肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定 - 河北科技大學大學英語精品課

1、實驗教學教案首頁本次實驗項目：肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定本次實驗課時：驗證性4學時教學要求： 1掌握實驗原理，了解轉(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)及臨床意義 2. 掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定方法重 點：實驗原理、轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨基作用。 教學手段及教具：課堂講授，學生實驗操作。講授內(nèi)容及時間分配：課堂講授1相關(guān)知識 0.1 學時2實驗?zāi)康?0.1 學時3實驗原理 0.3 學時4實驗操作 0.2 學時實驗教學肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定實驗的操作技術(shù) 3 學時參考資料生物化學實驗肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定（驗證性）相關(guān)知識酶的提純基本操作程序及基本原則酶的活力單位（IU）的定義及酶活力的測定（酶的定量測定）測定酶活力一般經(jīng)如下幾個步驟

2、選擇適宜的一定濃度的底物。確定酶促反應(yīng)的條件。優(yōu)化條件將一定量的酶液和底物溶液混合，確定反應(yīng)時間（因要測定酶促反應(yīng)初速度） 。反應(yīng)到一定時間后取出反應(yīng)液終止反應(yīng)。測定產(chǎn)物的生成量。計算酶活力、酶的比活力。酶的比活力表示酶純度的指標每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對固體酶：比活力活力單位/mg酶蛋白 對液體酶：比活力活力單位/ml酶液比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。總活力、純化倍數(shù)和回收率酶活力測定方法不同酶選用不同的方法氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用、聯(lián)合脫氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨酶及臨床意義: 查肝功為什么要抽血化驗轉(zhuǎn)氨酶指數(shù)呢？谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，GOT）是人體內(nèi)糖和蛋白

3、質(zhì)互相轉(zhuǎn)變所需的酶，人再生體內(nèi)分布廣泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝細胞漿中，AST存在于肝細胞漿和線粒體內(nèi)。其次是腎、心、骨骼肌、脾等。AST的分布則以心肌最高，其次為肝、骨骼肌、腎臟等。谷丙轉(zhuǎn)氨酶為細胞內(nèi)酶，血清中活性很低，各組織器官中以心和肝的活性最高。當某種原因使細胞膜通過性，轉(zhuǎn)氨酶可大量釋放入血液，血清中轉(zhuǎn)氨酶活性。抽血化驗若轉(zhuǎn)氨酶比正常水平偏高則有可能肝組織受損破裂，肝細胞的轉(zhuǎn)氨酶進入血液。（結(jié)合乙肝抗原等指標進一步確定是什么原因引起的）常作為疾病診斷、觀察療效和預(yù)后的指標： 急性肝炎：S-GPT、S-GOT 心肌梗塞：S-GOT一、實驗?zāi)康牧私廪D(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)及臨床意義掌握谷

4、丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定方法二、實驗原理聯(lián)合脫氨基作用是大多數(shù)氨基酸的主要代謝方式，通過轉(zhuǎn)氨基作用與谷氨酸氧化脫氨基作用偶聯(lián)而完成。丙氨酸及酮戊二酸為谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用底物，利用內(nèi)源性（肝細胞已有的）磷酸吡哆醛作輔酶，在一定條件下及時間作用后測定所生成的丙酮酸的量來確定酶活力。丙酮酸能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成丙酸2,4二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈現(xiàn)棕色，其吸收光譜的峰為439530nm，可用于測定丙酮酸的含量。酮戊二酸也能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成相應(yīng)的苯腙，但后者在堿性溶液中吸收光譜為與丙酸2,4二硝基苯腙的吸光度有差別，在520nm波長比色時，丙酮酸2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520

5、nm處吸光度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與酮戊二酸的摩爾比基本上呈線性關(guān)系，故可以測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（簡稱 HYPERLINK /view/10817.htm t _blank GPT、 HYPERLINK /view/65582.htm t _blank ALT,在血清中的正常值是5(0)40U/L以內(nèi)）催化反應(yīng)：丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 谷氨酸丙氨酸丙氨酸GTP丙酮酸CH3CH3三、實驗器材、試劑、材料(一)材料新鮮豬肝臟（二）器材722型分光光度計、剪刀、吸管、玻璃均漿器（三）試劑標準丙酮酸溶液（ml相當于500ug）；準確稱取純化丙酮酸鈉62.5mg，溶于100ml

6、0.5mol/LH2SO4中，臨用前配制。谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物；稱取L-丙氨酸0.90g及-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液中，然后用mol/LNaOH調(diào)至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋至100ml，貯藏于冰箱內(nèi)，可保存一周。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）；稱取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于1000ml蒸餾水中。0.02%2,4二硝基苯肼；稱取2,4二硝基苯肼20mg溶于少量mol/L HCl中，加熱溶解后，用mol/L HCl稀釋到100ml。0.4mol/LNaOH溶液 生理鹽水四、實驗操作步聚準備

7、工作：打開水浴鍋恒溫37度；722E型分光光度計通電預(yù)熱。1.肝勻漿制備（每四組做1份，共用）將雞肝臟用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟0.25g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)（或小研砵中），加入2.25ml預(yù)冷的pH7.40.1%mol/L磷酸緩沖液，制成10%肝勻漿。吸取肝勻漿0.1ml于另一試管中，加入預(yù)冷的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）4.9ml搖勻，為稀釋肝勻漿（稀釋50倍）。2. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定（每組做1份）取試管4支按下表加液測定管標準管對照管空白管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml0.50.5-混勻后，37稀釋肝勻漿/ml0.1-0.1-標準丙酮酸-0.1-水-0.1混勻后，372,4二硝基苯肼/ml0.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml-0.50.5混勻后，370.4mol/LNaOH5.05.05.05.0靜止10分鐘A520谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位：規(guī)定酶在37五、實驗結(jié)果與討論1. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力計算基礎(chǔ)：規(guī)定酶在372. 測定管對照管的吸光度值，與標準管相比算出其相當于丙酮酸含量。3. 根據(jù)公式計算：（注意稀釋倍數(shù)，理解公式）每毫升稀釋肝勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位：每克肝臟谷丙氨酶的活力單位。4計算出比活力比活力活力單位/ml酶液六、注意事項分析（列表）各管與計算實驗結(jié)果（OD值）相關(guān)的物質(zhì)成分。