基因工程學(xué)時(shí)

1、基因工程學(xué)時(shí)第1頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二1基因工程概念： 應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（DNA）分離出來(lái)，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組。然后將重組的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個(gè)體，從而改變它們的遺傳品性；或者使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物（多肽或蛋白質(zhì)）。第2頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二2基因工程技術(shù)的一般步驟第3頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二3第一節(jié) 基因工程理論的研究基礎(chǔ)第二節(jié) 基因工程基本技術(shù)路線第三節(jié) 常用的工具酶和載體第四節(jié) 目的基因片段的獲取第五節(jié) 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第

2、六節(jié) 克隆子的篩選和鑒定第4頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二4第一節(jié) 基因工程理論的研究基礎(chǔ)染色體是遺傳物質(zhì)的載體?！盎颉币辉~的創(chuàng)立：1909年，丹麥遺傳學(xué)家約翰遜提出了“基因”（gene）一詞。 “基因型”與“表現(xiàn)型” 術(shù)語(yǔ)，初步闡明基因與性狀的關(guān)系。不過(guò)此時(shí)的基因仍是一個(gè)未經(jīng)證實(shí)，僅靠邏輯推理得出的概念。 第5頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二5基因結(jié)構(gòu)示意圖鏈5鏈3上游 3 5第6頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二6基因工程研究的理論依據(jù)：不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)

3、關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代第7頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二7第二節(jié) 基因工程的一般步驟生物材料RNADNAmRNAcDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)人工合成目的基因克隆載體重組DNA受體細(xì)胞克隆子轉(zhuǎn)基因生物第8頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二8第三節(jié) 常用的工具酶和載體 3.1 工具酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶： (二）DNA連接酶：（三）DNA片段末端修飾酶： (四) DNA聚合酶第9頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二9(一)限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease）（1）限制

4、性核酸內(nèi)切酶定義一類(lèi)以環(huán)形或線形雙鏈DNA為底物，能識(shí)別DNA中特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)，產(chǎn)生具有3OH和5P基團(tuán)DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶。第10頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二10 （2）限制性核酸內(nèi)切酶種類(lèi)I型酶：它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈 II型酶：在其識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開(kāi)DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶 III型酶：它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開(kāi)DNA鏈，并且要求識(shí)別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒(méi)有人將其商業(yè)化。 第11頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，

5、5月20日，12點(diǎn)3分，星期二11根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫(xiě) 該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫(xiě) 該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫(xiě) 有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母、 從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種 限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列 如EcoR是指從大腸桿菌（Escherichia coli）R株分離得到的第一種限制酶。（3）限制性核酸內(nèi)切酶的命名第12頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二12H i n d IIIHaemophilus influenzae d屬名 種名 株名嗜血流感桿菌d株發(fā)現(xiàn)的第三種限制性?xún)?nèi)切酶第13頁(yè)，共26頁(yè)，2022

6、年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二13 （4）限制性?xún)?nèi)切酶作用模式圖：（a) 產(chǎn)生5突出粘性末端(sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHP A A T T C* G*5335P OH第14頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二14 (b） 產(chǎn)生3突出粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*53535335OHP*C T G C A*G5335OHPA C G T C*G*第15頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二15 (c） 產(chǎn)生平末端(blunt end)Alu I*AGCT

7、*TCGA*53535335OHP*AG*TC5335 OHPCT*GA*第16頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二16常用的限制性?xún)?nèi)切酶Rsa I GTAC CATG BamH I GGATC C C CTAGGNot I GCGGCC GC CG CCGGCGEcoR V GATATC CTATAG53第17頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二17(6)常用的酶切方法： 單酶切 雙酶切 部分酶切：底物濃度低，識(shí)別序列的甲基化，酶用量不足，反應(yīng)時(shí)間不夠以及反應(yīng)緩沖液(5)酶切反應(yīng)體系第18頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二18（二

8、）DNA連接酶 DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶。 催化兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3OH、5P連接作用。第19頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二19(1)DNA片段之間的連接（a）具有互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接： T4 DNA連接酶或E.coli DNA連接酶 （b）具有平末端DNA片段之間的連接： T4 DNA連接酶； 第20頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二20（c）DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接： 核酸外切酶：切成平末端 末端轉(zhuǎn)移酶：修飾成互補(bǔ)黏性末端 堿性磷酸酶：將5-P修飾成5-OH（d）DNA片段加連桿后連接 人工合成連

9、桿或銜接頭第21頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二21 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA連接酶（2）作用模式圖：a） 連接粘性末端第22頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二22 b）連接平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*T4 DNA連接酶第23頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二23（三）DNA片段末端修飾酶* 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶： 使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly(A、T、G、C)的粘性末端，通過(guò)DNA連接酶的作用而完成DNA片段和載體間的連接* 核酸外切酶： 切去DNA片段的凸出末端，使成為平末端* 堿性磷酸酶： 為防止DNA片段末端之間的連接，常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5P成為5-OH.第24頁(yè)，共26頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二24（四）DNA聚合酶（1）要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA;（2）必須有模版；（3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA鏈；（4）催化dNTP加到生長(zhǎng)中的DNA鏈的3OH末端，DNA的合成方向是5 3。PCR