腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對糖尿病大鼠早期神經(jīng)視網(wǎng)膜病變的影響

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對糖尿病大鼠早期神經(jīng)視網(wǎng)膜病變的影響【摘要】目的：觀察玻璃體腔內(nèi)注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Brainderivedneurtrphifatr，BDNF前后STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中酪氨酸羥化酶tyrsinehydrxylase，TH的程度及多巴胺能無長突細胞數(shù)目的變化。法：9周齡istar大鼠，鏈脲佐菌素streptztin，STZ腹腔注射，制成糖尿病模型，于模型建立2k后，大鼠眼玻璃體內(nèi)注射BDNF溶液，于模型建立4k后，處死大鼠，取出眼球，取視網(wǎng)膜組織進展esternbltting及視網(wǎng)膜鋪片免疫組織化學染色檢測，觀察視網(wǎng)膜中TH程度的變化，從而反映糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中多巴胺能無

2、長突細胞程度的變化。結(jié)果：實驗組糖尿病大鼠未注射BDNF眼視網(wǎng)膜中TH蛋白程度降低，多巴胺能無長突細胞計數(shù)及灰度低于對照組，均有統(tǒng)計學差異。實驗組注射BDNF眼視網(wǎng)膜中TH蛋白程度、多巴胺能無長突細胞計數(shù)及灰度與對照組無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，玻璃體腔內(nèi)注射BDNF可進步視網(wǎng)膜中TH的程度，進步多巴胺能無長突細胞的數(shù)目?！娟P(guān)鍵詞】istar大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變酪氨酸羥化酶腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子InvlveentfbrainderivedneurtrphifatrinearlyretinalneurpathyfdiabetesinratsAbstratAI:Tbserveth

3、ehangesftyrsinehydrxylase(TH)prtEinlevelsandthedensityfdpainergiaarineellsbefreandaftertheadinisteringbrainderivedneurtrphifatr(BDNF)prteinintthevitreusavitiesfstreptztin(STZ)reduedistardiabetirats.ETHDS:Adultaleistarrats,9eeksfage,ereinjetedintraperitneallyithSTZtreatediabetes.At2eekafterthedelsere

4、reated,BDNFprteinasadinisteredintthevitreusavitiesfrats.At4eekafterthedelserereated,theratserekilledandtheretinaasrevedfresternblttingandhle-untiunhistheistryfrTHtbservethehangesfTHanddpainergiaarineellsinretina.RESULTS:TheprteinlevelsfTH,thenuberfpsitivestainingdpainergiaarineellsandthestaininggray

5、salefexperientalgrupithutBDNFerelerstatistially.ButthereerenstatistialdifferenesbeteenexperientalgrupithBDNFandntrlgrup.NLUSIN:IntheearlystagefSTZdiabeti,adinisteringBDNFprteinintthevitreusavitiesaninreaseTHprteinlevelsandthedensityfdpainergiaarineellsintheSTZratsretina.KEYRDS:istarrats;diabetiretin

6、pathy;tyrsinehydrxylase;brainderivedneurtrphifatr0引言傳統(tǒng)的理論認為糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于微血管病變，但實際上它也是一種視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性類疾玻在人類和實驗動物中，在糖尿病發(fā)生后不久，且在血管并發(fā)癥出現(xiàn)之前，神經(jīng)元內(nèi)的分子功能就已經(jīng)發(fā)生變化。糖尿病中視網(wǎng)膜的神經(jīng)病變早于血管并發(fā)癥出現(xiàn)，并貫穿糖尿病的始終，嚴重危害患者的視力。許多研究都說明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子brainderivedneurtrphifatr，BDNF在視網(wǎng)膜生理和病理生理過程中具有重要作用1,2，本文報道在糖尿病大鼠玻璃體腔內(nèi)注射BDNF前后視網(wǎng)膜中酪氨酸羥化酶tyrsinehydr

7、xylase，TH的程度及多巴胺能無長突細胞數(shù)目的變化，旨在初步討論糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)病變的發(fā)病機制。1材料和方法1.1材料鏈脲佐菌素streptztin，STZ，美國Siga公司。TH免疫組化染色試劑盒，武漢Bster生物。BDNF凍干粉，美國Upstate公司。牛血清白蛋白BSA，美國Siga公司。平衡鹽溶液BSS，美國Aln公司。中國醫(yī)科大學實驗動物部提供安康成年近交系9k齡雄性istar大鼠60只，體質(zhì)量180220g，眼部經(jīng)裂隙燈和檢眼鏡檢查屈光間質(zhì)明晰，眼底無病變。分籠飼養(yǎng)，標準顆粒飼料，不限食水。飼養(yǎng)場所通風良好，室溫1825，相對濕度40%70%，12h光照晝夜循環(huán)。尿糖試紙

8、，桂林中輝科技開展。血糖儀，血糖試紙，德國羅氏公司。1.2方法1.2.1STZ誘導糖尿病大鼠模型枸櫞酸鹽溶液0.1l/LpH4.5，高壓滅菌，STZ濃度10g/L溶解于其中，使用前配制。大鼠禁食水12h，STZ70g/kg體質(zhì)量腹腔注射。其后48h，72h，1k連續(xù)3次采尾靜脈血測空腹血糖，以空腹血糖高于16.7l/L為制模成功，且每周監(jiān)測尿糖1次、每2k監(jiān)測血糖一次，將空腹血糖低于16.7l/L者剔除。1.2.2動物的分組及處理以成模鼠作為實驗組，對照組腹腔注射同樣劑量的枸櫞酸鹽溶液每組30只。大鼠成模后4k，100g/L水合氯醛3l/kg體質(zhì)量腹腔注射全身麻醉后，摘除雙側(cè)眼球備用。頸椎脫位

9、法處死大鼠。1.2.3BDNF的眼內(nèi)注射于STZ或撫慰劑腹腔注射后2k開場，每3d注射1次，共5次。BDNF凍干粉1g/L溶于含1g/L牛血清白蛋白BSA的平衡鹽溶液BSS中。100g/L水合氯醛3L/kg體質(zhì)量腹腔注射全身麻醉，20g/L利多卡因1滴外表麻醉成功后，隨機選取大鼠一側(cè)眼球，用微量進樣器取上述溶液5L注射入大鼠眼玻璃體腔內(nèi)，對側(cè)眼注入同樣劑量的含1g/LBSA的BSS溶液。將出現(xiàn)玻璃體出血或眼球萎縮者剔除。1.2.4esternbltting檢測檢測TH的蛋白程度。將大鼠眼球置于顯微鏡下，去眼前節(jié)，小心別離出視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜放入1LEP管中，參加裂解液，冰上超聲，4離心，取上清液

10、，70下保存，待檢。酚試劑法蛋白定量，上樣時確保每個樣本的總蛋白量一樣。大鼠抗-TH單克隆抗體1:100倍稀釋作為一抗，兔抗鼠IgG抗體1:100倍稀釋作為二抗。應用BandSan軟件分析電泳條帶的灰度值。1.2.5視網(wǎng)膜鋪片免疫組化檢測將視網(wǎng)膜固定，脫脂，在1g/L的PBS液中水合，將視網(wǎng)膜切成假設(shè)干瓣，內(nèi)界膜面向上，小心平鋪在載玻片上。將標本放于含抗-TH單克隆抗體1:100倍稀釋，5g/LTritnX-100的PBS液中4下孵育72h，PBS洗后，置兔抗鼠IgG抗體(1:100倍稀釋)中4下孵育24h，PBS洗后，DAB顯色。中性樹膠封片后，置顯微鏡下觀察?？煞直娉龆喟桶纺軣o長突細胞。每

11、張鋪片計數(shù)5個高倍視野中標記的細胞數(shù)目即可得到TH陽性細胞的數(shù)目。統(tǒng)計學處理：計數(shù)資料用均數(shù)標準差表示，t檢驗，使用SPSS12.0數(shù)據(jù)分析軟件包處理。2結(jié)果2.1實驗組及對照組視網(wǎng)膜中的TH蛋白程度TH蛋白程度用同一泳道的-atin程度來標準化可見，實驗組大鼠未注射BDNF眼TH蛋白灰度明顯低于對側(cè)眼和對照組眼P0.01。而實驗組大鼠注射BDNF眼、對照組注射與未注射BDNF眼TH蛋白程度無統(tǒng)計學差異圖1，表1。圖1實驗組大鼠未注射(A)與注射BDNF眼(B)、對照組未注射()與注射BDNF眼(D)TH蛋白程度2.2實驗組及對照組視網(wǎng)膜中TH陽性細胞計數(shù)和染色灰度實驗組及對照組視網(wǎng)膜每張鋪片

12、分別計數(shù)5個高倍視野的TH陽性細胞數(shù)值，并取其平均值，實驗組未注射BDNF眼的TH陽性細胞平均值明顯低于對側(cè)眼和對照組眼P0.01。而實驗組大鼠注射BDNF眼、對照組注射與未注射BDNF眼TH陽性細胞平均值無統(tǒng)計學差異圖2，表2。實驗組及對照組視網(wǎng)膜每張鋪片分別計算5個高倍視野的TH陽性細胞的染色灰度值,并取其平均值，實驗組未注射BDNF眼的TH陽性細胞染色灰度平均值明顯低于對側(cè)眼和對照組眼P0.05。而實驗組大鼠注射BDNF眼、對照組注射與未注射BDNF眼TH陽性細胞的染色灰度平均值無統(tǒng)計學差異表2。圖2實驗組大鼠未注射BDNF眼(A)的TH陽性細胞平均值明顯低于注射BDNF眼(B)3討論無

13、長突細胞是一種視信號整合細胞，它有長的分支與其他細胞相突觸，可能使視網(wǎng)膜的功能協(xié)調(diào)一致。無長突細胞之所以得名是因為該類細胞沒有軸突，無長突細胞的胞體位于內(nèi)核層的下層，與內(nèi)網(wǎng)狀層相毗鄰，從細胞體各個方向發(fā)出突起，沿著內(nèi)核層，進入內(nèi)網(wǎng)狀層，與雙極細胞、神經(jīng)節(jié)細胞相突觸。多巴胺與人體許多并且非常根本的功能相關(guān)。在視網(wǎng)膜，多巴胺由無長突細胞釋放，并激活分布于視網(wǎng)膜上的多巴胺受體發(fā)揮作用。它在視網(wǎng)膜的功能中發(fā)揮重要和復雜的作用。其中一個人們感興趣的焦點是多巴胺在視網(wǎng)膜中的營養(yǎng)功能。包括生長、發(fā)育、細胞死亡，實驗性近視等相關(guān)領(lǐng)域。目前的研究認為，神經(jīng)視網(wǎng)膜與多巴胺能系統(tǒng)之間的互相作用是一個雙向的通路，多巴

14、胺可能是神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞間互相反響的信使。多巴胺有D1和D2兩個受體。多巴胺能無長突細胞的末梢與程度細胞成突觸，釋放多巴胺作用到程度細胞的D1受體上，降低程度細胞對光的反響。多巴胺D2受體屬于多巴胺神經(jīng)元的自身受體，具有突觸前負反響的功能，可以調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的多巴胺釋放。D1和D2受體之間互相作用完成多巴胺的生理功能。多巴胺可以刺激乙酰膽堿能神經(jīng)元，釋放乙酰膽堿增多。視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)-氨基丁酸GABA，谷氨酸L-glutaate可以抑制視網(wǎng)膜多巴胺釋放，鉀離子可促進多巴胺的合成。多巴胺可抑制血管活性腸肽的活性。多巴胺可刺激RPE生成環(huán)磷酸腺苷AP，并降低血管活性腸肽刺激RPE分泌大分子物質(zhì)等3

15、。多巴胺可與眾多神經(jīng)活性物質(zhì)發(fā)生互相作用，多巴胺能神經(jīng)元釋放多巴胺到光感受器和RPE上的多巴胺受體，通過與D1結(jié)合引起視網(wǎng)膜光感受器細胞的變化，多巴胺是從視網(wǎng)膜到RPE的傳導媒介。此外多巴胺又通過D2抑制腺苷酸環(huán)化酶A的酶活性，降低AP程度，反響抑制多巴胺的釋放。因此，多巴胺在視網(wǎng)膜起神經(jīng)-激素作用4。多巴胺在維持正常視神經(jīng)功能中起著重要的作用。臨床資料說明：Parkinsns病主要損害多巴胺能神經(jīng)元，這種患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜比照敏感度和分辨力等視功能損害的特征，這是因為多巴胺能神經(jīng)元功能缺乏影響了程度細胞多巴胺敏感細胞從而干擾了外周視覺5。光刺激可以激活多巴胺能神經(jīng)元，在光照下，視網(wǎng)膜多巴胺合成、

16、代謝明顯增強，多巴胺合成限速酶TH的活性也明顯增強，在暗環(huán)境下光適應的視網(wǎng)膜多巴胺神經(jīng)元功能下降，視網(wǎng)膜多巴胺及其代謝產(chǎn)物減少，多巴胺能控制與光和暗適應的視網(wǎng)膜生理反響，調(diào)節(jié)程度細胞對光反響，減少細胞間的電聯(lián)接。在哺乳動物視網(wǎng)膜，多巴胺能細胞體位于無長突細胞層，即內(nèi)核層和內(nèi)叢狀層的交界處。在脊椎動物視網(wǎng)膜中，多巴胺能神經(jīng)元的密度較低，約為10100/2，但每個細胞均放射狀地伸出許多突起，足以覆蓋鄰近的多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元通過調(diào)節(jié)多巴胺的合成和釋放來對多種刺激作出反響，在此過程中，一個關(guān)鍵的角色就是TH，它是多巴胺合成的限速酶，它和多巴胺一樣，都分布于整個細胞，包括最為精細的突起和末稍

17、6。因此TH蛋白程度是視網(wǎng)膜多巴胺能無長突細胞的標志之一。糖尿病中多巴胺能無長突細胞發(fā)生變性的可能機制如下：第一，嚴重的胰島素剝奪，見于STZ所致的糖尿玻研究認為7，胰島素是體外無長突細胞生存的重要因子。第二，高血糖。體外培養(yǎng)結(jié)果說明8，過量的糖破壞視網(wǎng)膜中胰島素刺激細胞的生存和胰島素受體的信號傳遞。第三，視網(wǎng)膜llers細胞功能障礙。糖尿病時，llers細胞中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運功能降低9，并且天冬氨酸的合成遭到破壞10。這些功能障礙導致糖尿病視網(wǎng)膜谷氨酸程度增加，對無長突細胞具有毒性。BDNF對于對視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷，視網(wǎng)膜缺血及化學性損傷、光感受器細胞的損傷后的恢復及再生等方面具有非常重

18、要的作用，目前，它被認為是抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑和抗氧化劑。多巴胺能無長突細胞的變性可能導致BDNF程度的降低。小鼠bdnf基因的零突變可以導致多巴胺能無長突細胞的萎縮11。另據(jù)報道，在黑質(zhì)12及體內(nèi)13和體外14培養(yǎng)的視網(wǎng)膜無長突細胞中，BDNF可以阻止多巴胺能神經(jīng)元的死亡。神經(jīng)營養(yǎng)因子不能通過血腦屏障15，因此，它們對于視網(wǎng)膜神經(jīng)元的部分供給很難保證。在本實驗中，我們將BDNF直接注射入眼球，但在糖尿病患者中進展神經(jīng)營養(yǎng)因子的玻璃體腔內(nèi)連續(xù)注射是可行性稍差。玻璃體腔內(nèi)或視網(wǎng)膜下植入持續(xù)釋放BDNF的細胞或裝置，應用病毒載體進展眼內(nèi)BDNF的基因轉(zhuǎn)移可能更為可行?！緟⒖嘉墨I】1LuG，HuD

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