免疫組庫高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ALL

1、免疫組庫高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè) ALL-MRD 的研究進(jìn)展【摘要】急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)占兒童惡性腫瘤性疾病的首位，盡管兒童ALL治療已 取得很大進(jìn)展，但復(fù)發(fā)仍是我們面臨的難題。白血病的微小殘留病(MRD)狀態(tài)是復(fù)發(fā)的根 源。研究表明，對(duì)患者進(jìn)行定期MRD檢測(cè)具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前臨床上通過實(shí)時(shí) 定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和原位熒光雜交等技術(shù)檢測(cè)白血病微小殘留病(MRD)，但是這些技 術(shù)都有各自的局限，導(dǎo)致一定程度的漏檢或假陽性。免疫組庫高通量測(cè)序技術(shù)(IR-SEQ)的 高靈敏度和高特異性，能夠更加全面地檢測(cè)MRD。本文將對(duì)IR-SEQ技術(shù)在檢測(cè)ALL-MRD中 的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。【關(guān)鍵

2、詞】急性淋巴細(xì)胞白血?。晃⑿埩舨。幻庖呓M庫；高通量測(cè)序 急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)在兒童所有惡性腫瘤性疾病中占 據(jù)首位，且有逐年增加的趨勢(shì)，我國每年約有1.5-2萬名新發(fā)兒童白血病，其中急性淋巴細(xì) 胞白血病占80%左右，是小兒時(shí)期最常見的白血病類型，發(fā)病高峰年齡為34歲，是嚴(yán)重 威脅小兒生命和健康的疾病之一。隨著診療技術(shù)水平的增高，人們對(duì)兒童白血病經(jīng)過形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢 測(cè)綜合分析(MICM分型)的方法對(duì)急性白血病進(jìn)行了精確的診斷和分型、分層治療使得兒 童 ALL 的診療水平方面得到了質(zhì)的飛躍，但仍有20%30%患

3、兒在緩解后復(fù)發(fā)1-3，這與體 內(nèi)仍存在形態(tài)學(xué)無法檢測(cè)的殘留白血病細(xì)胞，即微小殘留白血病(minimal residual disease， MRD)有關(guān)。因此，在治療過程中對(duì)白血病患者進(jìn)行定期MRD檢測(cè)，具有重要的臨床指導(dǎo) 意義。目前用于臨床評(píng)估MRD的技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry， FCM)、實(shí)時(shí)定量 PCR (real-time quantification polymerase chain reaction， RQ-PCR)和原位熒光雜交等技術(shù)4, 但是這些技術(shù)都有各自的局限，導(dǎo)致一定程度的漏檢或假陽性，也都無法監(jiān)測(cè)治療過程中病 人整體的免疫系統(tǒng)重建情況。免疫組庫測(cè)序

4、技術(shù)(immune repertoires sequencing， IR-SEQ) 的高靈敏度和高特異性，能夠更加全面地檢測(cè)MRD,在一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。1 免疫組庫高通量測(cè)序技術(shù)的介紹1.1 高通量測(cè)序高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput sequencing， HTS)，第二代測(cè)序技術(shù)，又被稱為“下一代 測(cè)序”(next generation sequencing， NGS)。二代測(cè)序技術(shù)具有很高的通量，能夠同時(shí)并 行檢測(cè)幾十萬到幾百萬的DNA分子6, 7，能夠用來對(duì)進(jìn)行基因組水平的轉(zhuǎn)錄組或者基因組 的分析。二代測(cè)序一般采用連接酶或者聚合酶，一般是同步化三磷酸核苷酸的洗

5、脫和同步化 的熒光檢測(cè)方法相結(jié)合，采用邊合成邊測(cè)序的方法，輸出短的連續(xù)性的DNA片段序列。根 據(jù)測(cè)序原理和技術(shù)的不同，主要的技術(shù)平臺(tái)包括以下幾種：Roche/454 FLX、Illumina Hiseq系 列和ABI SOLID系列。其中，應(yīng)用做廣泛的，仍然是Hiseq系列。Illumina Hiseq測(cè)序技術(shù)其前身是solexa測(cè)序技術(shù)，依靠其專利核心技術(shù)DNA簇”和可逆性 末端終結(jié)”技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本制備的自動(dòng)化和高通量的堿基大規(guī)模平行測(cè)序。主要的步驟是 1)將待測(cè)的DNA制備成一定大小的DNA片段的文庫，在片段的兩端加上接頭；2)將模板 DNA加到芯片上，進(jìn)行橋式擴(kuò)增，形成DNA簇；3)

6、進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。邊合成邊測(cè)序的核 心的原理是，在合成新的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)，加入改造后的DNA聚合酶和帶有熒光標(biāo)記的4種 dNTP，這些dNTP是可逆性終止子”，其3端帶有化學(xué)修飾的部分，未切除掉該修飾時(shí)，不 能連接下一個(gè)堿基，能夠保證每輪反應(yīng)只連接一個(gè)核苷酸。在摻入單個(gè)堿基后，用激光掃描 整個(gè)芯片，讀取每條模板序列所聚合上的核苷酸種類，之后切除掉末端修飾，摻入下一個(gè)堿 基，這樣，統(tǒng)計(jì)每個(gè)循環(huán)的堿基種類，就得到了所測(cè)DNA片段的信息。目前，Hiseq測(cè)序技術(shù)的序列讀長(zhǎng)已經(jīng)可以達(dá)到2x250bp，其讀長(zhǎng)受到多種影響熒光信號(hào)的 因素影響，例如熒光標(biāo)記的不完全的切除?？偟膩碚f，Illumina His

7、eq系列具有通量較高、準(zhǔn) 確率較高、成本較低、所需要樣本量少、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的測(cè)序平臺(tái)。1.2 免疫組庫技術(shù)免疫組庫（immune repertoire, IR）是指，在一個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)，某個(gè)樣本的免疫系統(tǒng)中所有 有功能的的T細(xì)胞和B細(xì)胞的總和，即人體的特異性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的總和。免疫組庫測(cè)序 技術(shù)（immune repertoires sequencing， IR-SEQ）是用高通量測(cè)序的方法研究免疫系統(tǒng)中B細(xì) 胞和T細(xì)胞的多樣性和特異性的技術(shù)，因此，免疫組庫技術(shù)的主要研究對(duì)象仍是BCR和TCR 的CDR區(qū)。由于BCR基因組成的V和J基因種類非常多，因此，需要采用多重PCR的方法

8、對(duì) 其進(jìn)行擴(kuò)增和捕獲。其原理是在B細(xì)胞表面受體的V基因和J基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多重PCR 引物，通過多重PCR技術(shù)擴(kuò)增B細(xì)胞表面受體的互補(bǔ)決定區(qū)CDR3區(qū)域，用高通量測(cè)序的方 法，對(duì)大量B細(xì)胞的CDR3區(qū)進(jìn)行檢測(cè)和識(shí)別，以此來研究免疫系統(tǒng)中復(fù)雜多樣的B細(xì)胞和 T細(xì)胞。2抗原受體基因重排用于MRD檢測(cè)早在HTS技術(shù)出現(xiàn)之前，就有很多通過檢測(cè)抗原受體基因重排檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病的研 究，應(yīng)用較早還是RQ-PCR的技術(shù)。M Bruggemann等的研究發(fā)現(xiàn)92%的T-ALL中存在克隆性 的TRB基因重排，為TRB基因重排作為T-ALL微小殘留病檢測(cè)的分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)8。T Flohr等人同樣利用R

9、Q-PCR的技術(shù)，對(duì)兒童的急性淋巴細(xì)胞白血病的IHG基因和TCR的重排 進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞類型的急性淋巴細(xì)胞白血病中，83%的病人樣本能夠檢測(cè) 到IGH基因的重排9,除此之外，Michael也進(jìn)行了類似的研究，他們也是采用RQ-PCR的 方法，在43個(gè)B-ALL樣品中，有37個(gè)樣本檢測(cè)到了 V-J的重排，有4個(gè)樣本檢測(cè)到了 D-J的 不完全重排10，這為后面的高通量測(cè)序方法提供了依據(jù)。3高通量免疫組庫測(cè)序技術(shù)用于MRD檢測(cè)HTS使測(cè)定復(fù)雜的適應(yīng)性免疫分子成為可能，免疫組庫測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并展示了巨大的 優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)分別在T/B細(xì)胞受體的V基因和J （或C）基因區(qū)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)

10、增富集代表 T/B細(xì)胞多樣性的CDR3區(qū)域，然后分析測(cè)序得到的數(shù)十萬條T/B細(xì)胞受體序列的多樣性情況 11-13。 2009 年， Boyd 等用 Immu-Seq 的方法在淋巴細(xì)胞增殖性疾?。ㄈ缏粤馨托园籽。?患者的外周血中找到克隆性增殖的抗體重鏈基因（IGH），第一次證明了用免疫組庫高通量 測(cè)序的方法檢測(cè)MRD的可能性11。2012，Harlan Robins實(shí)驗(yàn)室首先將免疫組庫高通量測(cè)序 技術(shù)用于T-ALL MRD的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)免疫組庫高通量測(cè)序方法的敏感性要高于流式細(xì)胞術(shù)，在 白血病殘留細(xì)胞的水平低于10-5時(shí)仍然可以檢測(cè)到，而流式細(xì)胞術(shù)只能檢測(cè)10-4以上的殘 留14。隨后，免疫組

11、庫高通量測(cè)序也被 Malek Faham 等人應(yīng)用于 B-ALL MRD 檢測(cè)的研究中， 將ASO-PCR，流式細(xì)胞術(shù)和高通量檢測(cè)技術(shù)做了對(duì)比，三種方式的檢測(cè)結(jié)果具有很高的一致 性，并且高通量測(cè)序的方法具有更高的分辨率，檢測(cè)到更多的致病克隆15， 16。同時(shí)，他 們也用同樣的方法驗(yàn)證了急性淋巴細(xì)胞白血病的基因的二次重排的假說，即致病的B細(xì)胞在 完成V-D-J基因的重排后，又將原來的V基因用一個(gè)新的V基因替換掉，進(jìn)化出新的致病克 隆，使得白血病細(xì)胞的基因和表型有所改變，而這種改變會(huì)導(dǎo)致傳統(tǒng)RQ-RCR無法檢測(cè)到殘 留的白血病克隆。除了在檢測(cè)MRD方面的應(yīng)用外，免疫組庫測(cè)序技術(shù)也被用來檢測(cè)免疫重

12、建的過程。Aaron C.Logan等人，用高通量免疫組庫測(cè)序技術(shù)來檢測(cè)用造血干細(xì)胞移植的方法 治療的慢性淋巴細(xì)胞白血病的病人的免疫重建的過程，他們從診斷時(shí)一直檢測(cè)到550天以上， 發(fā)現(xiàn)在診斷時(shí)，病人的IGH基因圖中中幾乎全部是白血病克隆基因，在治療后56天的時(shí)候 白血病克隆的比例已經(jīng)降低，但仍然存在，治療后180天，白血病克隆完全消失， 365天的 時(shí)候病人的 IGH 基因圖譜和健康人已經(jīng)完全一樣，預(yù)示著其免疫系統(tǒng)已經(jīng)完全恢復(fù)17；并 且可以通過檢測(cè)到的白血病細(xì)胞殘留情況預(yù)測(cè)預(yù)后效果，預(yù)測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)果一致18。綜上所述，用免疫組庫高通量測(cè)序方法檢測(cè)微小殘留疾病，具有以下優(yōu)點(diǎn)：無需針對(duì)患者設(shè)

13、 計(jì)特異PCR引物或探針，節(jié)省人力、時(shí)間等；操作簡(jiǎn)便，利于標(biāo)準(zhǔn)化，通量高，穩(wěn)定性好； 靈敏度高，可達(dá)到10-5 數(shù)量級(jí)以上；檢測(cè)整個(gè)抗原受體基因組變化情況，不會(huì)因?yàn)榘准?xì)胞表 面抗原表達(dá)的變化或白血病細(xì)胞的進(jìn)化而漏檢；動(dòng)態(tài)監(jiān)控患者免疫系統(tǒng)的變化情況及重建情 況，提示預(yù)后效果。參考文獻(xiàn)：Kwiecihska K, Balwierz W, Moryl-Bujakowska A, et al.Long-term observations of children with acute lymphoblastic leukemia and high leukocytosis treated accordi

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