基因工程制藥 (4)講稿

1、關(guān)于基因工程制藥 (4)第一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。第二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。 培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的合成和菌體的生長。第三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)

2、胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。提高pH，可減少乙酸的抑制作用第四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。 加入甲硫氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。第五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。第六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、菌體生長與前體供應(yīng)的

3、關(guān)系 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。 基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。第七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。如：三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)酰基酶等。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。第八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上

4、停留,并合成被稱為魔點的ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延伸過程減少轉(zhuǎn)錄。第九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月它的濃度增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應(yīng)。影響核糖體濃度（降低）第十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌在傳代（25代以上）過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代

5、菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變第十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 常見分裂不穩(wěn)定的兩個因素：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率（質(zhì)粒丟失率）；這兩種菌（含質(zhì)粒菌和不含質(zhì)粒菌）比生長速率差異的大小。 第十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基 10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計算比值 (穩(wěn)定性stability)第十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.合適的宿主：宿

6、主菌2.合適的載體:質(zhì)粒拷貝數(shù)3.選擇壓力：抗生素4.分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長至一定密度； 再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá) 5.控制培養(yǎng)條件：溫度、pH值、培養(yǎng)基組分、溶氧6.固定化：卡拉膠第十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高，如果增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低，但對穩(wěn)定性不利。第十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 菌體生長速率對質(zhì)?？截悢?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性有影響。高生長速率時質(zhì)?？截悢?shù)下降，但質(zhì)粒穩(wěn)定性增加。生長速率/h0.20.4質(zhì)粒拷貝數(shù)10.510950400-半乳糖苷酶工程

7、菌的連續(xù)培養(yǎng)3第十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.選擇壓力：在培養(yǎng)基中加入抗生素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。4.分階段控制培養(yǎng)：由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。5.控制培養(yǎng)條件：調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度第十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月含質(zhì)粒的基因重組菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 基因工程菌中試 基因工程菌

8、的培養(yǎng)過程包括: 通過搖瓶操作確定：基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響; 通過培養(yǎng)罐操作確定：培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月菌種 一級種子搖瓶 二級種子罐培養(yǎng) 擴(kuò)大培養(yǎng) 原料 發(fā)酵培養(yǎng) 滅菌 發(fā)酵生產(chǎn) 代謝產(chǎn) 物分離 基配制 微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖第二十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程菌中試一、工程菌選擇二、反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制五、計算機(jī)的應(yīng)用第二十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)

9、一、基因工程菌的培養(yǎng)方式：分批培養(yǎng)（batchculture）補料分批培養(yǎng)（fedbatchculture）連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）透析培養(yǎng)（dialysisculture）固定化培養(yǎng)（immobilizedculture）第二十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 補料分批培養(yǎng)（fedbatchculture）是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基（溶氧控制、流加補料），使菌體進(jìn)一步生長的方法。良好的生長環(huán)境，延長對數(shù)生長期，獲得高密度菌體。第二十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝 基因

10、工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。第二十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。 對發(fā)酵影響較大的幾個因素有：培養(yǎng)基的影響接種量的影響溫度的影響溶解氧的影響誘導(dǎo)時機(jī)的影響誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響 7.pH的影響第二十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨

11、、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、維生素等。第二十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用。乳糖對lac啟動子有利。第二十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動子控制的基因有影響。無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長。第二十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月接種量的影響 接

12、種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。如10%15% 接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。 接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。第二十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適于表達(dá)外源基因。 接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。第三十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 溫度的影響 溫度對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。 溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控

13、機(jī)制。P-38第三十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。 溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。如：重組人生長激素，30 0C 產(chǎn)物可溶，37 0C 形成包含體第三十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 溶解氧的影響 對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。 好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。第三十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)酵時，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長減慢，ST值下降，發(fā)酵后期下降

14、幅度更大。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。維持較高的DO2值(40%)，才能提高工程菌的生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,可改變培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。第三十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 誘導(dǎo)時機(jī)的影響 對于PL或PR啟動子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在2830 0C下培養(yǎng)時，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動子的轉(zhuǎn)錄； 當(dāng)溫度升高42 0C時，該阻遏蛋白失活，使啟動子啟動轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效率。一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。第三十五張，PPT共

15、四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 在對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/mL 個為止，這時菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。第三十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 pH的影響 pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。第三十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點是優(yōu)化工程菌的生長條件，其最佳pH在6.87.4左右;培養(yǎng)后期重點是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.06.5。第三十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月最佳化的工藝是獲得（七最）: 最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果和最低失敗率。第三十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)?；蚬こ贪l(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。（細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因合成）P-40第四十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 發(fā)酵罐的組成有： 發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、