檢測蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間相互作用實驗技術(shù)2

1、一、檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互相作用FRET技術(shù)（invivo）FRET，F(xiàn)luorescenceresonanceenergytransfer，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。該技術(shù)的原理是用一種波長的光激發(fā)某種熒光蛋白后，它開釋的熒光恰好又能激發(fā)另一種熒光蛋白，使其開釋另一波長的熒光，以下列圖所示：以下列圖為例，若要利用FRET檢測兩種蛋白能否有互相作用，需將兩種蛋白的基因分別與這兩種熒光蛋白的基因交融，并在細胞內(nèi)表達出兩種交融蛋白。而后只要用紫外光對CFP進行激發(fā)，并檢測GFP能否放出綠色熒光。假如能檢測到綠色熒光，那么能夠說明這兩種蛋白可能有互相作用；反之，則是這兩種蛋白沒有互相作用。酵母雙、三雜交

2、技術(shù)（invivo）酵母雙雜交系統(tǒng)主要用于觀察兩種蛋白能否有互相作用，其原理是典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等都含有二個不一樣的構(gòu)造域，即AD和BD。這些轉(zhuǎn)錄因子只有同時擁有這兩個構(gòu)造域時才能開端轉(zhuǎn)錄。由此，設(shè)計不一樣的兩個載體，一個含有AD基因（假定為A載體），另一個含有BD基因（假定為B載體）。一般將一個已知蛋白的基因連在B載體上，作為釣餌(Bait)，將未知蛋白的基因連在A載體上，將這兩個載體都轉(zhuǎn)到特定的酵母細胞內(nèi)，看未知蛋白與已知蛋白能否有互相作用。假如二者有互相作用，那么就能夠啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄，進而使這個酵母細胞能在選擇培育基上展現(xiàn)出來或許生計下來；假如二者無互相作用

3、，那么報告基因就沒法表達，那么這個酵母細胞就沒法在擇培育基上展現(xiàn)出來或許生計下來，以下列圖所示：因為酵母雙雜交系統(tǒng)不可以判定膜蛋白間的互相作用，所以又發(fā)展出了分別泛素酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理以下列圖所示：以下圖，將泛素蛋白拆分為兩個片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一個LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子，此時它其實不可以激活基因轉(zhuǎn)錄（因為它被限制在了C端段上，不可以進入細胞核發(fā)揮作用）。將該C端段連到一個膜蛋白上，將N端段連結(jié)到另一個膜蛋白上。若兩個膜蛋白有互相作用，那么兩個膜蛋白在互相湊近時會使泛素蛋白的N端段和C端段湊近聯(lián)合，形成一個完好的泛素蛋白。此時泛素蛋白

4、酶領(lǐng)會將這一段被泛素標(biāo)志的片段降解，那么連結(jié)C端段的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子掉落，即可進入細胞核啟動標(biāo)志基因的表達。酵母三雜交的原理與雙雜交同樣，不過它研究的是兩個蛋白和第三個成分間的互相作用，經(jīng)過第三個成分使兩個蛋白互相湊近。第三個成分能夠是：蛋白、RNA或小分子，以下列圖所示：如上圖所示，在加入第三種成分前，蛋白X與蛋白Y之間并沒有直接互相作用，所以沒法使BD和AD湊近，報告基因不可以表達；當(dāng)加入第三種成分后，蛋白X與蛋白Y的距離被拉近，BD和AD湊近，報告基因表達，進而能夠被檢測到。Pulldown技術(shù)（invitro）Pulldown，即蛋白沉降技術(shù)，它是成立在蛋白質(zhì)親和層析的基礎(chǔ)上

5、的一種檢測蛋白質(zhì)間互相作用的剖析方法。親和層析的原理以下列圖所示，不一樣蛋白對配體的親和程度不一樣，所以能夠先將非特異聯(lián)合的蛋白用低濃度緩沖液給沖洗出去，只剩目的蛋白與層析柱聯(lián)合，而后再用洗脫液將目的蛋白洗脫下來，達到純化目的蛋白的作用。Pulldown技術(shù)利用的是親和層析技術(shù)以及特異的配體（如GSH或許鎳）。以下列圖為例，將GST的基因與蛋白X的基因交融，表達出交融蛋白。將該交融蛋白的溶液過帶有GSH配體的層析柱，那么這一交融蛋白就能聯(lián)合在配體上，而后將待測蛋白的溶液過柱，并讓其與交融蛋白反響一段時間。接著開始進行洗脫。假如待測蛋白與蛋白X無互相作用，那么在開始沖洗的時候就會被洗下來；假如在

6、用洗脫液洗脫后才能在采集到的樣品中發(fā)現(xiàn)待測蛋白（以及蛋白X），說明待測蛋白與蛋白X可能有互相作用。Farwesternblot（invitro）Farwesternblot是鑒于westernblot發(fā)展而來，其原理以下列圖所示。將樣品蛋白用非變性的PAGE膠分別，而后轉(zhuǎn)膜、關(guān)閉、洗膜，加入待測蛋白，使其與已在膜上的樣品蛋白進行互相作用。接著加入帶有標(biāo)志（如HRP）的待測蛋白的抗體反響，最后進行顯色（如加入HRP的底物），察看實驗結(jié)果。免疫共積淀（Co-IP）（invivo）免疫共積淀是探測活體細胞內(nèi)蛋白間的互相作用的一門技術(shù)。它的原理是當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完好細胞內(nèi)存在的很多蛋白質(zhì)

7、蛋白質(zhì)間的互相作用被保存了下來。如果用蛋白X的抗體免疫積淀X，那么與X在體內(nèi)有互相作用的蛋白Y也能積淀下來。Co-IP的原理以下列圖所示，第一從細胞中提取蛋白質(zhì)，獲取蛋白提取液，并將其與抗體孵育，使抗體與蛋白X聯(lián)合。將預(yù)辦理過的proteinG瓊脂糖珠（Sepharose）加入到抗體與蛋白提取液的孵育液中反響，使抗體與proteinG聯(lián)合。經(jīng)過離心將瓊脂糖珠沉降到管底，去除上清液，而后再用緩沖液將瓊脂糖珠沖刷數(shù)次，最后用westernblot（或SDS）進行檢測。二、檢測蛋白質(zhì)與DNA互相作用DNAfootprinting（invitro）DNAfootprinting的原理以下列圖所示。將D

8、NA的一個3端用32p標(biāo)志，而后將DNA分紅兩份，一份直接用DNase進行不完好酶切；另一份先與待測蛋白混淆反響一段時間，而后再用DNase進行不完好酶切。而后將兩份樣品用變性的PAGE膠進行電泳，察看電泳結(jié)果。下列圖中，因為待測蛋白與DNA聯(lián)合的部位沒法被DNase酶切降解，所以它的電泳結(jié)果中與直接用DNase進行辦理的樣品對比，會缺乏一段；假如待測蛋白與DNA無互相作用，那么這兩組的電泳結(jié)果應(yīng)該一致。EMSA（invitro）EMSA，ElectrophoreticMobilityShiftAssay，又稱凝膠阻滯實驗。其原理是與蛋白質(zhì)聯(lián)合的DNA在Native膠（非變性膠）上比沒有聯(lián)合蛋

9、白的DNA挪動速率要慢，所以經(jīng)過電泳即可看到DNA的變化，以下列圖所示。ScreenaPhagecDNA-librarybyDNAprobe（invitro）該方法又成為原位挑選法，用于檢測cDNA文庫中的蛋白與DNA探針之間的互相作用。其原理和實驗流程以下列圖所示，第一是用噬菌體（phage）侵染大腸桿菌，而后將這些大腸桿菌涂到平板上。接著進行轉(zhuǎn)膜，將膜泡于IPTG水溶液中數(shù)小時，而后將該膜放于平板上，培育數(shù)小時（IPTG能引誘大腸桿菌表達文庫蛋白）。將膜拿出，進行變性、復(fù)性和關(guān)閉（留宿），而后與放射性標(biāo)志的DNA探針進行反響，最后洗膜、晾干并用膠片曝光。假如膠片上出現(xiàn)了條帶，說明該文庫蛋白與DNA探針有互相作用；反之則說明二者無互相作用。酵母單雜交系統(tǒng)（invivo）酵母單雜交系統(tǒng)的原理與雙雜交同樣，不一樣的是它主要用于觀察cDNA文庫中的蛋白與DNA（即特異的已知靶因子）能否有互相作用。其原理以下列圖所示。第一需要建立一段序列（黑框），它含有起碼3個拷貝的特異的已知靶因子以