逆境脅迫對植物生理生化指標的影響

1、本科學生綜合性實驗報告學號 姓名 學院 專業(yè)、班級 實驗課程名稱 植物生理學實驗 教師及職稱 開課學期 2012 至 2013 學年 上 學期 填報時間 2012 年 12 月 15 日云南師范大學教務處編印逆境脅迫對植物生理生化指標的影響 （，云南 昆明 650092）摘要：對植物產生危害的環(huán)境稱為逆境，又稱脅迫。干旱是制約植物生長的主要逆境因素，以小麥幼苗在模擬干旱脅迫下，植株體內的生理生化指標會發(fā)生變化。實驗采用PEG處理小麥幼苗，對抗氧化酶；脯氨酸；谷胱甘肽；過氧化氫；可溶性糖；丙二醛在植物體內的含量變化進行了研究，實驗通過分光光度計分別在不同的波長中測出吸光率，間接計算出其含量，而通

2、過對正常條件下的和逆境脅迫下一定量小麥體內以上各種物質含量的對比，從而了解小麥體內生理生化指標發(fā)生的變化。關鍵詞：小麥（Triticum aestivumLinn）；干旱脅迫；生理生化 1 引言干旱是自然界常見的逆境脅迫因素，而且干旱也是植物最容易受到的脅迫之一。干旱不僅制約植物的生長發(fā)育與產量，也會引起植被結構與功能的時空變化。因此植物對干旱脅迫的適應及機制一直是植物逆境適應策略研究的一個熱點【1-3】作物抗旱性的研究方法有多種，適應能力進行了研究：植物對干旱脅迫的適應過程和受傷害程度與干旱脅迫的強度以及植物自身的抗性緊密聯系，并從生化代謝、生理功能、形態(tài)適應、生長發(fā)育以及生物生產力等多種形

3、式表現出來【1-5】。土壤有效水分狀況與植物之間的關系一直是植物生理生態(tài)學研究領域的熱點問題。大多數植物在短期或輕度土壤缺水情況下葉片水勢下降，氣孔關閉。限制CO2 攝取和光合作用速率：長期嚴重干旱條件下可限制植物生長,引起形態(tài)結構發(fā)生變化。甚至導致植物死亡【6】。大多實驗是在人工控制的干旱或人工模擬干旱條件下進行。其主要方法是室外盆栽控制水分，苗期室內水培或砂培采用PEG滲透脅迫、人工控制的溫室、氣候室和培養(yǎng)箱等。其中，PEG滲透脅迫法簡單易行、條件容易控制、重復性好、試驗周期短。本試驗采PEG溶液模擬干旱脅迫的方法，研究干旱脅迫對小麥幼苗發(fā)芽率、抗氧化酶、脯氨酸、谷胱甘肽、過氧化氫、可溶性

4、糖、丙二醛等生理生化指標含量的變化，并初步探討小麥的抗逆機理，期望能夠應用于農業(yè)生產實踐中，為干旱農業(yè)生產提供理論依據。2、材料與方法2.1、實驗材料小麥種子：購于西山種子公司，供實驗備用。（適宜條件下，選購的小麥種子發(fā)芽率較高的，所選購的實驗材料較理想的，有利于用作實驗材料。）培養(yǎng)條件：室溫，充足水分、充足陽光供給，PEG干旱處理。用水：自來水。2.2、種子生命力（發(fā)芽率）的快速測定將待測種子在適宜水中浸種，以增強種胚的呼吸強度。使顯色迅速。2.3、其它實驗種子處理一致如下; 小麥種子 用0.1% HgCl2消毒10 min后 用蒸餾水漂洗干凈 用蒸餾水于26下吸漲12 h 播于墊有6層濕潤

5、濾紙的帶蓋白磁盤（24cm16cm）中 于26下暗萌發(fā)60 h 選取長勢一致的小麥幼苗做PEG干旱處理。、測定方法.1、種子生命力（發(fā)芽率）的快速測定 各取50粒吸脹的玉米種子或小麥種子沿胚的中心線切成兩半（嚴格區(qū)分兩個半粒），進行下列實驗： 其中50個半粒進行曙紅染色（室溫染色10 min），另一半進行TTC染色（30水浴 20 min） ，計算發(fā)芽率。種子發(fā)芽率=有生命的種子/測試種子數X100.2、逆境脅迫和脯氨酸（Pro）的積累及測定Pro的提取：分別取 g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研缽5000 rpm離心

6、10 min 上清液定容至5 mL。測定：上清液各2 mL 分別加入( 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑)煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心10 min（若沒沉淀可略此步驟） 分別測定A520 計算：Pro contentPro content = (-1FW)520mol.3、逆境脅迫和丙二醛（MDA）的測定 MDA提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 10%TCA和少許石英砂充分研磨用2 mL 10%TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。測定：分別取上清液各2 mL 加入0.6%TBA（用10%TCA配制） 2 mL煮沸12 min冷卻后

7、5000 rpm離心5 min （視沉淀有無）分別測定OD450和OD532。計算：OD450OD532=C1X7.4+155000XC2其方程得： C1/ (mmol/L) = OD450 C2/ (m OD532 OD450式中，C1為可溶性糖的濃度；C2為的濃度。.4、逆境脅迫與H2O2的積累及測定H2O2提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 50 mM PBS (提取液，內含1mM HA)和少許石英砂充分研磨用2 mL PBS洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。測定：分別取上清液各3 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO

8、4配制 1 mL搖勻 5000 rpm離心10 min OD410。計算：HH2O2 content = (-1FW) 410mol.5、植物抗氧化酶活性的（POD、PPO）的活性測定抗氧化酶的提?。悍謩e取0.1 g實驗材料加入少許石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,內含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨轉入離心管中用2 ml提取液洗研缽 5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 ml 用于測定POD和PPO酶活性或分裝后轉至-20或-80保存。 POD測定：取POD反應混合液（10mol/L愈創(chuàng)木酚，5 mol/L H2O2,用PBS溶解

9、）2.95 ml，加入酶液50 ul（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應1 min時的A470。PPO測定：取PPO反應混合液（ 20 mol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9 ml，加入酶液0.1 ml（空白調零用PBS取代），立即記時，搖勻，讀出反應 1 min時的A410。計算： 以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則：POD activities =POD activities = (mol.g-1FWmin-1)PPO activities =PPO activities = -1FW) 470-1-12.4.6、逆境脅迫和谷胱甘肽(GSH)的

10、含量測定GSH的提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 5% TCA洗研缽 5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。測定：上清液各1 mL (空白用5%三氯乙酸代替) 分別加入2 mL0.1M PBS (pH=7.7) 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min測定A412。計算：GSH content =GSH content = (-1FW)412-1-1.7、逆境脅迫和抗壞血酸(ASA)的含量測定ASA的提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組的胚芽鞘加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂充

11、分研磨用2 mL 5% TCA洗研缽 5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。測定：上清液各0.8 mL (空白用5% TCA代替) 分別加入0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸餾水 搖勻 分別加入 0.8 mL 5% TCA、44%磷酸和4%聯吡啶 搖勻 加入3%FeCl3 0.8 mL 37 15 min 測定A525。計算：ASA content =ASA content = (-1FW)525=16.5 mM-1-13、結果與分析3.1、種子生命力（發(fā)芽率）的快速測定小麥的種子經過曙紅染色，不具有生命力的由無色變?yōu)榧t色。其中50粒小麥種子中

12、，6粒被染成紅色，由此可以計算出發(fā)芽率：種子發(fā)芽率=有生命的種子/測試種子數X100種子發(fā)芽率=44/50X100=88 小麥的種子經過TTC染色，具有生命力的由無色變?yōu)榧t色。其中50粒小麥種子中，28粒被染成紅色，由此可以計算出發(fā)芽率：種子發(fā)芽率=有生命的種子/測試種子數X種子發(fā)芽率=28/50X100=56數據分析：相同的小麥種子在曙紅染色和TTC染色所測定的種子發(fā)芽率分別為88%和56%，差異較大。分析其原因主要有兩個發(fā)面，一個原因是曙紅染液滴加的過少，以至部分不具有生命力的小麥種子著色較淺；另一個原因是曙紅染色時間過短，部分不具生命力的小麥種子著色較淺，從而影響實驗的數據結果。3.2、

13、逆境脅迫和脯氨酸（Pro）的積累及測定在酸性條件下，脯氨酸和茚三酮發(fā)生反應生成紅色化合物，此化合物在520nm處有較高吸收峰。數據如下：小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下脯氨酸的含量比較OD520(-1FW)對照組實驗組由上圖表可知：通過對照組與實驗組小麥葉片中脯氨酸含量的對比，實驗組小麥葉片脯氨酸含量遠遠高于對照組小麥葉片脯氨酸含量。實驗研究表明：表明小麥幼苗經過干旱脅迫下，植物體通過蛋白質的降解、從頭合成和降低脯氨酸脫氫酶活性等途徑合成脯氨酸，導致脯氨酸（Pro）的大量積累。游離脯氨酸可能作為一種調節(jié)或者是信號分子來激活很多反應以適應逆境過程【7】 。脯氨酸也是植物遇到逆境的一種可靠的指示器【8

14、】。脯氨酸的積累還與自由基的非酶清除有一定的相關性，Alia等【9】 。發(fā)現離體線粒體中,脯氨酸可減少高光強誘導下自由基的產生。在向日葵上的研究表明，干旱脅迫下各品種的脯氨酸含量均顯著高于對照。本試驗結果與此研究結果相符。脯氨酸主要是在線粒體中合成，主要分布于線粒體及胞質基質中，從而提高細胞質的滲透壓平衡與細胞質與液泡間的滲透壓，是滲透脅迫下的葉綠體和線粒體能維持較好的水分狀況，保證光合作用和呼吸作用的運行。 植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性的品種往往積累較多的脯氨酸。因襲程度脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質膠體及組織內的代謝過程，因而能降低冰點，能防止細胞脫水的作用。植

15、物游離脯氨酸含量的增加是植物對逆境脅迫的一種生理生化反應，是植物在逆境下的適應表現。脯氨酸具有多種生理功能，如作為細胞質滲透調節(jié)物質、穩(wěn)定生物大分子結構、降低細胞酸度以及作為能量庫調節(jié)細胞氧化還原勢等。許多植物在受到環(huán)境脅迫，例如在干旱、鹽漬、低溫等想條件下時，體內的脯氨酸含量發(fā)生很大變化。因此，通常把脯氨酸含量變化作為植物體內氨基酸代謝是否發(fā)生障礙的指標【10】。3.3、逆境脅迫和丙二醛（MDA）的測定 硫代巴比妥酸與丙二醛、可溶性糖反應產物在不同的波長中具有吸收峰，依次來測定丙二醛和可溶性糖的含量。數據如下：小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下丙二醛的含量比較OD450OD532可溶性糖（mmol

16、/L）MAD含量（mmol/L）對照組0.0900.4192實驗組0.4050.1810.94065由上表可知：通過對照組與實驗組可溶性糖和MDA的含量明顯增加。實驗研究表明：在干旱的脅迫下會使植物葉片MDA和可溶性糖大量積累。PEG模擬干旱脅迫使可溶性糖含量大幅提高?？扇苄蕴鞘巧矬w內重要成分之一,是生物體中的重要能源和碳源【11】?？扇苄蕴亲鳛闈B透調節(jié)物質可以降低細胞的滲透勢以維持細胞的膨壓,防止細胞內大量的被動脫水【12】。 MDA在逆境脅迫條件下，植物往往發(fā)生膜脂過氧化作用.質膜相對透性的大小是膜傷害的重要標志之一。MDA 是脂質過氧化的產物之一，其積累是活性氧毒害作用的表現。MDA

17、含量通常被作為判斷膜脂質過氧化作用的指標【13】。細胞膜透性和MDA含量的的變化是植物細胞膜脂透過反應的表現，MDA能與細胞內各種成分發(fā)生反應，從而引起細胞內各種膜的損傷，當MDA含量大量增加時，表明體內細胞受到嚴重的破壞，膜透性增加，細胞內物質外滲，細胞功能下降【14】。小麥幼苗在PEG溶液干旱處理后其MDA大量積累以增加其抗旱能力?？扇苄蕴牵嚎扇苄蕴堑暮吭诟珊得{迫下會加劇來抵抗干旱，能夠通過滲透調節(jié)來提高作物的抗旱性?？扇苄蕴鞘侵参矬w內的重要滲透調節(jié)產物之一，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，土壤水分減少時，隨干旱脅迫程度增加而增加，有利于維持植物體細胞膨壓，抑制由于細胞內水分過度損失

18、而造成的被動脫水【15】。小麥幼苗在PEG溶液干旱處理后其MDA大量積累以增加其抗旱能力。3.4、逆境脅迫與H2O2的積累及測定干旱脅迫下，植物體內過氧化氫大量積累，作為脅迫信號啟動適應生理過程。在酸性條件下（pH=1.6），H2O2將Fe2+氧化為Fe3+ ， Fe3+進一步與二甲酚橙反應形成紫色的復合物Fe3+ -XO，此復合物的最大波長為560 nm，在一定范圍內，其顏色深淺與H2O2含量呈線性關系。在此反應中加入山梨醇可提高測定H2O2的靈敏度。數據如下：小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下過氧化氫的含量比較OD410含量(-1FW)對照組實驗組由上圖表可知：實驗組中的過氧化氫含量是對照組過氧

19、化氫含量的3倍多。實驗研究表明：小麥幼苗在干旱脅迫的條件下葉片中的過氧化氫的含量大量增加。在干旱脅迫下，會引起葉綠體、線粒體、過氧化物體、細胞壁及質外體中的過氧化氫的大量積累。在正常環(huán)境和生理條件下，活性氧和抗氧化酶系處于動態(tài)平衡之中，維持低水平的活性氧穩(wěn)態(tài)，在不良環(huán)境如干旱、低溫鹽漬等，可以打破這種平衡，其主要原因是干旱脅迫條件下，使光合作用CO2固定效應降低，導致更多的電子“滲透”，使分子氧還原成O-2，增加的活性氧對細胞的傷害主要是引起膜脂過氧化，產生丙二醛，以增加其抗旱能力。3.5、植物抗氧化酶活性的（POD、PPO）的活性測定 POD活性鄰甲氧基苯酚可被POD氧化成紅棕色的4-鄰甲氧

20、基苯酚。紅棕色物質可用分光光度計在470nm處測定其值，即可求出該酶的活性。 PPO活性 鄰苯二酚可以被PPO氧化成茶褐色的化合物，可用分光光度計在470nm處測定其值，即可求出該酶的活性。數據如下： 小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下POD活性的比較OD470（1min）活性值(-1FWmin-1)對照組實驗組小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下PPO活性的比較OD410（1min）活性值-1FW)對照組0.22814400實驗組0.41020500由上圖表可知：實驗組中的POD活性和PPO活性均比對照組中的POD活性和PPO活性要高很多。實驗研究表明：在干旱脅迫下，POD值升高，POD是植物抗氧化酶系統(tǒng)

21、中重要的酶類，POD通過催化其他底物與過氧化氫反應以消耗過氧化氫，植物在受到水分脅迫及復水時，可誘導體內POD活性上升，從而起到保護植物的作用。POD活性在干旱脅迫下增強，能通過增強POD活性來抵御干旱逆境對其所造成的傷害【16】。多酚氧化酶（polphenol o xidase,PPO ）是植物體內酚類物質氧化或縮合以及木質素的合成的重要酶，提高PPO活性可促進植物體內酚類物質和木質素的合成和積累以提高植物抗性【17】。PPO是一種與生長相關的酶，劉金龍等研究表明，PPO與仁用杏樹生長發(fā)育以及抗逆性相關，是仁用杏樹抗逆性生化指標，可作為栽培時選擇樹種的依據【18】。3.6、逆境脅迫和谷胱甘肽

22、(GSH)的含量測定對硫二硝基苯酸與谷胱甘肽的反應產物，可用分光光度計在412nm處測定其值，即可求出谷胱甘肽（GSH）的含量測定）。小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下谷胱甘肽含量的比較OD412含量(-1FW)對照組350實驗組01由上表可知：實驗組中谷胱甘肽（GSH）的含量比對照組中的谷胱甘肽（GSH）的含量大量增加。實驗研究表明：在干旱脅迫下，GSH的值較正常情況下增高，這是因為還原性谷胱甘肽是生物細胞中含量最豐富的非蛋白質硫醇化合物。在生物體內不同的脅迫響應途徑中，利用GSH是親和活性來消除活性氧和重金屬等對細胞的傷害。因此，在生物的氧代謝及抗逆生理中GSH發(fā)揮著重要的作用【19】。小麥在干

23、旱條件下通過提高GSH含量來應激環(huán)境變化。在正常供水情況下，小麥不存在干旱脅迫所帶來的傷害，其體內的GSH處在正常的代謝中，所以在整個測定過程中GSH含量變化比較穩(wěn)定【20】。3.7、逆境脅迫和抗壞血酸(ASA)的含量測定Fe3+可以被抗壞血酸還原成Fe2+，Fe2+與聯吡啶生成粉紅色Fe2+-聯吡啶復合物，可用分光光度計在525nm處測定其值，即可求出該物質的含量。小麥在干旱脅迫下和正常環(huán)境下抗壞血酸含量的比較OD525抗壞血酸(mmol.g-1FW)對照組0.1001.515實驗組0.132由上表可知：實驗組中抗壞血酸(ASA)的含量比對照組中抗壞血酸(ASA)的含量增多。實驗研究表明：在

24、干旱脅迫的條件下，植物葉片抗壞血酸含量有所增加，以抵抗干旱脅迫。抗壞血酸在植物體內的氧化還原狀態(tài)以及維持該狀態(tài)所涉及代謝物質和酶系的水平或活性的改變，對植物抵抗一系列環(huán)境脅迫非常重要。4、結論 通過本次實驗，從結果中可以看出，小麥為了適應干旱脅迫的逆境，機體內發(fā)生了一些列的生理生化反應，試驗中脯氨酸(Pro)的積累說明植物正常的生理機能已經被干旱脅迫所破壞。脯氨酸(Pro)是植物蛋白質的組分之一，并可以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中。在干旱脅迫條件下，許多植物體內脯氨酸大量積累。積累的脯氨酸除了作為植物細胞質內滲透調節(jié)物質外,還在穩(wěn)定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調節(jié)細胞氧化

25、還原勢等方面起重要作用。試驗數據顯示，除脯氨酸(Pro)外，受到干旱脅迫時小麥葉片內的抗氧化酶、谷胱甘肽、過氧化氫、可溶性糖、丙二醛等含量顯著增加，說明小麥幼苗通過大量積累這些物質以調節(jié)生理變化。對抗逆研究植物干旱脅迫條件下其發(fā)芽率、抗氧化酶、脯氨酸、谷胱甘肽、過氧化氫、可溶性糖、丙二醛等生理生化指標含量的變化，并初步探討小麥的抗逆機理，能夠應用于農業(yè)生產實踐中，為干旱農業(yè)生產提供理論依據。5、參考文獻1于景華，王麗娟，唐中華，等.植物對干旱脅迫的生理和分子反應J.代化農業(yè).2006.12：1-4.2楊帆，苗靈鳳，胥曉，等.植物對干旱脅迫的響應研究進展J.應用與環(huán)境生物學報.2007,13(4

26、)：586-592.3魯萍，桑衛(wèi)國，馬克平.外來入侵種飛機草在不同環(huán)境脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的變化J.生態(tài)學報.2006,26(11)：3578-3585.4王紅梅，包維楷，李芳蘭.不同干旱脅迫強度下白刺花幼苗葉片的生理生化反應J.應用與環(huán)境生物學報.2008,14(6)：757-762.5 Mittler R.Oxidative stress,antioxidants and stress toleranceJ,Trends Plant Sci,2002, 7(9):405-410.6 李芳蘭，包維楷，吳寧.白刺花幼苗對不同干旱脅迫的形態(tài)與生理響應J .生態(tài)學.2009,29(10)：5406-

27、5416. 7MaggioA,MiyazakiS,VeroneseP,etal,Doespro2lineaccumulationplayanactiveroleinstress2inducedgrowthreduction?J.PlantJournal,2002,31(6):69927128ClaussenW,ProlineasameasureofstressintomatoplantsJ.PlantSci,2005,168:2412248.9Alia,PrasadKV,SaradhiPP,EffectofzineonfreeradicalandprolineinBrassicaandcajanusJ,Phytochem,1995,39:4524710 覃光球，嚴重玲，韋莉莉.秋茄幼苗葉片單寧、可溶性糖和脯氨酸含量對d脅迫的響應.生態(tài)學報.100020933（2006）102336620611DureL.P1antresponsestocellulardehydrationdur2ingenvironmentstressJ,PlantPhysiology,1993,103(10):91293.12CechinI.RossiS