針灸血清對乳腺癌MCF

1、針灸血清對乳腺癌MCF【摘要】目的：觀察針灸對乳腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法：針灸刺激雌性istar大鼠雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴，抽取大鼠“針灸血清分別與F7細(xì)胞混合培養(yǎng)，分為電針組、艾灸組和對照組。TT法檢測細(xì)胞生長情況，72h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率及Fas表達(dá)率。結(jié)果：F7細(xì)胞Fas表達(dá)率明顯增高，72h達(dá)57.70%；F7細(xì)胞生長受到明顯抑制，12h、24h、72h抑制率分別達(dá)17.55%、24.71%和31.85%；作用72h后的細(xì)胞凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18%,與艾灸組相近，均明顯高于對照組P0.05。結(jié)論：“針灸血清作用于F7細(xì)胞可能通過增加Fas

2、的表達(dá)率來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】針刺灸法乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期TheeffetfaupunturalandxibustinaltherapyntheapptsisfbreastellF7【ABSTRAT】bjetive:TbservetheeffetntheapptsisfbreastanerellF7ithaupunturalandxibustinaltherapy.ethds:ZusanliandSanyinjianEiguaninbthsidesffealeistarieereaupunturedandxibusted.F7ellasultiratediththeseru.Tdete

3、tetheytxiityithTT,anddetetetheapptsirateandFasexpressinrateithflytetryafter72hurs.Results:TheFasexpressinasbviuslyinreasedupt57.70%after72h.TheprliferatinfF7asinhibitedrearkably.Theinhibitinrateere17.55%,24.71%and31.85%after12h,24hand72h.Theapptsirateere8.72%and10.18%after72h,rearkablyhigherthanthen

4、trlgrup(P0.05).nlusin:AupunturalandxibustinalseruuldinreaseFasexpressinratetinhibitprliferatinfF7ellandindueitsapptsis.【KEYRDS】AupunturexibustinBreastNeplassApptsisellyle乳腺癌在我國的發(fā)病率不斷增高，尋找有效的治療方法具有深遠(yuǎn)的意義1。針灸在一定程度上能抑制腫瘤的生長，對惡性腫瘤具有一定的治療作用，可緩解臨床病癥，減輕放、化療后的副反響，改善機(jī)體免疫功能，進(jìn)步患者的生活質(zhì)量。針灸腧穴而采集的“針灸血清是近年來針灸研究中提出的一

5、種新的研究思路和方法。本文通過應(yīng)用針灸血清培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞F7，觀察針灸對乳腺癌細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的影響，為尋找針灸治療乳腺癌的途徑和方案以及為討論針灸抑瘤機(jī)制提供線索。1材料與方法1.1材料乳腺癌細(xì)胞株F7由山東中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞室提供。雌性istar大鼠30只，體重250g左右，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室提供。RPI1640購自美國GIB公司，新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所，二甲基亞砜分析純購自北京亞太精細(xì)化工公司，TT購自SIGA公司，F(xiàn)as、異硫氫酸熒光素FIT標(biāo)記的單克隆抗體IgG1及免疫陰性對照品IgG1FIT均為美國Pharingen公司產(chǎn)品，由北京岳泰生物公司提供。

6、FASan型流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1針灸血清的制備1選用雌性安康istar大鼠30只，隨機(jī)分為空白對照組、電針組和艾灸組各10只。電針組和艾灸組分別用電針和艾灸的治療方法在相當(dāng)于“足三里、“三陰交和“內(nèi)關(guān)穴的部位進(jìn)展治療，電針組選用30號40毫針，直刺2030，得氣后接DELD68051型電針治療儀，選用連續(xù)波，留針20in。艾灸組用雀琢灸法灸穴位20in，連續(xù)6d，每天2次，在最后一次治療完畢后1h，乙醚吸入麻醉，腹主動脈取血，無菌別離血清，經(jīng)56、30in滅活處理后，置-20冰箱備用。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)F7細(xì)胞株培養(yǎng)于RPI1640培養(yǎng)液中，置37，5%2體積比，

7、下同和飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，23d胰酶消化傳代1次，當(dāng)細(xì)胞傳至第4代、細(xì)胞生長良好、狀態(tài)穩(wěn)定時，用胰蛋白酶消化后，以2105/2的密度重新種入30的6孔培養(yǎng)皿上，于37和5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。第2天用磷酸鹽緩沖溶液PBS將細(xì)胞清洗2次，分別參加正常鼠血清、電針鼠血清、電針鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)72h。1.2.3TT法檢測F7細(xì)胞抑制率取對數(shù)生長期的F7細(xì)胞，胰酶分散計數(shù)，用RPI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/l，按每孔200l接種于96孔板中每孔細(xì)胞數(shù)為2104個，置于37、5%2和飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24d，貼壁后倒掉RPI1640培養(yǎng)液，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每一組設(shè)3個平行孔，

8、分組如下：對照組RPI1640培養(yǎng)液中含10%正常鼠血清，電針組RPI1640培養(yǎng)液中含10%電針鼠血清，艾灸組RPI1640培養(yǎng)液中含10%艾灸鼠血清。每一組分別參加血清200l，再置培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、48h、72h后，每孔參加5g/lTT20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔參加二甲基亞砜150l，振蕩至結(jié)晶完全溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490n波長的吸光度A值，計算抑制率，由抑制率說明針灸血清對人乳腺癌F7細(xì)胞株的敏感性。抑制率%=對照組A值-含藥血清組A值/對照組A值100%。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化取對數(shù)生長

9、期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化經(jīng)參加以上各組血清培養(yǎng)72h后的貼壁細(xì)胞，搜集細(xì)胞數(shù)目分別約5105，1000r/in離心5in，棄去培養(yǎng)液。經(jīng)PBS漂洗2次后，參加冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4過夜。然后除去固定液，用3lPBS溶液重懸細(xì)胞5in，1000r/in離心5in，棄去PBS溶液，參加P緩沖液50l，靜置20in，再參加100g/lPI液10l，PBS溶液480l，室溫避光30in后上流式細(xì)胞儀檢測，difit軟件BD公司提供分析數(shù)據(jù)。1.2.5流式細(xì)胞儀檢測Fas表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化計數(shù)，37、5%2箱中培養(yǎng)24h，至細(xì)胞生長旺盛貼壁后，去掉培養(yǎng)液，分別參加以上各組血清培養(yǎng)

10、液于2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。然后分別胰酶消化后離心，每支離心管中參加70%乙醇固定細(xì)胞，以PBS液漂洗2次后，再離心1500r/，5in。取細(xì)胞懸液500l，參加異硫氫酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人的單克隆抗體IgG1工作液20l，另各取一支陰性對照品IgG1FIT，室溫避光反響30in后，由流式細(xì)胞儀熒光檢測。2結(jié)果2.1針灸對細(xì)胞抑制率的影響見表1。由表1可見，針灸大鼠血清對乳腺癌F7細(xì)胞的抑制率呈時間依賴性，電針組和艾灸組均能明顯抑制F7細(xì)胞增殖P0.05，但電針組的抑制率高于艾灸組P0.05。表13組血清在不同時間段對F7細(xì)胞的抑制率略2.2針灸對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化的影響見圖13，表2。各

11、血清作用72h后，直方圖中均可見G0/G1期峰前的亞二倍體峰即凋亡峰，代表凋亡細(xì)胞群，以峰值上下代表凋亡細(xì)胞的比例。圖1、2、3顯示對照組、艾灸組和電針組的凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18%。由表2可以看出，各血清作用72h后，S期和G2/期細(xì)胞數(shù)均明顯減少P0.05，對照組、艾灸組和電針組的凋亡率分別為1.07%、8.72%、10.18(P0.05)。針刺和艾灸都能抑制F7細(xì)胞增殖，且兩者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。由表3可以看出，電針組和艾灸組大鼠血清對Fas的表達(dá)率明顯高于對照組P0.05，但電針組與艾灸組對Fas表達(dá)率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。表23組F7細(xì)胞血

12、清作用72h后細(xì)胞周期變化略表33組血清作用72h后F7細(xì)胞Fas表達(dá)3討論誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的一種新的思路，而且治療腫瘤的有效性主要表如今腫瘤細(xì)胞生長抑制和/或誘導(dǎo)凋亡2，3。本實(shí)驗(yàn)說明“針灸血清能抑制乳腺癌F7細(xì)胞生長?！搬樉难迨墙陙磲樉难芯恐刑岢龅囊环N新的研究方法，是指從針灸處理后的人或動物體上采集到的血清，作為效應(yīng)物質(zhì)參加到另一個反響系統(tǒng)中，同在體或離體器官組織、細(xì)胞或分子靶目的接觸，通過它們的功能或形態(tài)學(xué)的改變，直接地觀察針灸處理后的效應(yīng)4，5?！搬樉难逖芯糠椒蓺w納為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)兩大類。本實(shí)驗(yàn)針灸大鼠血清離體作用于人的腫瘤細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針灸刺激istar大鼠

13、雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴后的大鼠“針灸血清能使F7細(xì)胞抑制率升高，說明可以抑制體外腫瘤細(xì)胞生長。與正常對照組比擬，F(xiàn)7細(xì)胞S期和G2期百分率均明顯降低，說明針灸血清能影響乳腺癌F7細(xì)胞增殖，抑制其生長。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、開展、轉(zhuǎn)化和治療過程中具有重要意義，許多抗腫瘤藥物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用的。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，針灸刺激大鼠雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)穴，此大鼠“針灸血清能誘導(dǎo)乳腺癌F7細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是針灸腧穴后，通過某種內(nèi)在的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，引起血清中Fas的表達(dá)率增高，從而誘導(dǎo)乳腺癌F7細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。針灸療法能促使經(jīng)絡(luò)暢通，氣血調(diào)和，改善機(jī)體免疫功能，可產(chǎn)生不同程度的類藥性作用。從這個角度講，似可把針灸穴位比喻為“藥物，不具備藥的外在形態(tài)卻具有藥的某種作用本質(zhì)，這是針灸療法最本質(zhì)的特征之一?！搬樉难蹇芍苯佑^察其功能或?qū)嶒?yàn)物形態(tài)學(xué)的改變，有利于拓寬針灸研究的領(lǐng)域，推動針灸作用及其機(jī)理研究，尋求一條治療惡性腫瘤的獨(dú)特道路。參考文獻(xiàn)1唐漢鈞.乳腺癌的中醫(yī)臨床與實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2022，212：168172.2ElserEilliasnEAZangand,etal.NveltherapeutiapprahligandsfrPPARaandretinidreeptrsindueap