人民醫(yī)院基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室肺炎支原體核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、人民醫(yī)院基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室肺炎支原體核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序項(xiàng)目名稱肺炎支原體核酸定量檢測(cè)檢驗(yàn)方法名稱T叫Man熒光定量檢測(cè)方法學(xué)原理用一對(duì)肺炎支原體特異性引物和一條肺炎支原體特異性熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)(Q)。探針完整時(shí)，R基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使R熒光基團(tuán)和Q熒光基團(tuán)分離，Q基團(tuán)對(duì)R基團(tuán)的抑制吸收作用消失，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)就可接收到R基團(tuán)的熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成。被切割產(chǎn)生的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例，這樣就實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)

2、物形成完全同步。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。標(biāo)本要求適用標(biāo)本類型：痰液、咽拭子等。標(biāo)本采集（泌尿生殖道分泌物）a）痰液使用一次性吸痰器，患兒取仰頭平臥位，將吸痰管緩緩插入咽喉部，調(diào)節(jié)負(fù)壓，將氣管深部分泌物（在霧化吸入后效果較好）緩緩吸入儲(chǔ)液瓶中，反復(fù)數(shù)次，儲(chǔ)液瓶中分泌物即為標(biāo)本，密封送檢。a）咽拭子用咽拭子取咽部分泌物（多數(shù)會(huì)有粘稠的痰液），將咽拭子置入無菌玻璃管，密封送檢。標(biāo)本保存：標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可以保存于-20待測(cè)，保存期為6個(gè)月。試劑名稱：肺炎支原體核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）生產(chǎn)廠家：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；試劑貨號(hào)：#DA-B06

3、4；包裝規(guī)格：20人份/盒；試劑成份：組成部分?jǐn)?shù)量DNA提取液（5001/管）2管MPPCR反應(yīng)液（400/管）2管T叫酶（60皿管）1管MP陰性質(zhì)控品（50皿管）1管組成部分?jǐn)?shù)量MP強(qiáng)陽性質(zhì)控品（50皿管）1管MP弱陽性質(zhì)控品（50皿管）1管MP陽性定量參考品（1.0義105基因拷貝/ml）10皿管1管MP陽性定量參考品（1.0義106基因拷貝/ml）10皿管1管MP陽性定量參考品（1.0義107基因拷貝/ml）10皿管1管MP陽性定量參考品（1.0義108基因拷貝/ml）10皿管1管5.6試劑儲(chǔ)存條件：保存于20，有效期6個(gè)月。儀器ABI7500全自動(dòng)基因擴(kuò)增檢測(cè)儀操作步驟DNA提取陰性質(zhì)

4、控品處理a）向陰性質(zhì)控品管中加入等量DNA提取液充分混勻，100恒溫處理101分鐘；b）12000r/min離心5min,備用。標(biāo)本處理痰液a）痰液中加入4倍體積的生理鹽水，用1ml的槍頭反復(fù)吹打后置4冰箱過夜，使痰液充分液化；b）用槍頭或吸管混勻后吸取1ml至1.5ml離心管中，12,000rpm離心5分鐘；c）去上清，沉淀中加入mDNA提取液充分混勻，100恒溫處理101分鐘；d）12,000rpm離心5分鐘，備用。咽拭子a）向玻璃管中加入1.5ml滅菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，立即離心；或置4冰箱過夜；b）12,000rpm離心5分鐘，沉淀加滅菌生理鹽水1ml混勻，12,000

5、rpm離心5分鐘；以下步驟同7.1.2.1步驟c、doMP弱陽性質(zhì)控品處理（同陰性質(zhì)控品）；MP強(qiáng)陽性質(zhì)控品處理（同陰性質(zhì)控品）；MP陽性定量參考品處理：8000rpm離心數(shù)秒，備用；PCR擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作）：按比例（MPPCR反應(yīng)液401/人份+T叫酶31/人份）取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43皿管分裝至0.2ml離心管中備用。加口樣：向準(zhǔn)備好試劑的0.2ml離心管中，分別加入處理后的樣品（包括樣本、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品）上清液2可，或直接加入陽性定量參考品2可，8000rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。設(shè)置PCR循環(huán)擴(kuò)增程序如下932分鐘預(yù)

6、變性；9345秒5560秒10個(gè)循環(huán)9330秒5545秒30個(gè)循環(huán)陰性結(jié)果判定：如果增長(zhǎng)曲線不呈S型或Ct值=30,則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為樣品的UUDNA總含量小于檢測(cè)極限。陽性結(jié)果判定：如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且Ct值30,則：a）若樣品的QtyW1X108,則痰液標(biāo)本的MPDNA含量二Qty/4基因拷貝/ml,咽拭子標(biāo)本的MPDNA含量二Qty/20基因拷貝/ml;b）若實(shí)驗(yàn)結(jié)果，樣品的Qty1X108,則痰液標(biāo)本的MPDNA含量為2.5義107基因拷貝/ml,咽拭子標(biāo)本的MPDNA含量5X106基因拷貝/ml。如果需要精確定量結(jié)果，可將提取后的樣品稀釋100倍再檢測(cè)。c）若樣品的Qty1X104,

7、則痰液標(biāo)本的MPDNA含量2.5X103基因拷貝/ml,咽拭子標(biāo)本的MPDNA含量500基因拷貝/ml;質(zhì)控a）陰性質(zhì)控品：全部陰性;b）陽性質(zhì)控品：全部陽性,且強(qiáng)陽性質(zhì)控品檢測(cè)值允許范圍在2.5X106基因拷貝/ml4.0X107基因拷貝/ml范圍，弱陽性質(zhì)控品定量參考值在2.5X104基因拷貝/ml4.0X105基因拷貝/ml范圍；（參考值為儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的數(shù)值）；c）陽性定量參考品：均為陽性，且線性相關(guān)系數(shù)0.97W|rW1；d）以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足,否則,本次實(shí)驗(yàn)無效,需重新進(jìn)行。0參考范圍低于檢測(cè)下限1性能指標(biāo)靈敏度：1.0X104基因拷貝/ml線性范圍：1.0X10

8、4基因拷貝/ml1.0X108基因拷貝/ml臨床意義肺炎支原體是呼吸道感染較常見的致病菌，近幾年有增加趨勢(shì)，感染后除引起以往認(rèn)為的非典型肺炎外，還可引起肺外各系統(tǒng)改變，且有死亡病例報(bào)道。采用PCR方法檢測(cè)肺炎支原體DNA,可早期、快速、準(zhǔn)確、敏感地診斷肺炎支原體感染。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；為試劑和標(biāo)本制備階段提供生物安全柜，實(shí)驗(yàn)過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；對(duì)每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制；試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；自備滅菌生理鹽水；標(biāo)本處理時(shí)“去上清”步驟，注意吸頭不要碰觸沉淀；試劑盒DNA提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時(shí)需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截；標(biāo)本制備區(qū)所用過的吸頭請(qǐng)打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；實(shí)驗(yàn)完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；所有檢測(cè)樣品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則和醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例。中華人民共