木薯直鏈和支鏈淀粉分離

1、 廣西大學(xué)本科生畢業(yè)論文 支、直鏈木薯淀粉分離條件研究 第一章 緒論1.1淀粉淀粉在自然界中廣泛分布，常見于高等植物，是碳水化合物存在的主要形式，主要存在于高等植物的根、莖、葉、果實(shí)、花粉中。淀粉是多糖的一種，是通過光合作用把CO2和H2O以葡萄糖的形式固定下來在經(jīng)過聚合等反應(yīng)形成以淀粉形式。因?yàn)檫@種儲(chǔ)存能量的功能，這些淀粉亦被稱為儲(chǔ)藏性多糖。淀粉（分子式為（C6H10O5)n，嚴(yán)格分子式為C6H12O6(C6H10O5)n）的基本組成單位是葡萄糖（C6H12O6)（見圖1-1），由D- 葡萄糖經(jīng)-1,4 糖甙鍵和-1,6 糖甙鍵組成，分子鏈中有還原尾端和非還原尾端。分子量一般為8003000

2、DP。1940年，瑞士K.H.Meyer和T.Schoch發(fā)現(xiàn)淀粉是由兩種不同的淀粉分子：直鏈淀粉和支鏈淀粉。此外，現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，在許多淀粉顆粒中還存在第三種成分1。 圖1-1 淀粉分子簡(jiǎn)式Fig 1-1 Simple starch molecules1.2木薯淀粉木薯屬亞熱帶或熱帶薯類農(nóng)作物，國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)于廣東、廣西、海南島，福建部分地區(qū)；國(guó)外泰國(guó)、越南等東南亞國(guó)家和地區(qū)，巴西、委內(nèi)瑞拉等南美國(guó)家和地區(qū)，尼日利亞等非洲國(guó)家。木薯作為一種富含淀粉的塊根作物，與馬鈴薯、紅薯并列為世界三大薯類作物，目前全世界有70多個(gè)國(guó)家種植木薯。我國(guó)種植木薯的省份有廣西、海南、廣東、福建和云南等省區(qū)，其中廣西是

3、我國(guó)種植木薯的最大省份，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)的60%以上2。木薯收獲后，其塊根主要用于制造木薯淀粉。木薯淀粉不是單一物質(zhì)，而是由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成的混合物3。木薯淀粉中直鏈和支鏈淀粉含量因木薯品種不同及種植地區(qū)不同而有所差別，決定著木薯淀粉的品質(zhì)，并影響著木薯淀粉的貯藏與加工，所以，以木薯淀粉為原料，研究其直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離方法具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2.1支鏈淀粉支鏈淀粉的分子量比直鏈淀粉的大, 分子量在10100萬范圍內(nèi), 相當(dāng)于分子中由6006000個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成。支鏈淀粉分子中葡萄糖單元有由a-1,4 糖苷鍵連成的鏈, 還有由1.6 糖苷鍵連接成的分支, 分支上又有由1,

4、6糖苷鍵連接成的分支, 形如樹枝狀。分子中小分支的數(shù)目在50個(gè)以上, 每一個(gè)小分支平均約含有2030 個(gè)葡萄糖單元。小分支中的這2030個(gè)葡萄糖單元也通過分子內(nèi)氫鍵的相互作用卷曲成螺旋形的構(gòu)象（見圖1-2）部分原淀粉的支鏈淀粉含量如表1-1所示。支鏈淀粉以分支端的葡萄糖鏈平行排列, 彼此以氫鏈締合成束狀, 形成微晶束結(jié)構(gòu)。所以支鏈淀粉中結(jié)晶區(qū)域小, 晶體結(jié)構(gòu)不太緊密, 淀粉顆粒大。支鏈淀粉的分子大, 各支鏈的空間阻礙作用使分子間的作用力減小。而且由于支鏈的作用, 使水分子容易進(jìn)人支鏈淀粉的微晶束內(nèi), 阻礙了支鏈淀粉分子的凝聚, 使支鏈淀粉不易凝沉4。表1-1 部分原淀粉的支鏈淀粉含量Table

5、 1-1 Part of the amylopectin content of native starch淀粉來源支鏈淀粉含量/%淀粉來源支鏈淀粉含量/%玉米 73糯米100糯玉米100小麥73高直鏈玉米30 馬鈴薯80高粱73木薯83蠟質(zhì)高粱100甘薯82稻米81圖1-2 支鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)Fig 1-2 The molecular structure of amylopectin1.2.2直鏈淀粉一般的研究認(rèn)為直鏈淀粉是一種線形多聚物，都是由 -D-葡萄糖經(jīng)過-D-1，4 糖苷鍵連接而成的鏈狀分子（見圖1-3），呈右手螺旋結(jié)構(gòu)（見圖1-4），每六個(gè)葡萄糖單位組成螺旋的每一個(gè)結(jié)局，在螺旋內(nèi)部

6、只含有氫原子，羥基位于螺旋外側(cè)?，F(xiàn)在研究證明，除了直鏈淀粉（線形）分子之外，還有一種在長(zhǎng)鏈上帶有非常有限的分枝的分子，分支點(diǎn)是-D-1，6糖苷鍵連接，平均每180320葡萄糖單位有一個(gè)之間，分支點(diǎn)-D-1，6糖苷鍵占總糖苷鍵的0.3%0.5%.含支鏈的直鏈淀粉分子中的支鏈有的很長(zhǎng)，有的很短，但是支點(diǎn)隔開很遠(yuǎn)，因此它的物理性質(zhì)基本上和直鏈淀粉分子相同。直鏈淀粉沒有一定的大小，不同來源的直鏈淀粉含量差別很大，見表1-2。未經(jīng)降解的直鏈淀粉非常龐大，其DP為幾千。不同種類的DP差別很大1。直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離在這些年來引起了較多的關(guān)注，但取得的成功卻是很少。在之，用凝沉法探究谷物淀粉樣品的研究表

7、明：直鏈淀粉的沉降系數(shù)約為410 s，支鏈淀粉的沉降系數(shù)約為100400 s 。同時(shí)也表明了淀粉組成的沉降系數(shù)與濃度是緊密相關(guān)的5。直鏈淀粉的顆粒小，分子鏈與分子鏈間的締合程度較大，形成的微晶束晶體結(jié)構(gòu)緊密，結(jié)晶區(qū)域較大。直鏈淀粉由于分子排列較規(guī)整，分子容易相互靠攏重新排列。所以在冷的水溶液中,直鏈淀粉有很強(qiáng)的凝聚沉淀性能。工業(yè)上正是利用直鏈淀粉與支鏈淀粉的凝沉性的差異, 將直鏈淀粉與支鏈淀粉分離4。表1-2 各種糧食淀粉中直鏈淀粉的含量Table 1-1 The amylose content of variety starch 淀粉種類含量/%淀粉種類含量/%大米17小麥24糯米0燕麥24

8、玉米（普通種）26豌豆（光滑）30甜玉米70豌豆（皺皮）75糯玉米（蠟質(zhì)種）0甘薯20高粱27馬鈴薯22糯高粱0木薯17圖1-3 直鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)Fig 1-3 Molecular structure of amylose 圖1-4 支鏈淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)Fig 1-4 The spiral structure of amylose 1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動(dòng)態(tài)淀粉主要是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，因?yàn)閮烧叩姆肿咏Y(jié)構(gòu)、分子構(gòu)型狀態(tài)各有不同，所以使得不同來源的淀粉有各自的應(yīng)用表現(xiàn)。已有研究表明，淀粉中二者的比例和含量對(duì)淀粉的產(chǎn)品儲(chǔ)存、加工、物化特性研究等有著直接或者間接的影響。同時(shí)，直鏈淀粉和支鏈

9、淀粉本身也有著不同的性能和用途。1.3.1直鏈淀粉的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動(dòng)態(tài)由于直鏈淀粉具有近似纖維的性能，所以，工業(yè)上直鏈淀粉的用途較多。直鏈淀粉具有良好的成模性、質(zhì)構(gòu)調(diào)整、凝膠性及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)素吸收等功能，比如高直鏈淀粉食品是糖尿病患者理想食品,國(guó)外許多營(yíng)養(yǎng)研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行許多實(shí)驗(yàn),證實(shí)直鏈淀粉功能作用。另外，直鏈淀粉還是膽結(jié)石及高血壓病人理想食品,具有防止膽結(jié)石形成及降低膽固醇作用。直鏈淀粉與人體內(nèi)其它營(yíng)養(yǎng)元素吸收也相互影響,尤其是一些重要微量元素,如Zn、Fe、Ca、P等。試驗(yàn)結(jié)果表明,飼喂直鏈淀粉配方和支鏈淀粉配方食譜710天，飼喂直鏈淀粉配方的小豬腸道內(nèi)Fe、Ca吸收率均比飼喂支鏈淀粉配方

10、的高；Zn、P吸收率差異統(tǒng)計(jì)上不顯著,即所用試驗(yàn)群體(12頭小豬)Zn、P吸收率不受淀粉種類影響6。直鏈淀粉具有凝結(jié)成塊、易形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定凝膠物性,可作為強(qiáng)韌食品包裝薄膜，這種薄膜對(duì)氧和油脂有良好隔絕性,又因涂布展開性好,故適于作為產(chǎn)品保護(hù)層。其乙酸衍生物又可作為紡織纖維,還用于漿紗、纖維上光及作為膠粘劑、包扎材料等。此外,利用其粘合無毒、水溶性,還用于藥劑、繃帶、縫合線等醫(yī)療品中7。直鏈淀粉能制成強(qiáng)度高、柔軟性好的纖維和薄膜，而支鏈淀粉不能。目前,利用直鏈淀粉作為塑料增量劑和某些類型塑料完全代用品是可行的。美國(guó)用直鏈淀粉制成一種名為“Ecofoam”新型包裝充填物,類似于聚苯乙烯泡沫塑料“塑料

11、花生”,體輕而松軟,廣泛用于包裝工業(yè)。因其成分95% 是直鏈淀粉,能在很短時(shí)間內(nèi)分解，因此，可解決聚苯乙烯對(duì)環(huán)境污染問題6。表1-3 直鏈淀粉及衍生物的應(yīng)用Table 1-3 Application of amylose and its derivatives品名應(yīng)用特性食品包裝無毒、不透油、薄膜普通包裝與覆蓋層不透氣、耐水、可食藥品及糖果類包裝生物可降解性面包改善質(zhì)量、抗陳化性食品添加劑糕點(diǎn)面團(tuán)降低濕稀、減少收縮番茄醬增稠果膠與膠質(zhì)蜜餞降低明膠化時(shí)間醫(yī)療用品藥劑粘合繃帶、縫合線無毒、水溶性油田用品鉆井泥漿高粘度印花漿料高粘度與所需求的紡織漿料不黏著的短稠度紡織漿料提高潤(rùn)滑性和耐磨性吸聲貼片粘

12、合建筑材料瓦楞板高度保水性成膜性混凝土粘合鑄件芯粘合1.3.2支鏈淀粉的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動(dòng)態(tài)支鏈淀粉具有抗老化特性、改善凍融穩(wěn)定性、增稠作用、高膨脹性及吸水性,因而被廣泛應(yīng)用于食品加工、包裝材料的制造、水溶性及生物可降解膜、醫(yī)藥和建筑工業(yè)等領(lǐng)域8-9。為了加深理解木薯淀粉物性與其所含直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的關(guān)系，提高直鏈和支鏈淀粉應(yīng)用價(jià)值，必須對(duì)直鏈、支鏈淀粉進(jìn)行有效分離與檢測(cè)。但由于直鏈淀粉分子與支鏈淀粉分子交織纏繞在一起，分子內(nèi)與分子間存在著強(qiáng)大的氫鍵結(jié)合力10，因此較難分離，目前我國(guó)尚少有木薯直鏈淀粉與支鏈淀粉的純品出售。在過去的幾十年間，淀粉結(jié)構(gòu)研究已取得很大進(jìn)展，尤其是對(duì)淀粉顆粒

13、結(jié)構(gòu)的研究方面，更是如此。這些進(jìn)展一方面是由于出現(xiàn)了新的顯微技術(shù)，另一方面是由于固體的核磁和結(jié)晶技術(shù)的進(jìn)步，使得我們能夠分析顆粒內(nèi)部支鏈淀粉的構(gòu)造11,12。我們甚至可以檢查淀粉顆粒的不同部分13。由于早在六十多年前就了解了淀粉是由兩種大分子物質(zhì)組成，人們?cè)缇推谕M快建立淀粉組分的結(jié)構(gòu)模式14。雖然由于支鏈淀粉的束結(jié)構(gòu)已經(jīng)取得一致認(rèn)同，但關(guān)于該結(jié)構(gòu)的深入了解還很不夠。為了最終了解淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)以及淀粉的功能性，人們?nèi)栽诩?xì)致研究其束結(jié)構(gòu)15。1.4淀粉組分分離由上文可知，直鏈淀粉和支鏈淀粉無論是在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)還是用途上都有一定的區(qū)別，而且直鏈淀粉和支鏈淀粉的組成百分?jǐn)?shù)的差異，對(duì)木薯淀粉的品質(zhì)、儲(chǔ)藏

14、和加工產(chǎn)生重要的影響。所以研究直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離方法具有重大的意義。分離的原則：一是不能使淀粉的性質(zhì)發(fā)生變化，二是淀粉不能發(fā)生降解。1.4.1.溫水浸出法原理是直鏈淀粉易溶于熱水，從團(tuán)粒中滲透出來，并形成粘度很低的溶液，而支鏈淀粉只能在加熱加壓的情況下才能溶解于水。將脫脂的淀粉水懸浮液保持在糊化溫度或稍高于糊化溫度下攪拌，之后離心濃縮即可得到直鏈淀粉。溫度是影響該方法效率的主要因素。一般提取的溫度稍高于淀粉的糊化溫度即可16。Baum、Gilbel17將淀粉粒在氮?dú)饬飨掠?.5 mol/L NaOH溶液懸浮30 min, 然后用40000 rpm離心2 h, 上部清液經(jīng)過中和、濃縮、脫水

15、后得直鏈淀粉。此方法中溫度影響淀粉的抽提效率。若太高，支鏈淀粉也溶解導(dǎo)致純度較差；相反溫度太低，直鏈淀粉得率較低。1.4.2配合劑法配合劑分離法中以Schoch的丁醇法最為有名。該法是往淀粉糊液中加入正丁醇進(jìn)行冷卻, 使直鏈淀粉- 正丁醇復(fù)合物沉淀出來。直鏈淀粉分子在較高溫度下分子較為伸展,極性基因外露,很容易與一些極性有機(jī)物,如醇類、脂肪酸作用。而支鏈淀粉分子中,由于支鏈呈樹枝狀,在空間上起到阻礙作用,所以與極性試劑進(jìn)行反應(yīng)較慢，不易與這些化合物形成復(fù)合物沉淀4?？蓱?yīng)用此原理進(jìn)行直鏈淀粉和直鏈淀粉的分離操作。具體操作過程：首先經(jīng)過一定的預(yù)處理包括高壓加熱、堿液增溶等方法將淀粉分散成溶液，然后

16、加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，使直鏈淀粉成為一種不溶性的復(fù)合物沉淀，進(jìn)行離心，沉淀即為直鏈淀粉，而支鏈淀粉留于母液中，經(jīng)過減壓蒸餾，再用無水乙醇進(jìn)行沉淀，將其析出。該方法是目前實(shí)驗(yàn)室制備少量樣品的常用方法。敖自華等采用正丁醇分離了銀杏的兩淀粉，并用凝膠滲透色譜法進(jìn)行了純度鑒定，表明通過該法可得到純度較高的淀粉組分。孫忠偉等人對(duì)芋頭淀粉進(jìn)行了分離純化，并采用高效液相色譜進(jìn)行了鑒定18。1.4.3鹽類分離法同系高聚物的溶解度隨分子量的增加而降低。將非溶劑加入高聚物溶液中將會(huì)引起分子離析和沉淀, 開始析出和沉淀的是分子量較高的級(jí)分。在兩種聚合物的混合物中, 當(dāng)其中一種結(jié)晶趨勢(shì)較小時(shí),加入非溶劑將會(huì)沉淀或鹽析出

17、具有較多的全同立構(gòu)結(jié)構(gòu), 形成有較高結(jié)晶傾向的另一聚合物19。鹽類分離法就是利用直鏈和支鏈淀粉在鹽的濃度相同的條件下鹽析的溫度不同而將其分離。常用的無機(jī)鹽有硫酸鎂、硫酸銨和硫酸鈉等。支鏈淀粉和直鏈淀粉在室溫下能從13%硫酸鎂溶液中沉淀，但在80 只有直鏈淀粉能沉淀。利用這種性質(zhì)，工業(yè)上分離直鏈淀粉和支鏈淀粉的方法為：10%馬鈴薯淀粉用SO2和MgO調(diào)PH值至6.57.0，為了防止淀粉降解，加入13%硫酸鎂，160 加壓加熱使淀粉溶解。冷卻至80 ，高速離心，直鏈淀粉沉淀。母液繼續(xù)冷卻至20 ，離心分離，沉淀為支鏈淀粉沉淀1。1.4.4控制結(jié)晶分離法淀粉溶液或淀粉糊在低溫靜置條件下,直鏈淀粉分子

18、就緩慢滲出, 如果適當(dāng)?shù)亟档蜏囟?則此類分子將產(chǎn)生定向并從溶液中結(jié)晶出來。這種迅速結(jié)晶的現(xiàn)象是結(jié)構(gòu)有規(guī)律的全同立構(gòu)-D-1.4鍵鍵合的線性直鏈淀粉分子的特征。如果濃度太高或溫度太低, 直鏈分子的滲出減慢而結(jié)晶受阻,結(jié)果取而代之的是一種三維凝膠網(wǎng)絡(luò), 即淀粉的凝沉現(xiàn)象。如果支鏈淀粉的線性外支鏈也參與凝膠的形成, 那么直鏈和支鏈淀粉分離困難或成為不可能。Etheridge等通過控制結(jié)晶過程分離出了純度相當(dāng)高的直鏈淀粉。Hoffman. Starkfarbriken應(yīng)用以凝膠作用為基礎(chǔ)的流體力學(xué)法分離出馬鈴薯直鏈淀粉和支鏈淀粉16。1.4.5電泳法馬鈴薯中支鏈淀粉含有少量磷酸，具有負(fù)電荷，可利用電泳

19、將直鏈淀粉和支鏈淀粉分離。將馬鈴薯淀粉溶液置于電場(chǎng)中，支鏈淀粉移向陽極，沉淀下來，直鏈淀粉仍留在溶液中。玉米淀粉不含磷酸酯，但直鏈淀粉吸附有脂肪酸，具有負(fù)電荷，置于電場(chǎng)中，直鏈淀粉向陽極移動(dòng)沉淀下來，而支鏈淀粉仍留在溶液中。1.4.6纖維吸附法利用直鏈淀粉能被纖維素吸附而支鏈淀粉不被吸附的性質(zhì)可將它們分離。將冷淀粉溶液通過脫脂棉花柱, 直鏈淀粉被吸附在棉花上, 支鏈淀粉流過, 直鏈淀粉再用熱水洗滌出來。用此方法可制得高純度的支鏈淀粉1。1.4.7 色譜法由于直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)和分子量的不同,使得采用凝膠過濾層析分離成為可能。當(dāng)?shù)矸廴芤和ㄟ^層析柱時(shí),分子直徑比凝膠孔大的支鏈淀粉分子只經(jīng)

20、過凝膠顆粒之間的空隙,隨洗脫液一起移動(dòng),先流出柱外；而分子直徑比凝膠孔小的直鏈淀粉分子,能夠進(jìn)入凝膠相內(nèi), 不能和洗脫液一樣向前移動(dòng), 移動(dòng)的速度必然要落后于支鏈淀粉分子。但由于此方法所用的上樣量較少, 所以多用于對(duì)已分離的直鏈淀粉和支鏈淀粉進(jìn)行純度檢驗(yàn)17。1.4.8伴刀豆蛋白A法Matheson 和Welsh20提出了另一種淀粉級(jí)分分離的方法，不沉淀直鏈淀粉，而是講支鏈淀粉與外援凝集伴刀豆球蛋白A形成復(fù)合物，然后將其沉淀出來，再用蛋白酶將外源凝集素（一種蛋白質(zhì)）水解去除21。雖然該方法可獲得較純的支鏈淀粉，但是如果原淀粉樣品中含有分支狀的中間級(jí)分，則也會(huì)隨支鏈淀粉沉淀析出20,22。伴刀豆

21、球蛋白A與支鏈淀粉的結(jié)合力與外源凝集素濃度和多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)15。1.5本課題的提出、研究?jī)?nèi)容和意義淀粉既可供食用也可作為工業(yè)原料，其價(jià)格低廉且來源十分豐富，是一種重要的化工原料之一，淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，兩者具有不同的結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用特性。本項(xiàng)目利用亞熱帶木薯淀粉為原料，研究直鏈淀粉和支鏈淀粉的較佳分離方案，并探究其最佳的分離條件。為建立以木薯淀粉為原料分離直鏈淀粉和支鏈淀粉的工業(yè)化生產(chǎn)平臺(tái)提供技術(shù)支持，同時(shí)對(duì)提高廣西木薯淀粉深加工產(chǎn)品檔次和質(zhì)量、拓寬淀粉深加工產(chǎn)品應(yīng)用功能和應(yīng)用領(lǐng)域都具有十分重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。研究的主要內(nèi)容是：(1) 研究制備木薯直鏈淀粉和支鏈淀粉的產(chǎn)品工藝方法；(2)

22、通過單因素實(shí)驗(yàn)來考察原淀粉液的濃度、糊化溫度等因素的影響，做出單因素影響曲線以確定最佳工藝條件；(3) 通過紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)顯色后的淀粉進(jìn)行掃描，確定淀粉中的直鏈及支鏈被分離。此研究可以有效的利用廣西十分豐富的木薯淀粉資源，提高木薯淀粉的深加工工藝水平，拓寬木薯淀粉深加工產(chǎn)品品種及其應(yīng)用功能，對(duì)廣西的木薯產(chǎn)業(yè)具有一定的指導(dǎo)意義及參考價(jià)值。順應(yīng)科學(xué)發(fā)展觀的經(jīng)濟(jì)體制，可以為日益緊張的工業(yè)提供新的原料來源，減少對(duì)石油工業(yè)的依賴。附錄一 英文文獻(xiàn)翻譯原文附錄二 譯文用密度梯度離心法分離小麥淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉Mahsa Majzoobia, Arthur J. Rowea, Martin C

23、onnockb, Sandra E. Hilla, Stephen E. Hardinga*aSchool of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough LE12 5RD, UKbSchool of Applied Sciences, University of Wolverhampton, Wolverhampton WV1 1SB, UKReceived 4 June 2002; revised 26 September 2002; accepted 14 October 20

24、02摘要本文介紹了用密度梯度離心法分離直鏈淀粉和支鏈淀粉并由分析性超速離心機(jī)作為分析支持的新穎的技術(shù)。淀粉首先在90DMSO和5的蔗糖溶解，然后鋪在梯度形成溶液的10 %- 30的蔗糖在90DMSO中，用由36的氯化銫和在水中的25蔗糖作緩沖。然后用制備超速離心機(jī)用轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為14000prm的速度離心大約25min。小麥淀粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：這種方法出品高度純化的支鏈淀粉中可溶和高度聚集形式，且直鏈淀粉級(jí)分的至少部分純化。2003年 Elsevier Science Ltd出版。關(guān)鍵詞：淀粉分離、分析超速離心法、密度梯度離心法、小麥1.介紹淀粉是一種多糖，對(duì)工業(yè)尤其是食物方面、制藥公司、醫(yī)療保健

25、和涂料行業(yè)（比如Englyst & Hudson，1997）有重要的地位，主要有直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。例如小麥淀粉，里面有25%直鏈淀粉和75%支鏈淀粉( Shibanuma, Takeda, Hizukuri & Shibata,1994)。直鏈淀粉是淀粉中幾乎無分支的線性部分。這是由-D-葡萄糖通過-D-1，4糖苷鍵鏈接起來的。支鏈淀粉也有直鏈淀粉的分子，但是它是由-D-1，6糖苷鍵鏈接的 (Cura & Krisman, 1990; Lasztity,1999; Shibanuma et al., 1994)。直鏈淀粉和支鏈淀粉的分析兩已經(jīng)被估計(jì)為105和108 (Roger, Bel

26、lo-Perez &Colonna, 1999; Roger & Colonna, 1996)。淀粉如高直鏈玉米淀粉，土豆淀粉和皺紋豌豆淀粉的分子量現(xiàn)已報(bào)告。這些分子的特點(diǎn)是具有較高的直鏈淀粉，具有較低的鏈分支( Banks, Geddes, Greenwood & Jones, 1972;Colonna & Mercier, 1984; Lasztity, 1999).直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離在這些年來引起了較多的關(guān)注，但取得的成功卻是很少。( Cornell, McGrane & Rix, 1999)。在之，用凝沉法探究谷物淀粉樣品的研究表明：直鏈淀粉的沉降系數(shù)約為410s，支鏈淀粉的沉降

27、系數(shù)月尾100400s (see, e.g. Lelievre, Lewis & Marsden, 1986;Fronimos, 1990; Millard, Wolf, Dintzis & Willett, 1999).同時(shí)也表明了淀粉組成的沉降系數(shù)與濃度是緊密相關(guān)的(Tongdang, Bligh, Jumel & Harding,1999)。在這項(xiàng)研究中，我們介紹一個(gè)新穎的技術(shù)，特別是在谷物科學(xué)中，使用超速離心法分離直鏈淀粉和支鏈淀粉。在這種方法中，直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離是應(yīng)用它們之間的分子大小的和沉降速率的差異，使用蔗糖密度梯度離心法。在密度梯度中獲得更好的離心效果的關(guān)鍵是：首先防止

28、對(duì)流，在高速轉(zhuǎn)動(dòng)中就能破壞這種對(duì)流行為，第二，增加了一個(gè)相對(duì)的離心力場(chǎng)從而維持一個(gè)相對(duì)恒定的速度沉降粒子( Ralston,1993)。分析型超速離心機(jī)是一種擁有能用于分析直鏈淀粉和支鏈淀粉已經(jīng)分離的機(jī)器，在分析沉降速率中應(yīng)用的分析型超速離心機(jī)，是用來評(píng)估密度超速離心機(jī)離心成功與否的主要技術(shù)( Banks, Greenwood & Muir, 1974)。二甲基亞砜（DMSO）已經(jīng)被證明為一種溫和的試劑，淀粉可以溶于其中而不會(huì)產(chǎn)生明顯的分層，這個(gè)特性已經(jīng)被用于溶解淀粉( Cheetham & Tao, 1997; Jackson & Lincoln, 1991 )。同是有幾個(gè)報(bào)告顯示，脫脂淀粉

29、的結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)有關(guān)系( Morrison, 1981; Vasanthan & Hoover,1992)。因此脫脂淀粉也用于測(cè)試脂類對(duì)淀粉分離的影響。2.材料和方法2.1脫脂淀粉美國(guó)西格瑪化工有限公司的純小麥淀粉，使用85%甲醇作為溶劑( Cornell et al., 1999）用索氏萃取法萃取脫脂24h。然后在已知溫度和水分含量的環(huán)境下干燥淀粉。2.2測(cè)定淀粉的直鏈淀粉含量直鏈淀粉含量和支鏈淀粉的比例以及支鏈小麥淀粉的比例測(cè)試預(yù)計(jì)使用來自Megazyme (Ireland) 的商業(yè)用分析工具。2.3樣品制備將50mg/ml純小麥淀粉和5%（w/v）蔗糖加入50ml的90%DMOS（v/v

30、用蒸餾水），用沸水浴加熱，為了避免形成任何凝膠狀淀粉，用高速旋渦混合器中混合15min (Gibson et al., 1997)。然后將樣品在室溫下冷卻，用滾軸混合器攪拌過夜。脫脂小麥淀粉也是用這樣的方法制備。2.4用密度超速離心機(jī)制作緯向密度梯度層一個(gè)貝克曼帶狀超離心機(jī)B-XIV鈦帶狀轉(zhuǎn)子運(yùn)行在2000 rpm，內(nèi)充滿了由10%30%蔗糖溶于90%DMOS的密度梯度范圍在1.21.3g/ml的溶液540ml。由36%（w/v）氯化銫和24%（w/v）蔗糖蒸餾水溶液制成的密度大約為1.4g/ml的緩沖液，用于位移加載前的空氣樣本和位移結(jié)束時(shí)收集密度梯度的樣本。然后用25ml90%DMOS當(dāng)覆

31、蓋層。將樣品置入機(jī)器，設(shè)定溫度為20，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為14000rpm，離心25min。當(dāng)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速降至2000rpm后，把密度大約1.9g/ml的FC43注入離心管外圍。2.5密度測(cè)量檢查密度梯度形成的穩(wěn)定的和整個(gè)運(yùn)行充分線性是很重要的。每個(gè)百分?jǐn)?shù)的密度都是用分析天平精確稱量的1ml的質(zhì)量來獲得（有效體積）。2.6通過碘染色法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉的分?jǐn)?shù)碘顯色法被用于快速測(cè)量直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，通過顯色形成兩個(gè)不同的顏色，主要是直鏈淀粉的顯深藍(lán)色，主要含支鏈淀粉的顯棕色。每1ml試劑中含有0.35mlKOH，0.4mlHCl（0.1N）和0.07mlKI-I2（Gerard, Barron,

32、Colonna & Planchot 2001)。用90%DMOS作空白對(duì)照。測(cè)出直鏈和支鏈的百分?jǐn)?shù)，用于做下一步實(shí)驗(yàn)。2.7 凈化淀粉組件的解決方案基于碘顯色法得出的數(shù)據(jù)，把淀粉進(jìn)一步純化。把樣品放入沸水浴中加熱幾分鐘，然后加入50ml無水乙醇，然后反演混合。在沉淀過程中加入最小化淀粉聚合的乙醇，然后加熱。2h后放置在室溫中，收集沉淀（2000g,10min）。棄上清液，收集沉淀并用乙醇洗滌多次，用真空干燥箱烘干，設(shè)置為50.2.8 淀粉在90%DOMS中的再增溶首先，通過在低轉(zhuǎn)速上的旋渦混合混頻器用螺旋蓋管，把干燥淀粉分散在5毫升90的DMSO中，。然后將試管加蓋并置于沸水浴。 幾分鐘后，

33、取出管 并渦旋以高速，然后返回到水浴15分鐘，間歇攪拌。如果凝膠狀 淀粉團(tuán)塊保持到15分鐘后，該 攪拌和加熱步驟被繼續(xù)，直到它們完全分散。然后將樣品冷卻至室溫，并留在輥混合攪拌過夜。2.9 使用貝克曼沉降速度實(shí)驗(yàn)最優(yōu)XL-I貝克曼艦XL-I用于做沉降速度實(shí)驗(yàn)，目的是為了獲得關(guān)于分理出的直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度信息。純度從評(píng)估樣品的沉淀系數(shù)分布圖中獲得。進(jìn)行樣品純化的實(shí)驗(yàn)在型號(hào)XL-I分析超速離心機(jī)上進(jìn)行，在20上先8000rpm離心4h，再50000 rpm離心4h。給定的徑向位置r，沉降邊界移向細(xì)胞基地的濃度變化隨時(shí)間變化（dc(r)/dt)是生產(chǎn)和表觀重量平均沉降系數(shù)，然后S*是使用程序D

34、CDT+(Philo, 2000).計(jì)算出的。表示在水溫20下的標(biāo)準(zhǔn)密度和粘度的沉降系數(shù)（S20,w）就可以得出( Tanford, 1961 ):指溶質(zhì)的微分比體積，20，w指水的密度，20，w指水的粘度（都是在20的條件下），和是指溶劑在溫度T下相應(yīng)的參數(shù)。在項(xiàng)目中所使用的參數(shù)如下：直鏈淀粉的：在20下溶于90DMSO，0.643ml/g，(Fujii,Honda & Fujita, 1973)。支鏈淀粉的：在20下溶于90DMSO，0.613ml/mg，(Fronimos, 1990)。20的90DMSO的密度：1.0861 g/ml ( Tongdang, 2001 )。20的水的粘度

35、：1.004厘泊。20的90DMSO的粘度：4.0厘泊。(Van Holde, Johnson& Ho, 1998)。2.10 用刀豆蛋白A（刀豆蛋白A）檢測(cè)支鏈淀粉中含有的直鏈淀粉的分?jǐn)?shù)在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH值下，凝集素刀豆蛋白A專門配合物分支多糖是基于a- D-吡喃葡萄糖（例如支鏈淀粉）或 a- D-mannopyrannosyl單位在多個(gè)非還原性末端基團(tuán)連接與沉淀的形成。因此，刀豆蛋白A被用來研究直鏈淀粉的純度。在本實(shí)驗(yàn)中，90DMSO的淀粉溶液溶解在乙酸鈉溶液（200mM，pH=6.4），加入刀豆蛋白A使支鏈淀粉沉淀，然后以速度1000rpm離心10min (Gibson et

36、al., 1997)。2.11直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率各成分的濃度使用DCDT+算法用一下的方法測(cè)量：對(duì)沉降速率實(shí)驗(yàn)掃描得，其中的邊界有幾乎移動(dòng)到該單元的中間被選定。各組分的再沉積的圖表明了明顯的沉淀系數(shù)分布;是相對(duì)沉降系數(shù); 可以獲得。下一個(gè)峰的面積表示的部分的負(fù)載濃度( Philo, 2000 )。3.討論密度的測(cè)量證實(shí)了線性度和梯度層（圖1）的穩(wěn)定性。因此，區(qū)帶轉(zhuǎn)子內(nèi)的梯度層已完成成功。碘染色結(jié)果顯示，大部分的直鏈淀粉在前四個(gè)級(jí)分已經(jīng)分離（加入碘后藍(lán)色的百分?jǐn)?shù)可以證明）。圖1.緯向餾分作為分?jǐn)?shù)數(shù)的函數(shù)的平均密度Fig. 1. The average densities of the zo

37、nal fractions as a function of fraction number.圖2.分析超速離心沉降速度50000轉(zhuǎn)在圖前四部分富含直鏈淀粉。（F為從緯向超速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)次數(shù)），20.08。光學(xué)記錄記錄用瑞利干涉光學(xué)系統(tǒng)，并使用DCDT+系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成時(shí)間導(dǎo)數(shù)的濃度對(duì)沉降系數(shù)S *分布作為函數(shù)（見正文）。Fig. 2. Analytical ultracentrifuge sedimentation velocity diagrams for the first four fractions at 50000 rpm rich in amylose. ( F=fraction num

38、ber from the zonal ultracentrifuge experiment), 20.0 . Optical records recorded using Rayleigh interference optics, and converted into a time derivative concentration distribution as a function of the apparent sedimentation coefficient s* using the DCDT +programme (see text).圖3.分析超速離心在轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)的沉降速度圖

39、的前四個(gè)部分中的的速度顯示的中間體S組成分?jǐn)?shù)（F指分?jǐn)?shù)）。其他細(xì)節(jié)，如圖2。Fig. 3. Analytical ultracentrifuge sedimentation velocity diagrams for the first four fractions in the speed of 8000 rpm showing an intermediate s component. (F = fraction number). Other details, as Fig. 2.另外，50000rpm（圖2）的實(shí)驗(yàn)沉降速度結(jié)果表明存在大分子的沉降系數(shù)值約6 8S，能被分離的直鏈淀粉也在這個(gè)范圍內(nèi)。雖然在8000rpm下約一個(gè)沉降系數(shù)的成分70 150S也存在于這些組分（圖3）。加入刀豆蛋白A的前四部分薄沉淀層形成，其中顯示，大分子物質(zhì)的分支也存在于第一個(gè)部