(biāo)志乙二醇化幾丁冰箱冷凍,使用時(shí)解凍,讀第1min的吸光度值和第2min的吸光度值即可。使溶菌酶的測(cè)定方法更為節(jié)儉高效,正確性又好。溶菌酶在食品、生物醫(yī)藥等工業(yè)中的應(yīng)用溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì),能在胃腸被消化和汲取,對(duì)人體無(wú)損害作用,是一種安全系數(shù)很高的食

11、品保鮮劑、營(yíng)養(yǎng)保健品和藥品。因?yàn)槿芫笓碛袃?yōu)秀的理化特色,擁有必然的保健作用,如在化妝品頂用可除去粉刺,使皮膚滑嫩,促使皮膚的新代謝;有止血,促使組織重生的作用,如在牙膏中增添可防備牙齦出血、保護(hù)牙齦并擁有殺菌作用。因此溶菌酶的應(yīng)用領(lǐng)域特別寬泛,在食品、醫(yī)藥、生物工程等方面都擁有很大的應(yīng)用遠(yuǎn)景。其余,溶菌酶除作為醫(yī)藥原資料外,僅在食品防腐、加強(qiáng)方面市場(chǎng)就比較可觀,如乳制品、肉制品、酒類發(fā)酵、水果防腐等方面。跟著對(duì)溶菌酶的研究的深入和應(yīng)用產(chǎn)品的不斷開(kāi)發(fā),溶菌酶一旦被人們認(rèn)識(shí)接受,其對(duì)市場(chǎng)的據(jù)有率將大幅提升。溶菌酶在食品中的應(yīng)用溶菌酶在乳制品中的應(yīng)用人乳與牛乳的最大差異之一在于溶菌酶的含量,在歐洲

12、溶菌酶已經(jīng)廣泛用于嬰兒食品增添劑,將必然量的溶菌酶增添到牛乳及其制品中,使牛乳人乳化,能夠加強(qiáng)血清滅菌蛋白,-球蛋白等防守因子,控制腸道中腐敗性細(xì)菌的增殖,加強(qiáng)嬰兒對(duì)病菌的抵擋力。因此,在牛乳或奶粉中增添必然量溶菌酶,不單防腐,并且加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng),有益于嬰兒健康成長(zhǎng)。其余,在奶酪家產(chǎn)溶菌酶也被寬泛使用,如在干酪生產(chǎn)中代替硝酸鹽,加入01001%的溶菌酶,可防備干酪產(chǎn)氣,保持香味物質(zhì)丁酸。德國(guó)于1995年11月22日宣告了奶酪法例,贊成使用溶菌酶來(lái)阻截在半硬奶酪的生產(chǎn)中由厭氧孢子增殖所惹起的脹氣現(xiàn)象。溶菌酶在肉制品中的應(yīng)用低溫肉制品因?yàn)榭谖鄂r嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,獲得開(kāi)銷者的喜歡。但因?yàn)槿忸惱洳氐臏囟?其實(shí)不

13、可以夠完滿殺死微生物或控制其生長(zhǎng),因此保鮮期短,不可以夠知足開(kāi)銷者需求。溶菌酶自己無(wú)毒、無(wú)害,可代替如苯甲酸及其鈉鹽等化學(xué)防腐劑增添到肉制品中,能有效延伸食品保質(zhì)期。采納0105%溶菌酶和0105%Nisin混淆液保鮮豬肉,4下可保鮮12d,真空包裝保鮮期可達(dá)24d。在此基礎(chǔ)上增添了18%NaCl和415%葡萄糖構(gòu)成復(fù)合保鮮劑,用于小包裝切割冷卻肉的保鮮,保質(zhì)期顯然提升。相同,曾友明等將溶菌酶與Nisin、復(fù)合磷酸鹽、茶多酚、酪朊酸鈉構(gòu)成復(fù)合保鮮劑與鮮肉混淆,制成鹽水火腿,其保質(zhì)期可達(dá)3個(gè)月。同時(shí),溶菌酶在紅腸的加工,延伸其貨架期方面的報(bào)導(dǎo)也特別多。整體上溶菌酶在肉制品上的保鮮作用已經(jīng)獲得認(rèn)同

14、,并且獲得了好多的進(jìn)展,各樣有關(guān)工作也在寬泛張開(kāi)。溶菌酶在海產(chǎn)品和水產(chǎn)品保鮮上的應(yīng)用研究采納0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和3%的食鹽溶液中將海產(chǎn)品或水產(chǎn)品浸漬5min,瀝干水分,常溫下保留9d后無(wú)異味、無(wú)色彩變化溶菌酶的使用,極大提升了海產(chǎn)品或水產(chǎn)品的保鮮期,對(duì)其積蓄運(yùn)輸?shù)葞?lái)了很大的方便。溶菌酶在低度酒及飲猜中的應(yīng)用在低度酒中增添溶菌酶不只對(duì)酒的風(fēng)味無(wú)任何不良影響,還可防備產(chǎn)酸菌生長(zhǎng),是低度酒優(yōu)秀的防腐劑。在日本清酒部分微生物不可以夠生計(jì),但有一種叫做火落菌的乳酸菌則能生長(zhǎng)，并產(chǎn)酸使酒發(fā)臭,增添溶菌酶后火落菌被有效控制,成功代替水酸作防腐劑用于清酒中，向葡萄酒中加入必然量的溶菌酶,能夠

15、大大減少SO2的使用量,減小了SO2使用過(guò)多可能對(duì)人體造成的損害作用。溶菌酶在基因工程和酶工程上的應(yīng)用跟著生物科學(xué)的發(fā)展,溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可以少的工具酶,用以制造和提取菌體的活性物質(zhì)如核酸,酶及活性多肽等利用其專一性水解細(xì)胞壁的特色,有助于人們對(duì)細(xì)胞壁細(xì)微結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí),為我們深入研究細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)打下了堅(jiān)固的基礎(chǔ),同時(shí)作為是一種重要的破壁酶,在原生質(zhì)體的制備方面供給了新的方法,因此溶菌酶被寬泛應(yīng)用于生物技術(shù)、生物工程中。溶菌酶在抗菌消炎、加強(qiáng)免疫力方面的應(yīng)用溶菌酶對(duì)G+、枯草桿菌等有很好的殺滅作用,對(duì)大腸桿菌、一般變球菌等G-也擁有必然程度溶解。其余,溶菌酶與抗菌素適用見(jiàn)效更佳。

16、因此,溶菌酶寬泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè),如利用溶菌酶治療各樣五官科炎癥,特別對(duì)急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等見(jiàn)效顯然。溶菌酶在多種疾病診療方面的應(yīng)用,正常狀況下,人體尿液中一般只存在少許溶菌酶,因此丈量尿中溶菌酶含量,有助于檢測(cè)腎小管功能阻截性疾病。同時(shí),燒傷病人分泌的溶菌酶比常人多出幾倍,也可在尿液中檢出,有助于敵手術(shù)移植排擠、燒傷嚴(yán)重程度的判斷。其余,血清中溶菌酶含量高低對(duì)白血病的診療起協(xié)助作用。第一把血清溶菌酶水平的測(cè)定作為白血病分型的依據(jù),供給了診療急性白血病的新方法。我國(guó)溶菌酶的生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀及遠(yuǎn)景跟著環(huán)境的污染日趨嚴(yán)重科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人民生活水平的提升,人們對(duì)食品和醫(yī)藥的安全性要

17、求愈來(lái)愈高,好多對(duì)某些化學(xué)防腐劑已限制使用,因此高效、安全、,擁有天然活性成分的溶菌酶必然倍受人們的關(guān)注。目前,外國(guó)對(duì)溶菌酶進(jìn)行了較深入的研究,我國(guó)對(duì)溶菌酶的研究、應(yīng)用起步較晚,固然接踵張開(kāi)了一些有關(guān)溶菌酶提取和應(yīng)用方面的研究工作,但與發(fā)達(dá)比較溶菌酶制造業(yè)規(guī)模小、設(shè)施和生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)落伍。目前,外國(guó)主要從蛋清中提取溶菌酶,因?yàn)閺牡扒逯刑崛∪芫?是一項(xiàng)生產(chǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單、投資較少、奏效快的工程,關(guān)于畜產(chǎn)品深加工、綜合利用,均有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蛋清溶菌酶在外國(guó)已于20世紀(jì)80年月進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn),上世紀(jì)90年月末以來(lái),已形成近千噸的市場(chǎng)規(guī)模,溶菌酶生產(chǎn)廠家主要散布在歐美亞等地。此中丹麥、加拿大占世界市場(chǎng)的

18、一半以上,因?yàn)槲覈?guó)生物酶工程研究起步比較晚,我國(guó)于20世紀(jì)80年月對(duì)蛋清溶菌酶技術(shù)開(kāi)始研究,已多次列為“863”計(jì)劃及“十五計(jì)劃”等的要點(diǎn)科研攻關(guān)項(xiàng)目。目前國(guó)已投產(chǎn)的蛋清溶酶,才能達(dá)到有效的防腐見(jiàn)效。其次,為了更好的發(fā)揮溶菌酶防腐作用,能夠與其余物質(zhì)配比使用。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可獲得了很好的防腐見(jiàn)效。近來(lái)幾年來(lái)天然防腐劑愈來(lái)愈遇到食品開(kāi)銷者的喜歡,因此開(kāi)發(fā)高效、安全、性能堅(jiān)固和經(jīng)濟(jì)的天然防腐劑已成為外國(guó)一個(gè)炙手可熱的研究領(lǐng)域,而溶菌酶優(yōu)秀的理化性質(zhì)恰巧符合人們對(duì)食品安全性的要求,它將成為新式食品防腐劑中重要一員發(fā)揮愈來(lái)愈重要的作用。菌酶公司有好多家,全國(guó)年產(chǎn)量不足50噸,溶菌酶的生產(chǎn)特別是高活性的溶菌酶供給還不可以夠知足我國(guó)日趨增添的需求。溶菌酶擁有特異性,只好控制某些細(xì)菌而不可以夠降解真菌的細(xì)胞壁,若在此后食品應(yīng)用溶菌酶時(shí),還應(yīng)注意幾個(gè)事項(xiàng):第一,要充分認(rèn)識(shí)食品的營(yíng)養(yǎng)成分、pH、食鹽濃度等影響溶菌酶見(jiàn)效的要