齊全版(熒光PCR技術(shù))課件

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)一、熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。與普通PCR的區(qū)別（一）普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。起始定量與終點(diǎn)定量起始DNA量是“天然”的量，更有意義；終點(diǎn)DNA量是經(jīng)過PCR“加工”，存在部分失真起點(diǎn)定量重現(xiàn)性好；終點(diǎn)定量誤差大由于PCR擴(kuò)增效率的差異使得相同的樣品擴(kuò)增結(jié)果存在很大的差異相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time PCR)應(yīng)用方法：通過熒光染料或

2、熒光標(biāo)記的特異性探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖擴(kuò)增曲線的描述PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸對(duì)合成反應(yīng)的

3、阻害等原因，致使PCR并非一直呈指數(shù)擴(kuò)增，而最終將進(jìn)入平臺(tái)期。熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此應(yīng)選擇這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 幾個(gè)定義線性基線期為擴(kuò)展最初的1015個(gè)循環(huán)，此時(shí)，PCR反應(yīng)處于起始階段，擴(kuò)增產(chǎn)物很少，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)很低

4、。什么是熒光域值（threshold）PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即： threshold = 10 SDcycle 3-15 幾個(gè)定義定量的分類絕對(duì)定量方法：絕對(duì)定量方法相對(duì)簡(jiǎn)單。絕對(duì)定量是使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知濃度的樣本進(jìn)行絕對(duì)量（拷貝數(shù)）測(cè)定的方法。相對(duì)定量方法：相對(duì)定量方法相對(duì)復(fù)雜，一般用于基因表達(dá)解釋。首先應(yīng)分別測(cè)定目的基因和參比基因的量，再求出對(duì)應(yīng)參比基因的目的基因的相對(duì)量，最后再進(jìn)行樣品間相對(duì)量的比較。每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以用下式表示定量PCR的數(shù)學(xué)原理y=x(1+e)ny

5、：產(chǎn)物分子數(shù) x：起始分子數(shù)e：擴(kuò)增效率 n：循環(huán)次數(shù) 內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman探針 Taqman MGB 探針二、熒光定量PCR標(biāo)記檢測(cè)類型熒光嵌合檢測(cè)法原理融解曲線：采用SYBR Green I熒光嵌合法檢測(cè)時(shí)，可以通過融解曲線分析，確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性。溶解曲線分析是在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液的溫度漸漸升高，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化進(jìn)行的。起初由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈雙鏈，具有較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度，隨著溫度的漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA中的SYBR Green I數(shù)量減少，熒光信號(hào)強(qiáng)度就漸漸降低，當(dāng)雙鏈DNA解

6、鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度即融解溫度（Tm值），Tm值與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列有關(guān)，對(duì)于某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。融解曲線的分析理想的融解曲線應(yīng)該只有單一峰型曲線。如果出現(xiàn)兩個(gè)或以上的峰型，說明有引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，需要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化或重新設(shè)計(jì)引物。優(yōu)點(diǎn)：成本較低，無須對(duì)引物或探針進(jìn)行特殊的熒光標(biāo)記，操作亦比較簡(jiǎn)單 ，適合于篩檢。缺點(diǎn)：特異性不夠，染料分子會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高 （SYBR Green I）標(biāo)記的優(yōu)、缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光PCR的理論基礎(chǔ)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)與一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)

7、（可以淬滅前者的發(fā)射光譜）的距離鄰近至一定范圍時(shí)，就會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅基因會(huì)吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開，淬滅作用即會(huì)消失。所以，利用核酸雜交和核酸水解所致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)結(jié)合或分開的原理，建立各種實(shí)時(shí)熒光PCR。TaqMan Probe法TaqMan Probe法是使用5端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA等）的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5端的熒光物質(zhì)受到3端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5端的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來，發(fā)出熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)液

8、中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板雜交，進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的，具體原理如下圖：TaqMan Probe法原理TaqMan探針?biāo)庑?.熒光素，淬滅劑2.FRET（熒光共振能量傳遞）3.識(shí)別特異性產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列特異性高缺點(diǎn)1.只適用于一個(gè)目標(biāo)（特異序列）2.價(jià)格較高（1000-2000元）3.探針5端不能是G（切下后淬滅）熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)方式總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑主要應(yīng)用范圍SYBR Green I結(jié)合

9、于雙鏈DNA的小溝中否熔解曲線分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因TaqMan水解型雜交探針（5-3外切）有SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因TaqMan MGB 探針法原理在TaqMan探針的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了MGB探針。在它的3端連接的不是通常的TAMRA淬滅基團(tuán)，而是一種非熒光淬滅劑（NFQ），其3還有一種小溝結(jié)合分子，即MGB探針，該分子折疊進(jìn)入dsDNA小溝，從而使探針和模板緊緊結(jié)合。MGB探針在檢測(cè)SNP和定量分析甲基化等位基因方面具有優(yōu)勢(shì)。TaqMan MGB 探針法TaqMan MGB 探針能分辨一個(gè)堿基的差別TaqMan MGB 探針法原理圖示優(yōu)點(diǎn)：1.NFQ為非熒光基團(tuán)，大大降低測(cè)定中熒光的

10、本底值，有提高了淬滅效率。2.MGB結(jié)合在探針與靶基因雜交形成的雙螺旋的小溝中，促進(jìn)探針與靶基因雜交的穩(wěn)定性和特異性，又使探針的Tm值大大提高，從而使雜交溫度的選擇余地更大。缺點(diǎn)：1.合成TaqMan探針價(jià)格昂貴。（一條探針約30005000元）2.中國(guó)地區(qū)僅有基康生物公司（ABI）提供合成服務(wù)，合成時(shí)間長(zhǎng)，周期需要12個(gè)月.與TaqMan探針相比，MGB探針長(zhǎng)度更短，淬滅效率更高。案例分析1.應(yīng)用SYBR Green I 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成蚊攜帶的登革病毒。2. 應(yīng)用TaqMan探針技術(shù)進(jìn)行SNP分析應(yīng)用SYBR Green I 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成蚊攜帶的登革病毒。1.對(duì)成蚊與標(biāo)

11、準(zhǔn)品進(jìn)行前處理，提取RNA2.將成蚊樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的RNA逆轉(zhuǎn)錄成CDNA3.使用一系列稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品CDNA作為模板，通過SYBR Green I 熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.以成蚊樣品的CDNA為模板，應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)其Ct值。SYBR Green I熒光PCR實(shí)驗(yàn)材料：1.一對(duì)特異性引物（1530bp）（約4060元）2. SYBR Premix EX Taq II 試劑盒（mix）（大連寶生物價(jià)格：1700元，50ul規(guī)格200次反應(yīng)）3.CDNA模板（標(biāo)準(zhǔn)品，成蚊樣品）X0=(1+Ex) *Ct+YTaqMan探針技術(shù)進(jìn)行SNP分析SNP（單核苷酸多態(tài)性）1.人類基因組中的單堿基突變2.大約93%的基因至少含有一個(gè)SNPSNP分型的意義1.可能引起疾病或疾病的易感性2.作為基因缺陷型疾病的標(biāo)志物3.SNP的漂變可作為進(jìn)化研究手段4.藥物的抗藥性研究CYP2D6細(xì)胞色素P450酶家族成員負(fù)責(zé)大約20普通藥物代謝在人類中該基因序列變異較多TaqMan熒光PCR實(shí)驗(yàn)材料：1.一對(duì)特異性引物（1530bp）2.兩條熒光探針（每條探針，2OD,約10002000元）2. Premix EX Taq 試劑盒（mix）（大連寶生物價(jià)格：2000元，50ul規(guī)格200次反應(yīng)）3.CDNA模板實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因