脫鎂葉綠酸的制備及其光敏抗菌活性

1、脫鎂葉綠酸的制備及其光敏抗菌活性唐蕾徐磊韓躍毛洪【摘要】以開端純化的葉綠素為質(zhì)料，使用葉綠素酶水解、選擇性酸落解兩種要領(lǐng)制備脫鎂葉綠酸。高效液相色譜闡發(fā)表現(xiàn)兩種要領(lǐng)得到的產(chǎn)物圖譜相似，酸落解產(chǎn)物中脫鎂葉綠酸A的含量較高。抗菌實(shí)行表白脫鎂葉綠酸對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有光敏抑菌結(jié)果，對(duì)革蘭陰性菌和酵母無(wú)顯著作用?！娟P(guān)鍵詞】脫鎂葉綠酸；葉綠素酶；高效液相色譜；光敏抗菌活性KEYRDSPhephrbide;hlrphyllase;Highperfraneliquidhratgraphy;Phtsensitiveantiirbialativity光敏劑是一些具有光活性的化合物，可以選擇性地富集在特定的構(gòu)造，在紫

2、外或可見光的引發(fā)下，產(chǎn)生光動(dòng)力殺傷作用，起到殺菌和治療腫瘤的成果。比年來(lái)，由于抗生素的濫用所引起的毒副作用、耐藥菌的出現(xiàn)和天然微生物群落的粉碎，使得天然、環(huán)境友愛、可以或許有用地殺滅有害菌而不傷及相近構(gòu)造的光敏劑頗受存眷1。脫鎂葉綠酸(Pheide)作為卟啉類光敏活性劑具有布局明白、不變，在紅外區(qū)有較強(qiáng)的汲取，光敏活性更有用等特點(diǎn)，在癌癥的光敏動(dòng)力學(xué)治療中已有報(bào)道24，但其光敏殺菌作用尚待探究。別的，脫鎂葉綠酸作為葉綠素(hl)的中心落解產(chǎn)物在植物中很少積聚，分散困難，但可以通過(guò)葉綠素的酶促水解和酸落解法得到5，6?；谏鲜鲫U發(fā)，本文對(duì)酶法和酸法葉綠素落解產(chǎn)物舉行了比力，并研究了其對(duì)細(xì)菌和酵母

3、的光敏活性。1質(zhì)料與要領(lǐng)細(xì)菌產(chǎn)氣腸桿菌(Aerbateraergenes)、金葡菌(Staphylusaureus)、四聯(lián)球菌(irustetraglnus)、枯草芽孢桿菌(Baillussubtillis)、北京棒桿菌(rynebateriupekinese)、白葡萄球菌(Staphylusalbus)、大腸埃希菌(Esherihiali)。均為實(shí)行室收藏菌種。1.2造就基及造就條件酵母造就基酵母膏5g，卵白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000l，pH6.0。細(xì)菌造就基Nal5g，卵白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000l，pH7.0。121滅菌20in。造就溫度酵母28，細(xì)菌37，光照為

4、造就箱內(nèi)置光源。1.3抗菌實(shí)行(1)在固體平板上勻稱涂布200l菌液，取10l待測(cè)樣品溶液于直徑6的濾紙片上，稍干后貼于已接菌的瓊脂造就基外貌，光照條件下恒溫造就24h，不雅察、記載抑菌圈巨細(xì)，并與陽(yáng)性比擬藥物(細(xì)菌為氨芐西林，酵母為放線菌酮)比擬力，每個(gè)處置懲罰設(shè)3個(gè)重復(fù)。(2)將待測(cè)菌在含有50g/l的Pheide造就基上十字劃線，比力光、暗條件對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處置懲罰設(shè)3個(gè)重復(fù)。1.4葉綠素的提取參照Iriyaa法7，從菠菜中提取和純化葉綠素，丙酮溶解，測(cè)定溶液在645和663n處的吸光值，根據(jù)Arnn公式盤算葉綠素含量：hlA(g/l)=0.0127A663-0.00269A6

5、45hlB(g/l)=0.0229A645-0.00468A6631.5脫鎂葉綠酸的制備1.6高效液相色譜條件2結(jié)果與討論2.1脫鎂葉綠酸的制備脫鎂葉綠酸作為天然卟啉是葉綠素落解的中心產(chǎn)物，在茶葉、柑橘、老化葉中普及存在，但含量低，分散困難。一樣平常通過(guò)葉綠素酶催化，植醇基水解，得到脫植醇葉綠素，繼而酸化得到脫鎂脫植醇葉綠酸即PhEide(圖1)。由于疏水性植醇基的去除，Pheide的親水性大大增長(zhǎng)，可以通過(guò)液液分散將底物hl與產(chǎn)物Pheide分散。由于hlA和hlB同時(shí)可以作為葉綠素酶的底物，因此產(chǎn)物中除PheideA外還常含有少量的PheideB。Hynninen等6根據(jù)hlA、B植醇基水

6、解本領(lǐng)的差異，開拓了直接從hlA、B混淆物通過(guò)選擇性酸落解制備PheideA的要領(lǐng)。圖2為菠菜色素的粗提液，顛末Iriyaa法純化得到hlA、B，和選擇性酸落解產(chǎn)物的薄層層析結(jié)果。得到的產(chǎn)物條帶經(jīng)質(zhì)譜闡發(fā)表現(xiàn)分子量為592與PheideA同等。高效液相色譜是檢測(cè)葉綠素、類胡蘿卜素、葉黃素等色素的常用闡發(fā)本領(lǐng)，本研究用反相高效液相色譜，選擇葉綠素和類胡蘿卜素的檢測(cè)波長(zhǎng)430n比力兩種制備要領(lǐng)，圖譜表現(xiàn)兩者的結(jié)果相似，此中選擇性酸落解的純度較高(圖3)。2.2脫鎂葉綠酸抗菌實(shí)行我們起首選擇實(shí)行室保存的5種細(xì)菌和6種酵母舉行了光敏抑菌實(shí)行，結(jié)果表白脫鎂葉綠酸對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有顯著的抑菌作用，但對(duì)革蘭陰性菌和酵母沒(méi)有按捺作用(表1)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，以多種細(xì)菌(產(chǎn)氣腸桿菌、金葡菌、四聯(lián)球菌、北京棒桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌、大腸埃希菌)為工具，比力了光照和暗中造就條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，創(chuàng)造光照明顯按捺了革蘭陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)(圖略)。該結(jié)果與別的卟啉類化合物所得的結(jié)果同等810。制備要領(lǐng)(酸法和酶法落解)對(duì)所得的結(jié)果沒(méi)有明顯影響。3結(jié)論天然光敏抗菌劑在辦理抗生素的毒副作用和抗生素耐藥性、選擇性殺滅有害菌和庇護(hù)天然微生物群落方面具有上風(fēng)。葉綠素泉源普及，其卟啉