細胞工程資料復習

1、c)生物工程復習c)第一講一、模塊：動植物人工生殖技術、品種培育技術、生物制品技術、干細胞與組織工程。 二、細胞工程Cell engineering是指主要以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細胞、組織產(chǎn)品或型物種的一門綜合性科學技術。三、爭辯對象：動植物細胞原生質(zhì)體，也包括細胞器、染色體、細胞核、胚胎。四、細胞工程爭辯內(nèi)容：四、細胞工程爭辯內(nèi)容：動植物快速生殖：植物組織培育、人工種子、試管動物、克隆動物等。細胞重組與品種培育：細胞水平上的原生質(zhì)體誘變、細胞融合技術；細胞器水平上的細胞重組；染色體水平上的多倍體、單倍體育種等。疫苗、

2、轉(zhuǎn)基因動植物生物反響器等。器官的技術，屬于細胞工程最進展領域之一。植物人工生殖一、1.植物組織培育的理論根底是什么？a)細胞全能性。二、2.植物經(jīng)組織培育的再生途徑有哪兩種？器官發(fā)生途徑：成熟細胞愈傷組織出根出芽完整植株。體細胞胚發(fā)生途徑：成熟細胞分生細胞胚狀體完整植株。c 又叫胚狀體，是指離體培育條件下沒有經(jīng)過受過了胚胎發(fā)育過程。體細胞胚起源于非合子細胞，因此不同于合子胚。三、3.激素在細胞分化中是如何調(diào)整器官分化？生長素主要用來刺激細胞分裂和誘導根的分化。分裂素的生理作用主要是誘導芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長、促進細胞分裂與擴大。多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培育時使用較少或用

3、量較低。四、1。細胞全能性、細胞分化與脫分化細胞全能性(totipotency)：是指分化細胞保存著全部的核基因組，具有生物個體生長、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體的潛能。細胞分化：是指細胞在形態(tài)、構造和功能上發(fā)生差異的過程，包括時間上和空間上的分化。細胞分化的實質(zhì)：是基因的差異表達 Differential，是鋪張基因依據(jù)肯定挨次表達的結(jié)果。脫分化：又稱去分化，是指分化細胞失去特有的構造和功能變獲得分裂力量的過程。五、人工種子 l ：又稱合成種子c 或體細胞種子c )，是指將植物離體培育中產(chǎn)生的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護功能的人工胚乳(Artificial endosper

4、m)和人工種皮(Artificial seed coat)中形成的類似種子的顆粒構造上從外向里包括三局部人工種皮外層保護胚狀體中的水分免于喪失和防止外部力氣沖擊人工胚乳，含有必需的養(yǎng)分成分和某些植物激素胚狀體或芽。動物人工生殖一、1-體外受精動物的培育：精子獲能與卵細胞成熟培育精子獲能(Capacitation)是指精子獲得穿透卵子透亮帶力量的過程。誘導獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。TCM199 培育基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。成熟標志：極體排出、透亮帶軟化、卵丘細胞層集中靠近卵母細胞四周的卵丘細胞呈放射狀排列，消滅放射冠，用 DNA 特意性染料染色后，在顯微鏡下進展核2

5、 次成熟分裂中期。體外受精方法：微鏡下，卵細胞內(nèi)消滅兩個雌雄原核，標志著受精成功。透亮帶修飾法透亮帶下注射法術卵槳內(nèi)精子注射法性別把握的原理與方法XY 流式細胞儀分別法胚胎移植前性別把握二、2-核移植動物的培育：核移植、重組胚的激活細胞核移植可以承受胞質(zhì)內(nèi)注射和透亮帶下注射方法。始狀態(tài)，基因從頭開頭挨次表達。重組胚的發(fā)育需要進一步激活，可以承受電激活和化學激活方法。三、體外受精動物與核移植動物相比各自有什么優(yōu)缺點？體外受精動物：發(fā)揮優(yōu)良母畜的生殖潛力，促進家畜改進的速度，保存遺傳資源。 搶救瀕危動物如大熊貓方面意義重大?？梢杂没颊弑救思毎嘤鼋M織。細胞融合與體細胞雜交一、細胞融合的原理、方法

6、與關鍵環(huán)節(jié)細胞融合Cell fusion是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術。細胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這種有絲分裂只有當兩個核的 DNA 合成根本同步時才能發(fā)生：兩個核同時進展有絲分裂，形成一個紡錘體，全部染色體含有雙親細胞的染色體。細胞融合方法：病毒也隨之進入細胞質(zhì)。化學法：NaNO3pH Ca2+p 離子、聚乙二醇PEG等。細胞膜電荷平衡被打破。物理法：電融合誘導法，原理：在直流電脈沖的刺激下，細胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜瞬間裂開，進而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 需要通過培育和篩選，除去不需要的細胞，分別出需要的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。

7、二、體細胞雜交育種：抑制有性不親和性，實現(xiàn)遠源遺傳重組；多基因把握性狀；細胞質(zhì)遺傳。多倍體與單倍體育種一、多倍體形成的原理與方法概念：多倍體：是指個體細胞中含有超過正常染色體組數(shù)的個體。產(chǎn)生原理：主要是體細胞在有絲分裂的過程中，染色體完成了復制，但是細胞受到外界環(huán)境條件(如溫度驟變)或生物內(nèi)部因素的干擾，紡錘體的形成受到破壞，以致倍的細胞。植物多倍體誘導方法：化學方法：細胞松弛素 B：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞分裂。的細胞中的紡錘絲合成受阻，導致復制后的染色體無法向細胞兩極移動，或發(fā)育期的幼胚為材料。處理方式：秋水仙素一般用水溶液，選擇以下處理方法：浸漬法、涂抹法、棉花球滴漬法、噴

8、霧法、注射法、藥劑培育基法等。倍體后代，經(jīng)常與化學與物理方法結(jié)合使用。動物多倍體誘導方法：裂或抑制精卵的一次卵裂來實現(xiàn)。誘導方法：兩極移動，形成多倍體細胞。溫度休克法，水靜壓法阻擋卵子微絲環(huán)的收縮和極體的分別來實現(xiàn)的，甲氨基嘌呤誘導法生物法二、單倍體定義、特點、純合二倍體培育a)定義：單倍體：細胞中含有正常體細胞的一半染色體數(shù)，即具有配子染色體數(shù)目的個體。II一、影響植物細胞培育生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的因素及調(diào)控方法一、影響植物細胞培育生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的因素及調(diào)控方法影響因素：生物因素：細胞株：穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長速度快的細胞株是細胞大規(guī)模培育生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的前提。來實現(xiàn)。細胞團：造成培育物的培育物的顯著

9、異質(zhì)性，易受剪切力影響，適當大小的細胞團有利于代謝產(chǎn)物積存。題，有利于指導建立優(yōu)化的培育工藝與技術?；瘜W因素：養(yǎng)分鹽，前體，誘導子，反響抑制物理因素：光照、溫度、通氣、攪拌、pH 值工程技術問題：培育液的流變特性，氣體傳遞，攪拌與剪切力，泡沫與器壁外表粘附性調(diào)控方法：培育設備：選擇或設計適宜的生物反響器。培育工藝：誘導子添加、前體喂養(yǎng)、添加競爭途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培育條件培育基、環(huán)境條件優(yōu)化與把握、流加培育。培育技術：固定化培育技術、兩相培育技術、兩步法培育第 1 步細胞生長；2 步產(chǎn)物積存。二、細胞系(Cell line)是由原代培育經(jīng)傳代培育純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的

10、不均一的細胞群體。四、適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程：三、細胞株(Cell strain)是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分別培育或通過篩選的細胞群，亦可稱之為亞株(Substrain)。四、適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程：1.織。愈傷組織形成后，進展繼代培育。2.單細胞分別：選取生長快速而疏松的愈傷組織，通過固體培育基繼代培育，選擇生長快速的細胞。3.細胞無性系的分別：轉(zhuǎn)移到液體培育基中進展懸浮培育，從中選擇分散性好、生長速度快的細胞。4.細胞株篩選：檢測目標產(chǎn)物含量，從3中選擇目標產(chǎn)物含量高的細胞株。5.性能評價：進展較大規(guī)模培育，考察細胞生長與目標產(chǎn)物合成的穩(wěn)定性。6.細

11、胞株獲得：得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株，保種。五、適合大規(guī)模培育的植物細胞系特點：五、適合大規(guī)模培育的植物細胞系特點：1分散性好，適合大規(guī)模懸浮培育。2均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)全都。3生長速度快，培育周期短，不易染菌。4目標產(chǎn)物含量高，簡潔分別提取。5細胞遺傳穩(wěn)定。六、植物細胞培育生產(chǎn)有價值代謝產(chǎn)物的優(yōu)點：六、植物細胞培育生產(chǎn)有價值代謝產(chǎn)物的優(yōu)點：利于資源保護細胞培育不受地理環(huán)境影響利用生物技術提高目標產(chǎn)物含量，實現(xiàn)大規(guī)模培育制備。七、簡述植物細胞固定化培育的優(yōu)點。細胞經(jīng)包埋后使所受的剪切力損傷減小，維持了細胞的穩(wěn)定性，適合脆弱的植物細胞的培育，同時也利于承受傳統(tǒng)生物反響器大規(guī)模培育。懸浮細

12、胞培育體系中細胞密度比較高時會因粘度增加引起傳質(zhì)困難。固定化細胞培育系統(tǒng)中細胞密度遠高于懸浮培育，但并不會轉(zhuǎn)變培育液流體性質(zhì)，利于傳質(zhì)。大多數(shù)植物次級代謝產(chǎn)物合成在生長停頓后才大量合成。承受固定化培育可以將細胞生長與產(chǎn)物合成分成兩個階段。細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產(chǎn)物的積存。固定化增加了細胞與細胞間的接觸，促進了細胞間信息傳遞，利于代謝產(chǎn)物的合成。固定化細胞可以反復使用，可以便利地進展產(chǎn)物的連續(xù)性收獲，降低了本錢。植物組織器官培育制備代謝產(chǎn)物一、1.毛狀根的誘導機制與方法、應用三、植物組織器官、細胞培育制備次級代謝產(chǎn)物的各自優(yōu)缺點Ri(Root inducing)質(zhì)粒。三、植物組織器官、細

13、胞培育制備次級代謝產(chǎn)物的各自優(yōu)缺點方法：外植體接種法莖桿接種法原生質(zhì)體農(nóng)桿菌共培育法應用：黃酮類(flavonoids)生物堿類(alkaloids)蒽醌類(anthraquinones)皂苷類(saponins)苯丙素類(phenyIpropanoids)萜類(terpenoids)二、2.毛狀根培育制備次級代謝產(chǎn)物的影響因素毛狀根誘導率毛狀根發(fā)酵培育技術：一些物理因素(如光強、溫度)和化學因素(如培育基、碳源、氮源、激素、前體、誘導子等)均會對毛狀根的增殖和次生代謝物質(zhì)的合成產(chǎn)生影 響。生物反響器生物合成途徑不清楚四、離體培育的植物細胞存在不穩(wěn)定、目標產(chǎn)物含量低、需要激素等缺乏。因此，分化

14、程度較高、遺傳更穩(wěn)定的植物組織器官培育在有價值次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上呈現(xiàn)了應用潛力。I一、動物細胞體外生長特點a)體外生長的動物細胞一般具有貼附、細胞接觸性抑制、密度抑制的特點。二、動物細胞培育的培育基特點嚴格的無菌技術；培育基：對于養(yǎng)分要求格外苛刻，氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔酶、激素、生長因子等。其他溶液：平衡鹽溶液，培育基 pH 調(diào)整液，細胞消化液，抗生素溶液培育條件：影響動物細胞體外生長的因素包括生物因素、化學因素、物理因素。生長條件的把握主要包括溫度、pH、滲透壓、氣體等。三、動物細胞原代培育方法的培育稱為原代培育y 。方法：組織塊原代培育，細胞原代培育四、動物細胞傳代培育方法

15、傳代培育Passage culture/Subculturing是指將原代培育的細胞連續(xù)轉(zhuǎn)接培育的過程。細胞的體外大量增殖以及細胞系的建立是通過傳代培育實現(xiàn)的。方法：沉降法參加穎培育基后再吹打分散進展傳代。重接種培育。一般承受酶消化法進展傳代培育。五、動物細胞體外培育一般經(jīng)過：組織獲得與消化、接種、原代培育、傳代培育幾個環(huán)節(jié)II一、了解常用的大規(guī)模培育的動物細胞株特點原代細胞、傳代細胞有限細胞系、無限細胞系不具有接觸抑制現(xiàn)象；抱負的藥物生產(chǎn)細胞二倍體細胞、異倍體細胞融合細胞、轉(zhuǎn)化細胞、基因工程細胞貼壁型、非貼壁型二、了解適合動物細胞大規(guī)模培育的生物反響器機械攪拌式：漿葉改造充氣攪拌式：需要改造

16、微載體培育：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培育中空纖維式：解決貼壁、養(yǎng)分氣體有效吸取交換、連續(xù)灌注培育三、重點把握微載體培育技術特點：1.好的生物相容性：無毒無害，有好的黏附性，一般帶正電荷2.大的比外表積：顆粒均勻，孔徑均一3.良好的傳質(zhì)性能4.強的機械性能：重復利用、保護細胞5.好的熱穩(wěn)定性：高壓滅菌球傳球接種技術化性質(zhì)和微載體接觸概率有關。優(yōu)點：1.模擬了體內(nèi)三維生長環(huán)境，減輕了接觸抑制，可以多層生長。2.很好地解決了生物反響器的空間分布問題，單位體積培育液的細胞產(chǎn)率高； 培育系統(tǒng)占地面積和空間小；勞動強度小；放大簡潔，使大規(guī)模培育動物細胞成為可能。3.把懸浮培育和貼壁培育融合在一起，兼有

17、兩者的優(yōu)點；可以稍加改造利用傳統(tǒng)生物反響器。4.接種與收獲便利；可循環(huán)、連續(xù)收獲與培育，培育基利用率較高。四、了解動物細胞培育的影響因素及灌注培育工藝影響因素：1有毒物質(zhì)或抑制因子產(chǎn)生氨：來自培育基+代謝，積聚影響細胞生長。 抑制細胞生長。甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對細胞有潛在的損傷作用。CO2：毒性2養(yǎng)分成分耗盡胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培育基中進展培育時，細胞變得更為脆弱，更簡潔發(fā)生凋亡。3其他物理因素：滲透壓、pH、溫度、載體、攪拌等改進方法：1.分批培育2.流加培育3.連續(xù)培育4.連續(xù)灌注培：優(yōu)點：1.削減細胞調(diào)亡1可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代謝物質(zhì)

18、。2保證養(yǎng)分供給。2.連續(xù)性收獲產(chǎn)品五、細胞系(Cell line)是由原代培育經(jīng)傳代培育純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。第一次傳代培育后的細胞即稱之為細胞系。六、細胞株(Cell strain)是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分別培育或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。七、動物細胞貼壁生長的主要環(huán)節(jié)有哪些？1.游離期：接種的細胞在培育液中呈懸浮態(tài)。2.24 小時內(nèi)貼壁。3生殖期：懸浮細胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開頭分裂。隨著細胞數(shù)量的增多，細胞間開頭接觸并連接成片。消滅接觸性抑制。4. 退化期：細胞長滿載體外表，隨著養(yǎng)分物的消耗和代謝物

19、的積存，密度抑制現(xiàn)象消滅，細胞開頭退化。如不準時傳代培育，細胞脫落死亡。動物細胞生物制藥應用一、雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的制備原理與技術流程：將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長期生殖 通稱為雜交瘤技術a 。技術流程：動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備骨髓瘤細胞的獲得與培育細胞融合融合細胞的篩選：HAT 培育基篩選法，融合細胞：具有親代雙方的遺傳性能，HPRT TK ，因此可利用培育基中的嘌呤與嘧啶承受DNAHAT 培育基中存活與生殖?？寺』嘤置诳贵w的融合細胞的篩選單克隆抗體的大量生產(chǎn)二、動物細胞大規(guī)模培育生產(chǎn)藥物存在問題與進展方向：1細胞密度低，產(chǎn)物濃度低。2大規(guī)模、

20、長時間培育過程中分泌產(chǎn)物力量易喪失，或產(chǎn)物活性易降低。3動物細胞培育基、培育設備以及培育用微載體很昂貴。因此大多僅能在小規(guī)典范圍內(nèi)爭辯，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。4目前對細胞代謝和生長動力學的爭辯比較欠缺。5在線監(jiān)測水平技術不完善，限制了優(yōu)良培育系統(tǒng)的開發(fā)。轉(zhuǎn)基因生物反響器一、基因工程動物細胞構建技術、高效表達異源蛋白的策略：c 利用細胞增殖或者動植物代謝制備外源基因的表達產(chǎn)物的技術。轉(zhuǎn)基因方法：電穿孔法，脂質(zhì)體載體包埋法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法目標蛋白高效表達策略：氨甲喋呤Mtx是動物細胞關鍵代謝酶二氫葉酸復原酶DHFR的抑制劑，細胞經(jīng)過氨甲蝶呤處理后存活下來的細胞中 dhfr 基因得以擴增，提高二氫葉酸復原

21、酶的表達水平，抵消氨甲蝶呤的抑制作用，與該基因相鄰的染色體片段同樣擴增。二、問題 2：乳腺生物反響器制作的關鍵是什么？使用適宜的乳汁蛋白基因調(diào)控元件，構建合理有效的乳腺組織特異性表達載體。目前應用于乳腺特異性表達載體構建的乳蛋白基因及調(diào)控序列的主要有：乳清酸蛋白(WAP基因及其調(diào)控序列。酪蛋白(Icasein)基因及其調(diào)控序列。 -乳球蛋白( -lactoglobulin)基因及其調(diào)控序列。乳白蛋白( -lactalbumin )基因及其調(diào)控序列。微藻培育與代謝產(chǎn)物生產(chǎn)一、1.微藻培育的光生物反響器特點概念：微藻Microalgae一般是指那些在顯微鏡下才能區(qū)分形態(tài)微小的藻類。光生物反響器Ph

22、otobioreactor是設計有光源系統(tǒng)的主體為透亮材料的生物反響器，主要用于可進展光合作用的微藻、植物細胞、光合細菌的培育。優(yōu)點：培育密度高，收獲效率也顯著提高。培育條件易于把握，易于實現(xiàn)高密度培育，對代謝產(chǎn)物積存有利。無污染，可實現(xiàn)純種培育。不受地域環(huán)境限制，生產(chǎn)期長。適合于全部微藻的光自養(yǎng)培育，尤其適合于微藻代謝產(chǎn)物產(chǎn)品的生產(chǎn)。二、2.微藻培育生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的相關工藝技術藻類生物柴油 -胡蘿卜素干細胞一、干細胞誘導分化方法化學試劑誘導法，視黃酸，維甲酸，維生素 C 等。細胞因子誘導法：基因調(diào)控法：二、胚胎干細胞：1.胚胎干細胞優(yōu)點：無限的分化潛能2.胚胎干細胞問題來源限制：人類胚胎干細胞爭辯存在細胞來源限制問題?；€不成熟。體移植仍能引起免疫排斥反響。倫理道德問題：獵取人的胚胎干細胞、建立胚胎干細胞系必需要破壞胚囊，體道德問題。三、成體干細胞：1.成體干細胞優(yōu)點：1來源便利：可以從自身獲得。2沒有倫理學問題：成體干細胞來自成熟個體，不會損傷供體。3避開免疫排斥反響：同種異體胚胎干細胞及其分化細胞用于臨床會引起細胞，但是克隆技術的不成熟限制了目前的應用。4比較安全：雖然胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但目前還不能完全把握胚胎干細胞的定向分化，簡潔導致畸胎瘤。相對而言，成體干細胞比較安全。成體干細胞問題：1由于成體干