雞蛋清溶菌酶的提取及電泳鑒定

1、雞蛋清溶菌酶的提取及電泳鑒定第1頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 了解雞蛋清溶菌酶的性質(zhì)、常用制備方法及原理2 掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)原理及操作3 掌握SDS鑒定蛋白純度的原理及操作第2頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五1 溶菌酶的性質(zhì)溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明 (Fleming)在1922年在人的眼淚、唾液中發(fā)現(xiàn)的。廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清中，哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿、尿、乳汁、其它體液中及白細(xì)胞和組織（如肝、腎）細(xì)胞內(nèi)，而且部分植物、微生物中也含有此酶。人溶菌酶的活性是最高的，大約

2、為雞蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最豐富，約為0.3%-0.4%左右，而且蛋清來(lái)源廣泛，因此多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中提取的。第3頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五雞蛋清溶菌酶是動(dòng)植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。白色、無(wú)臭結(jié)晶粉末，味甜，易溶于水，遇堿易破壞，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由 129 個(gè)氨基酸殘基排列構(gòu)成的單一肽鏈，有四對(duì)二硫鍵，分子量為14300。堿性球蛋白，堿性氨基酸殘基及芳香族氨基酸如色氨酸殘基的比例很高。其等電點(diǎn)為 pH10.7；其最適 pH 值為 pH7 左右，最適溫度為50。第4頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月2

3、0日，1點(diǎn)29分，星期五不規(guī)則的橢圓體，比較容易結(jié)晶，結(jié)晶形狀隨結(jié)晶條件而異，有菱形八面體、正方形六面體及棒狀結(jié)晶等。用X射線衍射測(cè)得此酶的體積為453030。第5頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五性質(zhì)非常穩(wěn)定：當(dāng) pH 值在1.2-11.3 范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)幾乎不變。遇熱也很穩(wěn)定，pH 值 4-7、100處理1分鐘仍保持原酶活性；pH值 5.5、50加熱 4 小時(shí)后，酶活不受影響。但是，在堿性條件下，溶菌酶的熱穩(wěn)定性較差，易變性。熱變性隨著有機(jī)溶劑的增加而直線下降。溶菌酶對(duì)變性劑相對(duì)不敏感。在 6M 鹽酸胍溶液中，酶完全變性，但在8M尿素中則不變性。吡啶、十二烷

4、基磺酸鈉等對(duì)酶有抑制作用，氧化劑能使酶鈍化。第6頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2 溶菌酶的應(yīng)用水解N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間-1，4糖苷，破壞革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁而具有溶菌作用，是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱細(xì)胞壁溶解酶（Muramidase）。醫(yī)療、食品防腐及生物工程中，特別是在食品防腐方面，以代替化學(xué)合成的食品防腐劑，具有較好應(yīng)用價(jià)值。第7頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2.1 食品工業(yè)上的應(yīng)用選擇性的分解微生物的細(xì)胞壁，而不能作用于其它物質(zhì)，主要應(yīng)用于海產(chǎn)品、水產(chǎn)品、乳制品和干酪的保鮮，低度酒、糕點(diǎn)及飲料的防腐，以及

5、水產(chǎn)熟制品及肉類熟制品的防腐保鮮。加入到飲料中，如鈣奶、乳酸飲料中, 也可起到防蛀牙、爽口的作用。 為彌補(bǔ)奶粉的不足，可以向其中添加適量溶菌酶，制成母乳化奶粉，可以加強(qiáng)嬰幼兒的抗感染能力，可以促進(jìn)嬰兒胃內(nèi)乳酪蛋白形成細(xì)微凝乳，有利于嬰兒的消化吸收。特別對(duì)早產(chǎn)嬰兒，有防止體重減輕、預(yù)防消化器官疾病、增進(jìn)體重等功效。第8頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2.2 酶工程上的應(yīng)用近年來(lái)，溶菌酶已成為基因工程及細(xì)胞工程必不可少的工具酶，用以提取菌體內(nèi)的活性物質(zhì)如核酸、酶及活性多肽等。第9頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2.3 發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用溶菌酶制備酵母膏

6、，則不僅可以提高浸膏量的收率，還可以大大縮短酵母膏的制備時(shí)間。溶菌酶還可用于菌體內(nèi)含物質(zhì)的提取。第10頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2.4 醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用溶菌酶制備的口腔藥片或漱口液治療副鼻竇炎、口腔潰瘍、扁平苔蘚和滲出性中耳炎等疾病。作口服劑可抑制流行性感冒和腺病毒的生長(zhǎng)、抗感染及抗炎癥，還具有多種藥理作用。還具有一定的保健作用；有促進(jìn)血液凝固和止血作用；有組織再生和瘢痕形成促進(jìn)作用等。第11頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2.5 科學(xué)研究中的應(yīng)用利用溶菌酶專一性地水解細(xì)胞壁的特點(diǎn), 了解微生物細(xì)胞壁的構(gòu)造，分解細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，從而用于微

7、生物育種以及微生物分類等學(xué)術(shù)研究的領(lǐng)域。第12頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五3 溶菌酶的生產(chǎn)現(xiàn)狀及前景上世紀(jì)50年代，國(guó)外開始了溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)。采用從雞蛋清中直接結(jié)晶得溶菌酶，產(chǎn)品用來(lái)制作口服藥劑。上世紀(jì)60年代，又開發(fā)了離子交換法，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，達(dá)到了注射級(jí)藥品質(zhì)量要求。上世紀(jì)70年代，開發(fā)了親和色譜技術(shù)，主要用于高純度生化試劑的生產(chǎn)。近來(lái)超濾法與其它方法相結(jié)合，進(jìn)一步提高了溶菌酶的生產(chǎn)工藝水平。第13頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五目前美國(guó)、加拿大、荷蘭、法國(guó)、德國(guó)、丹麥、意大利、日本等國(guó)家均生產(chǎn)溶菌酶，其產(chǎn)量與

8、日俱增。近年來(lái)，溶菌酶被用作天然防腐劑，極大的促進(jìn)了其市場(chǎng)需求，每年以10%的速率增長(zhǎng)，現(xiàn)在市場(chǎng)規(guī)模約為700噸。第14頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五我國(guó)的食品工業(yè)、精細(xì)化工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)對(duì)溶菌酶具有較大的需求。我國(guó)于上世紀(jì)70年代采用離子交換法生產(chǎn)溶菌酶。目前國(guó)內(nèi)有大連生化、天津東原、煙臺(tái)金梓等廠家生產(chǎn)，初步滿足了國(guó)內(nèi)科研及醫(yī)藥工業(yè)的需求。進(jìn)口溶菌酶，存在著價(jià)格較高，進(jìn)口環(huán)節(jié)復(fù)雜等諸多方面的限制。國(guó)產(chǎn)溶菌酶工業(yè)剛剛起步，生產(chǎn)規(guī)模小，工業(yè)水平落后，產(chǎn)品的質(zhì)量與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)差距較大。存在提取率低，處理量小和產(chǎn)品比活低等缺點(diǎn)。第15頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29

9、分，星期五我國(guó)是世界上最大的產(chǎn)蛋國(guó)家，原料來(lái)源豐富，目前鮮蛋基本作為初級(jí)食品食用，深加工不足。而發(fā)達(dá)國(guó)家的鮮蛋加工業(yè)可以加工鮮蛋總產(chǎn)量的 40%。1kg雞蛋大約8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g，溶菌酶純品售價(jià)60 元/1g左右。因此，進(jìn)行溶菌酶的提取工藝研究，有著重大的科學(xué)意義和現(xiàn)實(shí)意義。 第16頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4 溶菌酶的提取工藝蛋清的組成成分蛋清又稱蛋白，是一種膠體物質(zhì)，約占蛋重的 45%60%，顏色為微黃色。雞蛋清實(shí)際分為四層，由外向內(nèi)的結(jié)構(gòu)是：第一層為外稀薄層，貼附在蛋清膜上，占整個(gè)蛋清的 23.3%；第二層為外濃厚層（亦稱中層濃厚蛋白層），

10、約 57.2%；第三層為內(nèi)稀薄層，約占 16.8%；第四層為系帶膜狀層（亦稱內(nèi)濃厚層），為一薄層，加上與之連為一體的兩端系帶，約占 2.7%。第17頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五水分蛋白質(zhì)碳水化合物維生素和色素灰分脂質(zhì)酶第18頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五第19頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4.1 直接結(jié)晶法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，原料便宜，設(shè)備投資小。最早應(yīng)用于蛋清溶菌酶的工業(yè)生產(chǎn)，使產(chǎn)品的成本大大降低，為其醫(yī)藥應(yīng)用作出了貢獻(xiàn)。缺點(diǎn)：（1）生產(chǎn)周期長(zhǎng)。（2）由于蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)不穩(wěn)定，因此生產(chǎn)過程中溶菌酶易失活。（3）由于

11、存在溶解平衡，而使不少溶菌酶殘留于母液。因此不能用以分離微量的溶菌酶。（4）收率低，活性低。（5）處理后的蛋清難以再利用。此點(diǎn)導(dǎo)致溶菌酶成本大幅上升。第20頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4.2 親和色譜法優(yōu)點(diǎn)：分離提純的倍數(shù)較高，得到的溶菌酶純度高，還能分離純化經(jīng)化學(xué)修飾而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于檢測(cè)酶與底物相結(jié)合的氨基酸殘基。對(duì)于濃縮與精制微量的溶菌酶，區(qū)分天然溶菌酶和修飾酶，或探索與底物結(jié)合的酶分子氨基酸殘基狀況等問題，這是很有效的方法。缺點(diǎn)：由于親和吸附劑的制作較為復(fù)雜，成本高，而且操作難度大，限制了它在工業(yè)上的大規(guī)模利用。第21頁(yè)，共55頁(yè)，2

12、022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4.3 離子交換法離子交換法具有簡(jiǎn)便、高效、成本低且可自動(dòng)化連續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn)，目前大部分溶菌酶生產(chǎn)廠家都采用離子交換法。這種方法在實(shí)際應(yīng)用中收率較高，降低了生產(chǎn)成本。要注意選擇合適的離子交換介質(zhì)。早期有 Amberlite IRC-50 樹脂 ，724 樹脂。目前采用Doulite C-464、磷酸纖維素（PC）、羧甲基纖維素（CMC）和羧甲基瓊脂糖（CMS）等離子交換劑，對(duì)溶菌酶都有較強(qiáng)的吸附能力。 第22頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4.4 超濾法超濾法的早期應(yīng)用主要是對(duì)溶菌酶的濃縮精制。它利用膜兩側(cè)的壓力差，使水分、鹽類及糖

13、類等小分子透過膜，而溶菌酶等蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)不能透過，從而達(dá)到濃縮效果。它的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)相變、操作簡(jiǎn)單、操作費(fèi)用低、產(chǎn)品不易失活。溶菌酶的分子量?jī)H 14300，而蛋清中其它蛋白質(zhì)的分子量則在 30000 以上，因此可選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x膜，以超濾法濾出溶菌酶。而殘留的大量蛋清則可直接應(yīng)用于食品加工。第23頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4.5 反膠團(tuán)萃取法反膠團(tuán)的主要應(yīng)用是萃取蛋白質(zhì)。目前研究使用最多的是陰離子表面活性劑 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉，簡(jiǎn)稱 AOT)。該表面活性劑價(jià)廉易得，分子極性頭小，有雙鏈，形成反膠團(tuán)時(shí)不必加入助表面活性劑，形成的反

14、膠團(tuán)極性核大，有利于蛋白質(zhì)分子的進(jìn)入。AOT/異辛烷/水體系是最常用的反膠團(tuán)萃取體系，對(duì)于分離溶菌酶這類相對(duì)較小的分子來(lái)說(shuō)，具有較好的分離效果。但是對(duì)于分子量大于 30000的蛋白質(zhì)則不易分離。1998 年，反膠團(tuán)萃取法從蛋清中直接分離溶菌酶。在離心管中將蛋清稀釋液與等體積的有機(jī)相（AOT/異辛烷）混合，恒溫水浴，高速搖動(dòng)，混合50 分鐘后，在 3000rpm 下離心 5 分鐘。分離得上層即反膠團(tuán)萃取液，加入等體積的 pH11.8 磷酸鹽緩沖液，震蕩 45 分鐘，進(jìn)行反萃取。離心后，收集下層水溶液，分析溶菌酶濃度，測(cè)定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收率達(dá) 90%，活性達(dá)73000u/mg，比大

15、多數(shù)商業(yè)產(chǎn)品活性高。第24頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五5 溶菌酶活力的測(cè)定方法典型作用底物是細(xì)胞壁粘多糖、甲殼素及糖苷。第25頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五溶菌酶的測(cè)定方法有兩大類：（1）利用酶反應(yīng)測(cè)定酶活性：用對(duì)溶菌酶敏感的革蘭氏陰性菌（主要是溶壁微球菌）、甲殼素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作為底物。本類方法簡(jiǎn)便、靈敏，但影響溶菌酶活性的因素很多，穩(wěn)定性差。比濁法 瓊脂平板法 比色法 熒光強(qiáng)度及熒光偏振法 第26頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五（2）非酶學(xué)測(cè)定法：電泳法使用歷史較長(zhǎng)，測(cè)定的溶菌酶含量包括有活性及失去

16、活性的溶菌酶總量。免疫法技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的。此類方法靈敏度高，為定性也較好。但是這類方法需要制備抗體，實(shí)驗(yàn)條件較酶學(xué)法復(fù)雜，因此大大限制了該類方法的應(yīng)用。第27頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五鹽析法1878年Hammarster首次使用，是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無(wú)機(jī)鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”（Salting in）。 而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時(shí)，蛋白質(zhì)又變得不深而自動(dòng)析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析“（Salting out）。 第28頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五Hammarste

17、r用硫酸鎂成功地將血清蛋白分成為清蛋白、球蛋白兩部分。硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等鹽析蛋白質(zhì)，其中運(yùn)用最廣的是硫酸銨。 第29頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五硫酸銨優(yōu)點(diǎn):化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；溶解度大，25時(shí)能達(dá)到4.1mol/L的濃度；溶解度的溫度系數(shù)變化較小，在030范圍內(nèi)溶解度變化不大，如25時(shí)飽和溶解度為4.12mol/L，即767g/L，0時(shí)飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L;價(jià)廉易得，分段效果比其他鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r(shí)也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。 第30頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五實(shí)際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和

18、度定為100%或1。鹽析某種蛋白質(zhì)成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100%或1飽和度的百分之幾，即稱為為該蛋白鹽析的飽和度。 第31頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五飽和硫酸銨溶液法 在蛋白質(zhì)溶液的總體不大，要求達(dá)到飽和度在50%以下時(shí)，可選用此方法。在已知鹽析出某各蛋白質(zhì)成分所要過到飽和度時(shí)，可按下列公式計(jì)算出應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的數(shù)量：V0蛋白質(zhì)溶液的原始體積；C2所要達(dá)到硫酸銨飽和度； C1原來(lái)溶液的硫酸銨飽和度； V應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積。 第32頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五固體硫酸銨法 所需達(dá)到的飽和度較高，而蛋白質(zhì)溶液的體積又不能再過

19、分增大時(shí)，采用直接加入固體硫酸銨的方法。欲達(dá)到某到飽和度可按下列公式計(jì)算出應(yīng)加入固體硫酸銨的數(shù)量： X是將1L飽和度為C1溶液提高到飽和度為C2時(shí)，需要加入固體硫酸銨的重量（g）。G和A為常數(shù)，數(shù)值與溫度有關(guān)?，F(xiàn)在已將達(dá)到各種飽和度所需固體硫酸銨的數(shù)量列成表，使用時(shí)不需計(jì)算可直接從表中查出。第33頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法:常用蛋白質(zhì)純度分析及分子量測(cè)定技術(shù)。SDS:十二烷基硫酸鈉（Sodium declecyl Sulfate）破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)瓉?lái)的空間構(gòu)象，特別是在強(qiáng)還原劑如巰基乙

20、醇存在的條件下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS結(jié)合從而形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 第34頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣（約為18，即1.8nm），而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長(zhǎng)度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。使蛋白質(zhì)的電泳遷移率僅僅取決于分子大小這一因素。第35頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在11，700165，000之間時(shí)，電泳

21、遷移率與分子量對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，符合直線方程式：LgMw= bx + k式中：Mw為蛋白質(zhì)分子量，X為電泳遷移率，k和b均為常數(shù)。利用這一關(guān)系將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)作圖即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。第36頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠作為支持電泳介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其孔隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的

22、凝膠成分，使之既有適宜的孔隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一 般說(shuō)來(lái)，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機(jī)械性能適用于分離分子量范圍1萬(wàn)至100萬(wàn)物質(zhì)，1萬(wàn)以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠。 第37頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五連續(xù)體系；不連續(xù)體系 前者指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。 最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein (1964) 和Davis(19

23、64) 設(shè)計(jì)的, 樣品和濃縮膠中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分離膠中含Tris-HCl(pH 8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。 第38頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，孔徑又是灌膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對(duì)濃度的函數(shù)。 515% SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 *丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）1512431016687.536945.057212第39頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五實(shí)驗(yàn)步驟1

24、.蛋清準(zhǔn)備取1枚鮮雞蛋，洗凈擦干，在小頭用鑷子輕輕搗一直徑為4mm的小孔，下用燒杯或量筒接好，再在大頭打一細(xì)小針孔進(jìn)氣，此時(shí)蛋清緩緩自動(dòng)流出。取蛋清的操作應(yīng)很細(xì)致，避免蛋黃破裂混入蛋清而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將所得雞蛋清充分打勻（約15分鐘）。打時(shí)力戒過猛以防止產(chǎn)生泡沫變性作用。然后用4層紗布濾去雜質(zhì)，測(cè)量體積（或體重），記錄pH值。第40頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五2 熱變性取稀鹽酸調(diào)節(jié)雞蛋清pH值 5.5左右（4-7）、70處理15分鐘。離心，去沉淀，保留上清。3 分步鹽析取適量上清，先用1N的氫氧化鈉后用0.1N NaOH溶液調(diào)至pH 8.08.5，加適量飽和硫酸銨溶

25、液（pH 8.0）至飽和度為10%。冰浴放置30min。離心，棄上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul飽和硫酸銨）。第41頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五4 樣品處理取適量沉淀到干凈的eppendorf管內(nèi)，加200ul ddH2O溶解沉淀。加入20ulTCA，顛倒三次，13000rpm離心10min。棄上清。Eppendorf管中加入200ul 丙酮，顛倒三次，13000rpm離心10min。棄上清。待管內(nèi)殘留丙酮揮發(fā)干凈，加入適量loading buffer及ddH2O，沸水浴處理15min，待電泳鑒定。第42頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5

26、月20日，1點(diǎn)29分，星期五5 電泳鑒定上述樣品用濃度12%的SDS分析。注意加入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。6 結(jié)果觀察染色，脫色，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第43頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作：1實(shí)驗(yàn)材料和試劑（1）丙烯酰胺和N, N-亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N-亞甲雙丙烯酰胺的貯存液，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的，故應(yīng)核實(shí)溶液的pH值不超過7.0。這一溶液置棕色瓶中貯存于室溫，每隔幾個(gè)月須重新配制。（2）十二烷基硫酸

27、鈉（SDS）。SDS可用去離子水配成10%（w/v）貯存液保存于室溫。（3）用于制備分離膠和積層膠的Tris緩沖液。第44頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五（4）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)。TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。（5）過硫酸銨。 過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。須新鮮配制。（6）1.5M Tris，pH8.8（分離膠緩沖液）（7）1M Tris，pH6.8（濃縮膠緩沖液）（8）Tris-甘氨酸電泳緩沖液。25mM Tris，250mM 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS，（9）

28、樣品處理液，50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巰基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚藍(lán)，10%甘油（10）染色液：0.1% 考馬斯亮藍(lán) R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脫色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸第45頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五實(shí)驗(yàn)步驟1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制 根據(jù)廠家說(shuō)明書安裝玻璃板。 確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。

29、第46頁(yè)，共55頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期五 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5cm)。再在膠液面上小心注入一層水（約23mm高），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。 分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)