蕁麻提取物對5α還原酶抑制活性的研究

1、蕁麻提取物對5-復(fù)原酶抑制活性的研究【摘要】目的研究蕁麻提取物中水溶性成分的5a-復(fù)原酶抑制活性。方法基于熒光測定的方法，建立一種5a-復(fù)原酶抑制劑體外模型，從大鼠前列腺組織中提取5-復(fù)原粗酶,與底物睪酮Teststerne以及供氫體復(fù)原型輔酶NADPH共同組成了一種微量反響體系。利用熒光測定儀檢測NADPH的含量，以熒光的強(qiáng)弱來判斷5a-復(fù)原酶的活性，以非那雄胺作為陽性對照。結(jié)果同對照組相比，反響體系中參加蕁麻提取物后熒光值有顯著升高。結(jié)論蕁麻根的水溶性成分在體外可以抑制5a-復(fù)原酶的活性。【關(guān)鍵詞】5-復(fù)原酶蕁麻雙氫睪酮前列腺增生Abstrat:bjetiveTstudythe5-redu

2、taseinhibitryativityftheaqueusnstituentsinUrtiafissaE.Pritzsetrat.ethdsThe5-redutaseinhibitrsdelinvitrinludedaini-reativesystehihaspsedf5-redutaseextratedfrtheprstatesfalerats,teststerne(asasubstrate)andNADPH(asahydrgensupplier).ThenentratinfNADPHaseasuredbytheflureseneexaininatin.Thespeifiityf5-red

3、utaseasjudgedithfinasterideasapsitiventrl.ResultsTheabsrbanefflureseneinthereativesystehihasaddediththeextratfUrtiafissaE.Pritzasrearkablyhigherthanthereferenegrup.nlusinTheUrtiafissaE.Pritzsaqueusextrataninhibittheativityfthe5-redutaseinvitr.Keyrds:5-redutase；UrtiafissaE.Pritz；Dihydrteststerne(DHT)

4、；BenigePrstatiHyperplasia(BPH)良性前列腺增生癥(BPH)是中老年男性常見病與多發(fā)病，發(fā)病率在40歲時(shí)約為23%，至90歲時(shí)可達(dá)88%。在尋找其治療藥物過程中，甾體5-復(fù)原酶抑制劑已成為研究熱點(diǎn)之一1。從構(gòu)效關(guān)系看，5-復(fù)原酶是定位于靶細(xì)胞微粒體上的膜蛋白,依賴復(fù)原型輔酶II(NADPH)作為供氫體，該酶廣泛存在于前列腺及其它組織和器官中，是睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)殡p氫睪酮的催化劑2，它不可逆地催化睪丸酮(T)轉(zhuǎn)為生理活性更強(qiáng)的雙氫睪丸酮(DHT)，DHT被認(rèn)為是良性前列腺增生癥(BPH)的主要病因,抑制該酶活性,減少DHT生成，已經(jīng)成為BPH非手術(shù)治療的主要途徑3。我們前期的藥

5、理實(shí)驗(yàn)說明，蕁麻根的提取物對去勢大鼠前列腺腹側(cè)葉和背側(cè)葉的增生具有顯著的抑制作用4。為了進(jìn)一步研究提取物抗前列腺增生的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)選取5-復(fù)原酶為作用靶點(diǎn)，利用熒光測定的方法，研究蕁麻提取物是否有抑制5-復(fù)原酶的活性。首先建立酶催化反響體系，利用輔酶NADPH具有自發(fā)熒光特性NADPH本身有強(qiáng)烈熒光，當(dāng)NADPH與復(fù)原酶和底物反響后，NADPH生成NADP+,熒光隨之淬滅通過熒光檢測儀測定NADPH的含量來考察5-復(fù)原酶的活性5。1材料與儀器1.1藥品與試劑非那雄胺(保列治),erkSharpDhe(U.K.)Ltd。批號J20220221；睪酮，上海久邦化工公司產(chǎn)品，批號20221106

6、；NADPH，Bisharp公司產(chǎn)品，批號041939；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2儀器熒光檢測儀型號：FP-6500，Jas公司；臺式高速冷凍離心機(jī)型號:Bifugeprie，RHeraeus公司；ALPHA1-4型冷凍枯燥機(jī)HRIST公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋型號：HH-2，常州國華電器公司。2方法2.1復(fù)原酶的制備6雄性SD大鼠3只體重(200g10)g大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，禁食不禁水過夜后處死，迅速取腹側(cè)的前列腺組織在冰臺上剪碎，用預(yù)冷的勻漿液(蔗糖0.73l/L，氯化鈣1.91l/L)在玻璃勻漿器中勻漿7，在4下以10000r/in高速離心20in，取上清液再以16000r/

7、in低溫高速離心30in，即為5-復(fù)原酶提取物，采用Lry法測定蛋白含量，以酶提取物中的總蛋白含量表示5-復(fù)原酶提取物的含量，將提取物放入小離心管在-70下保存，臨用前取出。2.25-復(fù)原酶活性測定和反響條件優(yōu)化取5.0l的小試管，將底物、酶提取液,輔酶等反響成分依次參加，然后參加緩沖液PBS2.0l/L,蔗糖0.2l/L,EDTANa21.0l/L,pH6.8至2l，在37下反響1h。然后用熒光檢測儀測定反響體系的熒光值。為了獲得最正確酶活性測定反響參數(shù)，對反響溫度、底物、酶的濃度以及反響時(shí)間的反響條件進(jìn)展優(yōu)化，同時(shí)以特異性5-復(fù)原酶抑制劑非那雄胺8,9作為陽性對照。2.3蕁麻提取物的制備和

8、活性研究取蕁麻根50g，粉碎成1的小段，室溫下用水浸泡12h，將提取液過濾濃縮后，加乙醇至濃度到達(dá)80去除小分子成分，防止熒光干擾，沉淀冷凍枯燥后配制成2g/l溶液，按照“2.2的操作向酶反響體系中參加(最終濃度0.1g/l)，酶促反響后測定其熒光值。3結(jié)果3.1輔酶濃度和熒光測定條件輔酶NADPH濃度為1l/L，熒光儀測定條件：激發(fā)波長340n；吸收波長461n；狹縫寬度3n；響應(yīng)時(shí)間0.5s。3.2睪酮濃度對酶活性的影響在固定酶提物濃度1.2g/l和輔酶NADPH的濃度1l/L的條件下，逐步增加睪酮濃度，分別是：0.1，0.2，0.5，2.0，20.0l/L和200l/L，在37條件下反響

9、1h，測定熒光值。如圖1所示，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?0.5l/L時(shí)，隨著睪酮濃度變大，熒光值降低，但當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾?0倍，100倍時(shí)，熒光值不再變化，說明當(dāng)睪酮濃度到0.5l/L時(shí)，即可獲得較高的酶活性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3酶提取物濃度對酶活性的影響確定底物和NADPH濃度以后，考察反響體系所需的酶量，以總蛋白含量表示5-復(fù)原酶提取物含量，用緩沖溶液稀釋成一系列濃度，濃度分別為：0.3，0.6，1.2，1.8，2.4g/l，在37條件下反響1h后測定熒光值。如圖2所示，隨著酶量的增加，熒光值不斷降低，當(dāng)粗酶濃度到達(dá)1.2g/l以后，熒光值趨于恒定，因此將反響的酶濃度定為1.2g/l。3.4反響

10、溫度對酶活性的影響設(shè)置不同的溫度值，考察對5-復(fù)原酶的影響，溫度值分別是：15，25，37，45，60。如圖3顯示，在37條件下，相對熒光值最低，說明酶活性最高，當(dāng)溫度升高和降低時(shí)，活性有所下降，當(dāng)溫度升高到60以上時(shí)，熒光值到達(dá)較高，根本上已經(jīng)失去活性，以37作為酶反響溫度。3.5反響時(shí)間對酶活性的影響在固定酶的濃度和底物濃度的情況下，測定不同時(shí)間點(diǎn)熒光值的變化情況，時(shí)間點(diǎn)分別是：5，10，20，30，60，90，120in。如圖4顯示，隨著反響時(shí)間的延長，熒光值逐漸下降，在反響60in以后，熒光值趨于恒定，說明酶已經(jīng)反響完全，以60in作為反響時(shí)間。3.6陽性對照藥對酶活性的影響向反響體系

11、中參加特異性復(fù)原非那雄胺，濃度依次為：10，25，50，75，100l/L。結(jié)果顯示，非那雄胺呈濃度依賴性抑制酶促反響，濃度到達(dá)50l/L時(shí)，顯示較強(qiáng)的抑制作用，說明采用熒光測定建立的5-復(fù)原酶活性測定方法具有專一性。3.7蕁麻提取物的抑制活性酶促反響體系參加蕁麻提取物(濃度為0.1g/l)，37下反響60in后，測定相對熒光吸收值，結(jié)果顯示熒光相對值有顯著升高，說明蕁麻提取物具有5-復(fù)原酶抑制活性，抑制率到達(dá)了60.9%。4討論在研究底物睪酮濃度對酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反響體系中不加睪酮時(shí)，熒光值也有所降低，可能有兩個(gè)原因，一是大鼠組織液中本身就存在少量睪酮參加了5-復(fù)原酶反響，二是NADP

12、H是一種非特異性的復(fù)原型輔酶，它可能作為酶提取物中其它的復(fù)原酶的供氫體而在反響中消耗，因此熒光值降低。文獻(xiàn)報(bào)道蕁麻治療前列腺增生的作用機(jī)理包括抑制芳香酶，抑制Na+-K+-ATP酶以及與性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)結(jié)合等等，但關(guān)于其抑制5-復(fù)原酶活性的報(bào)道一直都沒有，本研究首次發(fā)現(xiàn)蕁麻的水溶性成分具有抑制5-復(fù)原酶的活性，至于是哪一個(gè)有效部位，多糖，蛋白質(zhì)抑或其他極性成分還有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1歐敏銳,戴小福,薛逢春,等.高效液相色譜法檢測5-復(fù)原酶活性J.福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2022,32(2):216.2張倫.5-復(fù)原酶抑制劑市場淺析J.西部藥學(xué)，2022,3(5):27

13、2.3賈悅,王曉東,崔毓桂,等.5-復(fù)原酶在男性生殖中的作用J.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2022,12(2):115.4王永奇，馮寶民，李帆，等.蕁麻屬植物治療BPH研究概況J.大連大學(xué)學(xué)報(bào),2022,26(2):54.5孫祖越,鄭維君,王曉麟,等.甾體5-復(fù)原酶活性的新測定方法J.中華內(nèi)分泌代謝雜志,1998,14(3):206.6王煒,冀保全,唐玲,等.滇藏蕁麻提取物的5-復(fù)原酶抑制活性的研究J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2022,19(9):2071.7Fvredrik.Gverge.AndrgenetablisinthePrstateftheFinasterideTreated,AdultRat:APssibleExplanatinfrtheDiffer