變異與誘變育種

1、3.5kg7kg3.5kg甘藍(lán)拉薩北京資料1：在北京培育的優(yōu)質(zhì)甘藍(lán)品種，葉球最大的有3.5KG，當(dāng)引種到拉薩后，由于晝夜溫差大、日照時(shí)間長(zhǎng)、光照強(qiáng)，葉球可重達(dá)7KG左右。但再引回北京后，葉球又只有3.5KG。為什么會(huì)這樣呢？資料2：在種植花卉時(shí)，發(fā)現(xiàn)紅花的后代出現(xiàn)了藍(lán)紫花，藍(lán)紫色花的后代仍是藍(lán)紫色。這種現(xiàn)象是哪類變異呢？紅花的后代變了藍(lán)紫色藍(lán)紫色花后代仍是藍(lán)紫色第六章 人工誘變育種原理：人工誘變菌種使其增加基因突變的頻率，從而更多機(jī)會(huì)篩選得到優(yōu)良的子代菌種。優(yōu)點(diǎn)： 1 能大幅度地提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量 2 突變頻率比較大缺點(diǎn)： 1 疲勞效應(yīng)，指某一菌株長(zhǎng)期使用誘變劑處理之后，會(huì)對(duì)誘變劑不再敏感

2、2 會(huì)引起菌種生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)、孢子量減少和代謝減慢等 3 仍有一定的盲目性 誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株， 選出性能優(yōu)良的正變異株篩選誘變育種的操作方法選擇菌種純化培養(yǎng)細(xì)胞懸液誘變處理篩選變異菌株 1、誘變劑的種類 物理誘變劑 射線如紫外線、X-射線、-射線，快中子 化學(xué)誘變劑 堿基類似物、5-氟尿嘧啶、烷化劑、亞硝基胍和甲基磺酸乙酯等。 化學(xué)誘變劑，比物理誘變劑電離輻射有效，而且很經(jīng)濟(jì)，但大部分誘變劑是致癌劑，危害性大。一、常見(jiàn)誘變劑2、誘變劑的作用原理(1)物理誘變劑紫外線引起DNA上相近的兩個(gè)胸腺嘧啶成為二聚體。(2)化學(xué)誘

3、變劑烷化劑（硫酸二乙酯，芥氮等）與堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)錯(cuò)配。堿基類似物（5-溴尿嘧啶等）DNA復(fù)制時(shí)代替堿基參與DNA復(fù)制，造成復(fù)制錯(cuò)誤。移碼突變誘變劑（吖啶類染料）誘變劑分子能插入相鄰的DNA堿基對(duì)之間，引起移碼突變。脫氨劑（亞硝酸）引起嘌呤和嘧啶上的氨基變成酮基，引起DNA復(fù)制時(shí)的錯(cuò)配。1）紫外線(1)、紫外線的有效光譜（40390nm） 能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長(zhǎng)范圍是200300nm，最有效的波長(zhǎng)為260265nm。(2)、紫外線的用量（相對(duì)劑量：用致死率表示）15W紫外燈、30cm燈距、殺菌率9099.9時(shí)不同微生物的照射時(shí)間：一般芽孢：10min一般微生物營(yíng)養(yǎng)

4、體：35min無(wú)芽孢菌和革蘭氏陰性菌：0.52min3、常見(jiàn)誘變劑的誘變?cè)砑笆褂梅椒ǎ?）紫外線的誘變機(jī)制嘧啶的紫外線光化產(chǎn)物紫外線的誘變作用機(jī)制主要是引起DNA鏈上相鄰的嘧啶形成二聚體。導(dǎo)致復(fù)制時(shí)不能正常配對(duì)。A、光復(fù)活作用把經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見(jiàn)光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。光復(fù)活機(jī)理：經(jīng)紫外線照射所形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中與光激活酶結(jié)合，形成的復(fù)合物暴露在可見(jiàn)光（300500nm）下時(shí)，此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。（4）誘變后細(xì)胞的修復(fù)PRE為光復(fù)活酶 由于光復(fù)活作用，所以在進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，應(yīng)避光

5、（或在紅光下）進(jìn)行照射及處理照射后的菌液。核酸內(nèi)切酶切開(kāi)二聚體的5末端,形成3-OH和5-P的單鏈缺口 核酸外切酶從5-P到3-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口 DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3-OH 端起合成缺失片段 連接酶將新合成鏈的3-OH與原鏈的5-P相連接 B、暗修復(fù)作用紫外線誘變育種中的注意事項(xiàng)紫外線誘變 (265nm)，攪拌；避光，提前20min預(yù)熱紫外燈。結(jié)束時(shí)冰浴1-2h。(2)化學(xué)誘變劑烷化劑（硫酸二乙酯，芥氮等）與堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)錯(cuò)配。堿基類似物（5-溴尿嘧啶等）DNA復(fù)制時(shí)代替堿基參與DNA復(fù)制，造成復(fù)制錯(cuò)誤。移碼突變誘變劑（吖啶類染

6、料）誘變劑分子能插入相鄰的DNA堿基對(duì)之間，引起移碼突變。脫氨劑（亞硝酸）引起嘌呤和嘧啶上的氨基變成酮基，引起DNA復(fù)制時(shí)的錯(cuò)配。1、了解菌種特性（生長(zhǎng)情況、菌落類型，最佳培養(yǎng)條件，有效產(chǎn)物合成的最佳條件）2、建立一個(gè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)產(chǎn)物的方法。3、確定菌種保藏的方法。4、制定好整個(gè)誘變育種實(shí)驗(yàn)的實(shí)施計(jì)劃，包括實(shí)驗(yàn)的時(shí)間安排，每天的工作計(jì)劃，耗材購(gòu)買計(jì)劃，人員的安排。誘變育種的操作方法選擇菌種純化培養(yǎng)細(xì)胞懸液誘變處理篩選變異菌株1 誘變育種前的準(zhǔn)備一、出發(fā)菌株的選擇1 要具備一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株。也就是說(shuō)出發(fā)菌株應(yīng)該對(duì)目的產(chǎn)物有一定的生產(chǎn)能力，至少能少量產(chǎn)生這種物質(zhì)。2 選擇純種作

7、為出發(fā)菌株3 選擇遺傳性狀比較穩(wěn)定的菌株4 連續(xù)誘變育種過(guò)程中如何選擇出發(fā)菌株？由于產(chǎn)量變異是數(shù)量遺傳，只能逐步累加，一次大幅度提高發(fā)酵水平不太容易。在選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)挑選每代誘變處理后均有一些表型改變的菌株。微生物中還存在一類“增變菌株”。2 誘變育種的步驟與方法選擇菌種純化培養(yǎng)細(xì)胞懸液誘變處理篩選變異菌株誘變代數(shù)菌落大小/cm菌落表面結(jié)構(gòu)菌落顏色可溶性色素效價(jià)變化（%）11.3平滑疏松龜背灰綠赭石100100.8平滑緊密白火泥棕2011110.6平滑緊密白海螺橙2642自然分離0.5平滑緊密白淡可可棕3547130.4平滑緊密白魚(yú)鰓紅6911表：灰黃霉素高產(chǎn)菌尋麻青霉D-756誘變系譜菌

8、株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系二、菌株的純化培養(yǎng)（做一次自然選育）保存的菌種斜面活化培養(yǎng)劃線分離（獲稀釋分離）挑選優(yōu)良性狀的單菌落三、菌懸液的制備目的： （1）細(xì)胞均勻分散，能均勻的接觸誘變劑 （2）避免以后的篩選的菌落不純。方法： （1）細(xì)菌菌體：液體培養(yǎng)、震蕩打勻、棉花過(guò)濾 （2）孢子：液體培養(yǎng)至孢子剛萌發(fā)、震蕩打勻、棉花過(guò)濾 （3）絲狀菌體：取菌絲尖端處菌體進(jìn)行誘變 （4）制備原生質(zhì)體：2 誘變育種的步驟與方法選擇菌種純化培養(yǎng)細(xì)胞懸液誘變處理篩選變異菌株菌懸液的制備要求1 在細(xì)胞生理活性方面既要同步，又要處在最旺盛的對(duì)數(shù)期，這樣突變率高，重現(xiàn)性也好。對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，常常通過(guò)前培養(yǎng)達(dá)到要求。菌懸液

9、的制備要求2 菌懸液中的菌體應(yīng)該是單細(xì)胞或單核的孢子，不但能均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現(xiàn)象。3 菌懸液的濃度，要求霉菌孢子約為106個(gè)/mL，放線菌孢子約為106107個(gè)/mL。一）誘變劑種類的選擇1.誘變劑的種類？2.選何種誘變劑？（沒(méi)有定論，參考：菌株的特性，誘變史，或做實(shí)驗(yàn)確定）四、誘變劑及誘變劑量選擇菌種純化培養(yǎng)細(xì)胞懸液誘變處理篩選變異菌株亞熱帶鏈霉菌（白霉素）與X射線劑量之間的變異關(guān)系二）選擇最適誘變劑量前人的經(jīng)驗(yàn)長(zhǎng)期誘變高產(chǎn)菌株低劑量遺傳性狀不穩(wěn)定的菌株較緩和的誘變劑、低劑量誘變史短的野生型菌株先用較高劑量，然后用較緩和的誘變劑、低劑量多核的細(xì)胞菌株較高劑量五、影響突變率的因素1 菌種遺傳特性（有的誘變劑只作用于DNA復(fù)制期，有的可作用于各期細(xì)胞）2 菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（有的菌種孢子壁厚、有保護(hù)層、均減弱誘變劑的作用效果）3 培養(yǎng)條件和環(huán)境條件前培養(yǎng)（誘變前預(yù)培養(yǎng)）前培養(yǎng)一般加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黃、b-重氮尿嘧啶、嘌呤等物質(zhì)，能顯著提高突變率。若加入氯霉素、胱氨酸等還原性物質(zhì)，會(huì)使突變率下降。后培養(yǎng)后培養(yǎng)一般加入酪素水解物、酵母膏等富含氨基酸、生長(zhǎng)因子、ATP等，有利于突變體重新調(diào)節(jié)代謝。溫度、pH、氧氣等外界條件對(duì)誘變