免疫組庫高通量測序技術(shù)檢測ALL

1、免疫組庫高通量測序技術(shù)檢測 ALL-MRD 的研究進展【摘要】急性淋巴細胞白血病(ALL)占兒童惡性腫瘤性疾病的首位，盡管兒童ALL治療已 取得很大進展，但復(fù)發(fā)仍是我們面臨的難題。白血病的微小殘留病(MRD)狀態(tài)是復(fù)發(fā)的根 源。研究表明，對患者進行定期MRD檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前臨床上通過實時 定量PCR、流式細胞術(shù)和原位熒光雜交等技術(shù)檢測白血病微小殘留病(MRD)，但是這些技 術(shù)都有各自的局限，導(dǎo)致一定程度的漏檢或假陽性。免疫組庫高通量測序技術(shù)(IR-SEQ)的 高靈敏度和高特異性，能夠更加全面地檢測MRD。本文將對IR-SEQ技術(shù)在檢測ALL-MRD中 的研究進展進行綜述?！娟P(guān)鍵

2、詞】急性淋巴細胞白血?。晃⑿埩舨?；免疫組庫；高通量測序 急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)在兒童所有惡性腫瘤性疾病中占 據(jù)首位，且有逐年增加的趨勢，我國每年約有1.5-2萬名新發(fā)兒童白血病，其中急性淋巴細 胞白血病占80%左右，是小兒時期最常見的白血病類型，發(fā)病高峰年齡為34歲，是嚴重 威脅小兒生命和健康的疾病之一。隨著診療技術(shù)水平的增高，人們對兒童白血病經(jīng)過形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢 測綜合分析(MICM分型)的方法對急性白血病進行了精確的診斷和分型、分層治療使得兒 童 ALL 的診療水平方面得到了質(zhì)的飛躍，但仍有20%30%患

3、兒在緩解后復(fù)發(fā)1-3，這與體 內(nèi)仍存在形態(tài)學(xué)無法檢測的殘留白血病細胞，即微小殘留白血病(minimal residual disease， MRD)有關(guān)。因此，在治療過程中對白血病患者進行定期MRD檢測，具有重要的臨床指導(dǎo) 意義。目前用于臨床評估MRD的技術(shù)包括流式細胞術(shù)(flow cytometry， FCM)、實時定量 PCR (real-time quantification polymerase chain reaction， RQ-PCR)和原位熒光雜交等技術(shù)4, 但是這些技術(shù)都有各自的局限，導(dǎo)致一定程度的漏檢或假陽性，也都無法監(jiān)測治療過程中病 人整體的免疫系統(tǒng)重建情況。免疫組庫測序

4、技術(shù)(immune repertoires sequencing， IR-SEQ) 的高靈敏度和高特異性，能夠更加全面地檢測MRD,在一定程度上彌補傳統(tǒng)方法的不足。1 免疫組庫高通量測序技術(shù)的介紹1.1 高通量測序高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing， HTS)，第二代測序技術(shù)，又被稱為“下一代 測序”(next generation sequencing， NGS)。二代測序技術(shù)具有很高的通量，能夠同時并 行檢測幾十萬到幾百萬的DNA分子6, 7，能夠用來對進行基因組水平的轉(zhuǎn)錄組或者基因組 的分析。二代測序一般采用連接酶或者聚合酶，一般是同步化三磷酸核苷酸的洗

5、脫和同步化 的熒光檢測方法相結(jié)合，采用邊合成邊測序的方法，輸出短的連續(xù)性的DNA片段序列。根 據(jù)測序原理和技術(shù)的不同，主要的技術(shù)平臺包括以下幾種：Roche/454 FLX、Illumina Hiseq系 列和ABI SOLID系列。其中，應(yīng)用做廣泛的，仍然是Hiseq系列。Illumina Hiseq測序技術(shù)其前身是solexa測序技術(shù)，依靠其專利核心技術(shù)DNA簇”和可逆性 末端終結(jié)”技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本制備的自動化和高通量的堿基大規(guī)模平行測序。主要的步驟是 1)將待測的DNA制備成一定大小的DNA片段的文庫，在片段的兩端加上接頭；2)將模板 DNA加到芯片上，進行橋式擴增，形成DNA簇；3)

6、進行邊合成邊測序。邊合成邊測序的核 心的原理是，在合成新的DNA互補鏈時，加入改造后的DNA聚合酶和帶有熒光標記的4種 dNTP，這些dNTP是可逆性終止子”，其3端帶有化學(xué)修飾的部分，未切除掉該修飾時，不 能連接下一個堿基，能夠保證每輪反應(yīng)只連接一個核苷酸。在摻入單個堿基后，用激光掃描 整個芯片，讀取每條模板序列所聚合上的核苷酸種類，之后切除掉末端修飾，摻入下一個堿 基，這樣，統(tǒng)計每個循環(huán)的堿基種類，就得到了所測DNA片段的信息。目前，Hiseq測序技術(shù)的序列讀長已經(jīng)可以達到2x250bp，其讀長受到多種影響熒光信號的 因素影響，例如熒光標記的不完全的切除?？偟膩碚f，Illumina His

7、eq系列具有通量較高、準 確率較高、成本較低、所需要樣本量少、簡單快速等優(yōu)點，是目前最常用的測序平臺。1.2 免疫組庫技術(shù)免疫組庫（immune repertoire, IR）是指，在一個特定時間點，某個樣本的免疫系統(tǒng)中所有 有功能的的T細胞和B細胞的總和，即人體的特異性免疫系統(tǒng)的細胞的總和。免疫組庫測序 技術(shù)（immune repertoires sequencing， IR-SEQ）是用高通量測序的方法研究免疫系統(tǒng)中B細 胞和T細胞的多樣性和特異性的技術(shù)，因此，免疫組庫技術(shù)的主要研究對象仍是BCR和TCR 的CDR區(qū)。由于BCR基因組成的V和J基因種類非常多，因此，需要采用多重PCR的方法

8、對 其進行擴增和捕獲。其原理是在B細胞表面受體的V基因和J基因的保守區(qū)域設(shè)計多重PCR 引物，通過多重PCR技術(shù)擴增B細胞表面受體的互補決定區(qū)CDR3區(qū)域，用高通量測序的方 法，對大量B細胞的CDR3區(qū)進行檢測和識別，以此來研究免疫系統(tǒng)中復(fù)雜多樣的B細胞和 T細胞。2抗原受體基因重排用于MRD檢測早在HTS技術(shù)出現(xiàn)之前，就有很多通過檢測抗原受體基因重排檢測急性淋巴細胞白血病的研 究，應(yīng)用較早還是RQ-PCR的技術(shù)。M Bruggemann等的研究發(fā)現(xiàn)92%的T-ALL中存在克隆性 的TRB基因重排，為TRB基因重排作為T-ALL微小殘留病檢測的分子標記奠定了基礎(chǔ)8。T Flohr等人同樣利用R

9、Q-PCR的技術(shù)，對兒童的急性淋巴細胞白血病的IHG基因和TCR的重排 進行了研究，他們發(fā)現(xiàn)，在B細胞類型的急性淋巴細胞白血病中，83%的病人樣本能夠檢測 到IGH基因的重排9,除此之外，Michael也進行了類似的研究，他們也是采用RQ-PCR的 方法，在43個B-ALL樣品中，有37個樣本檢測到了 V-J的重排，有4個樣本檢測到了 D-J的 不完全重排10，這為后面的高通量測序方法提供了依據(jù)。3高通量免疫組庫測序技術(shù)用于MRD檢測HTS使測定復(fù)雜的適應(yīng)性免疫分子成為可能，免疫組庫測序技術(shù)應(yīng)運而生，并展示了巨大的 優(yōu)勢。該技術(shù)分別在T/B細胞受體的V基因和J （或C）基因區(qū)設(shè)計引物，PCR擴

10、增富集代表 T/B細胞多樣性的CDR3區(qū)域，然后分析測序得到的數(shù)十萬條T/B細胞受體序列的多樣性情況 11-13。 2009 年， Boyd 等用 Immu-Seq 的方法在淋巴細胞增殖性疾?。ㄈ缏粤馨托园籽。?患者的外周血中找到克隆性增殖的抗體重鏈基因（IGH），第一次證明了用免疫組庫高通量 測序的方法檢測MRD的可能性11。2012，Harlan Robins實驗室首先將免疫組庫高通量測序 技術(shù)用于T-ALL MRD的檢測，發(fā)現(xiàn)免疫組庫高通量測序方法的敏感性要高于流式細胞術(shù)，在 白血病殘留細胞的水平低于10-5時仍然可以檢測到，而流式細胞術(shù)只能檢測10-4以上的殘 留14。隨后，免疫組

11、庫高通量測序也被 Malek Faham 等人應(yīng)用于 B-ALL MRD 檢測的研究中， 將ASO-PCR，流式細胞術(shù)和高通量檢測技術(shù)做了對比，三種方式的檢測結(jié)果具有很高的一致 性，并且高通量測序的方法具有更高的分辨率，檢測到更多的致病克隆15， 16。同時，他 們也用同樣的方法驗證了急性淋巴細胞白血病的基因的二次重排的假說，即致病的B細胞在 完成V-D-J基因的重排后，又將原來的V基因用一個新的V基因替換掉，進化出新的致病克 隆，使得白血病細胞的基因和表型有所改變，而這種改變會導(dǎo)致傳統(tǒng)RQ-RCR無法檢測到殘 留的白血病克隆。除了在檢測MRD方面的應(yīng)用外，免疫組庫測序技術(shù)也被用來檢測免疫重

12、建的過程。Aaron C.Logan等人，用高通量免疫組庫測序技術(shù)來檢測用造血干細胞移植的方法 治療的慢性淋巴細胞白血病的病人的免疫重建的過程，他們從診斷時一直檢測到550天以上， 發(fā)現(xiàn)在診斷時，病人的IGH基因圖中中幾乎全部是白血病克隆基因，在治療后56天的時候 白血病克隆的比例已經(jīng)降低，但仍然存在，治療后180天，白血病克隆完全消失， 365天的 時候病人的 IGH 基因圖譜和健康人已經(jīng)完全一樣，預(yù)示著其免疫系統(tǒng)已經(jīng)完全恢復(fù)17；并 且可以通過檢測到的白血病細胞殘留情況預(yù)測預(yù)后效果，預(yù)測結(jié)果與臨床結(jié)果一致18。綜上所述，用免疫組庫高通量測序方法檢測微小殘留疾病，具有以下優(yōu)點：無需針對患者設(shè)

13、 計特異PCR引物或探針，節(jié)省人力、時間等；操作簡便，利于標準化，通量高，穩(wěn)定性好； 靈敏度高，可達到10-5 數(shù)量級以上；檢測整個抗原受體基因組變化情況，不會因為白細胞表 面抗原表達的變化或白血病細胞的進化而漏檢；動態(tài)監(jiān)控患者免疫系統(tǒng)的變化情況及重建情 況，提示預(yù)后效果。參考文獻：Kwiecihska K, Balwierz W, Moryl-Bujakowska A, et al.Long-term observations of children with acute lymphoblastic leukemia and high leukocytosis treated accordi

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