【生物醫(yī)學(xué)】治療性血管新生實(shí)驗(yàn)研究的若干進(jìn)展-復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系金惠銘教授

1、治療性血管新生實(shí)驗(yàn)研究的假設(shè)干進(jìn)展金 惠 銘復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系 上海 200032，中國(guó)治療性血管新生實(shí)驗(yàn)研究的假設(shè)干進(jìn)展治療性血管新生的概念及現(xiàn)況血管新生旁觀分子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的雙相調(diào)節(jié)三. 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體活性的動(dòng)態(tài)變化四. 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞 治療性血管新生的 概念及現(xiàn)況Therapeutic Angiogenesis治療性血管新生 將外源性血管新生誘導(dǎo)因子導(dǎo)入缺血組織，增強(qiáng)缺血區(qū)毛細(xì)血管新生，從而加速側(cè)枝循環(huán)的形成。 主要用于治療缺血性(心血管)疾病。Folkman, J 肌肉注射 局部灌注A.V.滴注 滲透泵心腔外注入 病毒載體介導(dǎo) 局部

2、注射 基因埋線 基因治療 脂質(zhì)介導(dǎo) 球囊導(dǎo)管導(dǎo)入 轉(zhuǎn)化細(xì)胞包被應(yīng)用 質(zhì)粒DNA介導(dǎo) 冠脈內(nèi)支架 蛋白治療VEGF治療細(xì)胞治療治療性血管新生常用的方法細(xì)胞鋪路Cellular Spreading分子搭橋Molecular Bridging Folkman JFrom the lab to the clinic: one investigators journeyJ Law, Medicine & Ethics 2002, 30(3): 361366從實(shí)驗(yàn)室到臨床:一位科學(xué)家的旅行一.血管新生旁觀分子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響B(tài)ystander molecules(血管新生) 旁觀分子COX-2，PGE

3、2，Integrins，etc.bEnd.3 (200 )經(jīng)典途徑bFGF-induced proliferation of bEnd.3 (MTT) -actinEffect of bFGF on COX-2 protein expression in bEnd.3 (Western Blot)COX-2 0 4 8 16 32 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Control bFGFEffect of bFGF(10ng/ml) on COX2 protein expression in bEnd.3 (8h,ABCmethod,400X) GAP

4、DH COX-1 COX-20 1 2 3 6 12 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Effect of bFGF on COX mRNA expression in bEnd.3 (RT-PCR) bFGF-induced PGE2 secretion of bEnd.3 & effect of COX-2 inhibitor on it (ELISA)Effects of COX-2 inhibitor and PGE2R antagonist on bFGF-induced VEGF secretion in bEnd.3bFGFEC增殖VEGF

5、COX-2PGE2bFGF引起EC多途徑增殖經(jīng)典途徑 旁路 途 徑 信號(hào)轉(zhuǎn)換bFGF非特異性 EC特異性VEGF二.生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的雙相調(diào)節(jié)EC劃痕損傷模型EC scratch wound model 研究: 細(xì)胞遷移 ( cell migration) Dynamic changes of cell migration induced by bFGF in cultured bEnd.3 Left: bFGF (5g/L) Center: control Right: bFGF (15 g/L)0h24h48h內(nèi)皮細(xì)胞體外劃痕損傷模型中bFGF對(duì)細(xì)胞遷移的影響Focal Adhesi

6、on Kinase粘著斑激酶FAKFAKNBand 4.1Kinase DomainFGFCPhosphorylation FAK Tyr-397F.A.TY397Activitied FAKPGrowth Factor Receptor PTKsPro-1Pro-2FAKRasRafMEKERKCrkSOSSrcPaxillinCASGrb2PWAVE/ScarDOCK180RacPakASAGRAFMigrationGTPaseFAK含量051015(g/L)bFGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中FAK含量的影響 (Western Blot, 12h)bFGF*P0.05*FAK活性 051015(g/

7、ml)bFGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中FAK活性的影響 (12h)* P0.050h6h12h510bp(FAK)510bp(FAK)510bp(FAK)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)og./L bFGF 2. 5g/L 3. 10g/L 4. 15g/L bFGF對(duì)FAK mRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體活性的動(dòng)態(tài)變化三.VEGF受體(Flk-1)在心肌梗死大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá) (免疫組化，ABC法 400)A. 梗死區(qū) B. 梗死邊緣 C. 非梗死區(qū) D. 對(duì)照心肌ABCDExpression changes of bFGF

8、R1 after rat acute myocardial infarction (Real-time RT-PCR, n=5)*#*#*#*#*#*#*/GEArrayTM Q series Mouse Angiogenesis Gene Array小鼠血管新生基因芯片(Super Array, U.S.A.)非梗死區(qū)邊緣區(qū)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)血管新生基因表達(dá)的變化 (Micro-array)心肌梗死大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生誘導(dǎo)因子受體基因表達(dá)的變化 (1W)PositionGenebankGene nameControlExperiment14NM_010109Ephrin A r

9、eceptor1.474E-12.170E-217NM_007912EGFR-0.000E-1-0.000E-129M33760FGFR10.004E-12.773E-430M81342FGFR38.731E-39.014E-431NM_008011FGFR42.816E+03.077E+033X59397Flk-1/KDR1.199E+01.049E+034L07297Flt-1-0.000E-12.773E-359NM_011058pDGFR-0.000E-12.982E-360NM_008809pDGFR-0.000E-15.055E-276D13738Tie-2-0.000E-19.0

10、14E-481D28526TGFR1-0.000E-10.000E+082NM_009371TGFR22.834E-11.907E-2四.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cell)磁性活化細(xì)胞分選系統(tǒng)Magnetic activated Cell-sorting system (MACS) MicroBeads: 50nm 用MACS 別離臍血中CD133+ 細(xì)胞模式圖經(jīng)磁珠別離的CD133+細(xì)胞培養(yǎng)14d后細(xì)胞外表分子標(biāo)志CD133流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果 (A:0d B:14d)ABDecrease of cell markers CD133, CD34 on ad

11、herent cells and increase of Flk-1 in the presence of VEGF, bFGF and SCF after 14 days of culture (P0.05).干細(xì)胞血管內(nèi)皮祖細(xì)胞造血干細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，造血干細(xì)胞循環(huán)CD34+內(nèi)皮祖細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞CD34+, Flk-1+內(nèi)皮祖細(xì)胞CD34+, Flk-1+,AC133 +培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞CD34+, Flk-1+,AC133本課題受國(guó)家“十五“211工程重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)基金資 助參加本課題的研究人員樂 飛 張國(guó)平 王新紅 梁光波 張 威 史連國(guó) 曲曉義 錢睿哲Thanks！Thanks！Angiogenesis inducible factors: VEGF etc. To stimulate prol