間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨的實(shí)驗(yàn)研究

1、間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】組織工程化骨摘要：目的討論間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成骨才能。方法從羊髂嵴處抽取1015l骨髓組織，用Perll別離液按梯度離心法別離出間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)、增殖后種植在多孔磷酸三鈣上，構(gòu)建組織工程化骨，植入8只羊的左后肢跖骨缺損區(qū)長(zhǎng)21作為實(shí)驗(yàn)組；單純植入多孔磷酸三鈣陶瓷材料的8只羊作為對(duì)照組；分別在術(shù)后6、12、24周處死動(dòng)物行放射學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)。結(jié)果放射學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)，術(shù)后6周實(shí)驗(yàn)組即可見有新骨生成，對(duì)照組那么無明顯新骨生成；骨缺損部位新生骨樣組織、編織骨和板狀骨出現(xiàn)的時(shí)間實(shí)驗(yàn)組也都較對(duì)照組早，并且不經(jīng)軟骨介導(dǎo)即能直接成骨，而對(duì)照組從兩端以“爬行

2、替代方式成骨。術(shù)后24周，放射學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組骨缺損幾乎完全修復(fù)，對(duì)照組只有部分愈合。結(jié)論間充質(zhì)干細(xì)胞不僅在體外具有良好的增殖才能，回植入體內(nèi)后仍然具有良好的成骨才能，不需經(jīng)過軟骨過程就能直接形成新骨，顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：組織工程化骨；骨缺損；新生骨；間充質(zhì)干細(xì)胞Abstrat：bjetiveTinvestigatethestegeniabilityinvivfesenhyalsteellsSsethdTenfifteenlbnearraspiratesereharvestedfrtheiliarestfsheepandenrihedfrS

3、sbydensitygradiententrifugatinveraPerllushin1073g/lAfterulturedandprliferated,thetissueengineeredbneserenstrutediththeseellsandseededntprus13trialiuphsphateerais13TPThen,thenstrutsereiplantedintleftetatarsusdefet21inlengthf8sheepasanexperientalgrupPrusTPpsedithbnearrasiplantedintdefetsfsaesizeandpsi

4、tinin8sheepasantrlgrupSheeperesarifiedinthe6th,12th,and24theekpstperatively,andtheiplantedsaplesereexainedbyradigraph,histlgy,andbiehanialanalysisResultNebnetissueasbservedEitherradigraphiallyrhistlgiallyatthedefetareafexperientalgrupasearlyasthe6theekpstperatively;butasntbservedinthentrlgrupBeausef

5、thenebnefredinadiretannerithutprgressinthrughaartilaginuspressinterediately,steidtissue,venbneandlaellarbne,urredearlierintheexperientalgrupthaninthentrlgrup,inhihthebnedefetsererepairedina“reepsubstitutinannerAtthe24theek,radigraphsandbiehanialtestsrevealedanalstpleterepairfthedefetinexperientalgru

6、p,butnlyapartialrepairinthentrlgrupnlusinSshavegdreprdutiveativityntnlyinvitr,butalsinvivThenebnefredinadiretannerithutprgressinthrughaartilaginuspressinterediatelyhenSseretransplantedinvivTheresultsdenstratedthatSsasanexellentseedellsfrbnetissueengineeringKeyrds：Tissueengineeredbne;Bnedefet;Regener

7、atednebne;esenhyalsteells迄今為止，大節(jié)段的骨缺損修復(fù)仍然是骨科醫(yī)生面臨的宏大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的自、異體骨移植法都有一定的局限性，因此有必要尋找一種新的修復(fù)骨缺損的方法。多孔磷酸三鈣陶瓷具有良好的生物降解性、生物相容性，而且無毒性，構(gòu)造穩(wěn)定并合適細(xì)胞生長(zhǎng)，因此是骨組織工程理想的支架材料1。然而，為了增加材料的生物活性還需要增加一些刺激骨生長(zhǎng)的物質(zhì)，包括骨髓、干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨形態(tài)蛋白等。骨髓細(xì)胞中包括有造血干細(xì)胞和具有成骨潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多向分化潛能，故而能分化為骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪和造血基質(zhì)等多種組織。本研究的目的就是討論間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成骨才

8、能。1材料與方法11材料111實(shí)驗(yàn)用品LDEGib，BRL，USA，胎牛血清FS，Gib，BRL，USA，其它化學(xué)用品均購(gòu)自Siga公司。多孔磷酸三鈣陶瓷由法國(guó)地中海大學(xué)盧建熙博士提供，呈圓柱狀，長(zhǎng)21，直徑10，孔隙率70，孔徑45050，連接徑15050，射線消毒，劑量25KGY。112動(dòng)物成年綿羊16只，年齡205歲，體重3510kg。術(shù)前予以標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物飼料和流動(dòng)水。將動(dòng)物隨機(jī)均分成兩組：第1組，磷酸三鈣陶瓷植入組;第2組，磷酸三鈣陶瓷與自體間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合植入組。12方法121別離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞在全麻、無菌條件下，用18號(hào)穿刺針從羊髂嵴處抽取1015l新穎骨髓，肝素抗凝200UL。

9、為了防止穿刺時(shí)骨髓被血液稀釋，應(yīng)分別在髂嵴上不同的3個(gè)點(diǎn)進(jìn)展穿刺。按照前述的方法別離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞2。首先把骨髓與含10FS的LDE培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)基中含青、鏈霉素100UL，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用Perll別離液1073gL梯度別離間充質(zhì)干細(xì)胞。搜集界面層細(xì)胞，洗滌后種植在7575的培養(yǎng)瓶中，每瓶含細(xì)胞1106個(gè)。然后將它培養(yǎng)在37，52和100濕度的孵箱中。第3d換液，去除不貼壁的細(xì)胞，以后每周更換培養(yǎng)液2次。在第9、10或11d時(shí)以8103個(gè)L的密度傳代，直至培養(yǎng)的第16d。122構(gòu)建多孔磷酸三鈣陶瓷與細(xì)胞復(fù)合體在培養(yǎng)的第16d用胰酶和乙二胺四乙酸消化細(xì)胞，搜集、重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1108個(gè)

10、L骨形成所需的標(biāo)準(zhǔn)起始細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液均勻地滴加在磷酸三鈣陶瓷材料上即成為陶瓷-細(xì)胞復(fù)合體。復(fù)合體先在37、52和100濕度的孵箱中干孵育6h，然后再參加含15FS的LDE培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24h。123手術(shù)過程手術(shù)在全麻、無菌條件下進(jìn)展，手術(shù)過程與文獻(xiàn)報(bào)道一樣3。術(shù)區(qū)脫毛、消毒，外側(cè)正中切口切開皮膚和軟組織，鈍性剝離骨膜，用線鋸在跖骨中段鋸取21長(zhǎng)的跖骨干缺損，包括附著在骨干上的骨膜。無菌生理鹽水沖洗骨缺損區(qū)，加壓鋼板固定，按實(shí)驗(yàn)要求植入材料，逐層縫合。術(shù)后頭2d動(dòng)物放置在空調(diào)室內(nèi)，制止負(fù)重，2d后開放性圈養(yǎng)，允許其在疼痛可忍受的程度下活動(dòng)，羊飼料和流動(dòng)水飼養(yǎng)。術(shù)后6、12、24周處死動(dòng)物取

11、材。124熒光標(biāo)記分別在處死前15d和前7d連續(xù)皮下注射四環(huán)素3d，劑量50gkg。125X線片分析術(shù)后即刻攝片，以后分別在第6、12、24周攝片。所有的X線片均由3個(gè)人單獨(dú)進(jìn)展放射學(xué)評(píng)價(jià)。主要根據(jù)X線片上骨與植入物界面的骨連接情況、植入物外表的骨痂生長(zhǎng)情況和骨橋的生長(zhǎng)情況進(jìn)展評(píng)估。骨缺損區(qū)每面骨連接形成得1分，最低分0分在缺損區(qū)的任一面上均無骨連接，最高分4分缺損區(qū)的前、后、側(cè)面及中央均形成骨連接。記錄骨痂到達(dá)最厚時(shí)的時(shí)間，并計(jì)算出6、12和24周時(shí)骨痂的平均厚度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.126生物力學(xué)測(cè)試測(cè)試過程按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)展4。搜集標(biāo)本后：立即去除軟組織即可進(jìn)展生物力學(xué)的測(cè)試。858in

12、iBinix生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)TS，USA上行垂直壓縮試驗(yàn)，負(fù)荷10N，速度10in。通過圖表記錄器可以獲得一個(gè)壓應(yīng)變的曲線圖，然后計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本的壓縮應(yīng)力及其彈性模量，再計(jì)算出平均的壓縮應(yīng)力和彈性模量。對(duì)側(cè)正常的跖骨作為對(duì)照組。127組織學(xué)及組織形態(tài)學(xué)分析分別在術(shù)后6、12和24周處死動(dòng)物。將每個(gè)標(biāo)本的中間部分包含骨與植入物相連的2個(gè)界面切下來固定在10的甲醛溶液中。脫鈣切片標(biāo)本置于10的甲酸中脫鈣，梯度酒精逐級(jí)脫水、清洗、石蠟包埋，assn三色染色和天狼星紅染色需在偏振光顯微鏡下觀察。不脫鈣切片標(biāo)本在4的中性多聚甲醛液中固定2周后，用流動(dòng)水沖洗12h，再用梯度丙酮逐級(jí)脫水，-20下聚甲基丙烯酸

13、甲酯包埋。等聚甲基丙烯酸甲酯凝固后在低溫下切片，切片厚200300，用膠水將切片粘在一個(gè)塑料支架上，手工將它磨至5051，直接在熒光顯微鏡下觀察。然后用超薄切片機(jī)把剩余的標(biāo)本切片，切片厚15，直接在光學(xué)顯微鏡下觀察。128統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析。P005代表差異有顯著性。SAS612統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果21放射學(xué)分析術(shù)后即刻攝片能清楚地分辨出宿主骨與植入物，并看到它們之間的透亮帶。隨著新骨的形成，陶瓷材料變得越來越小，并且透光性增加。術(shù)后6周，第2組磷酸三鈣陶瓷周圍可見有斑塊狀不透光區(qū)。12周后，骨缺損區(qū)由不透光的骨痂包繞。24周后，所有動(dòng)物骨缺

14、損區(qū)放射學(xué)檢測(cè)顯示為完全性骨連接，磷酸三鈣陶瓷顆粒幾乎看不見圖1。相比之下，第1組動(dòng)物的骨愈合速度明顯慢于第2組動(dòng)物，24周時(shí)，多為不完全骨愈合圖2。第2組動(dòng)物，術(shù)后12周時(shí)骨痂最厚，隨后骨痂厚度反而減校但第1組動(dòng)物，其骨痂厚度那么不斷增加，24周時(shí)才到達(dá)最大值。經(jīng)測(cè)量每只羊骨缺損區(qū)骨痂的最大厚度及其平均值，可以看到，自體間充質(zhì)干細(xì)胞植入對(duì)新骨生成具有明顯的促進(jìn)作用，其差異具有顯著性表1。表1放射學(xué)與生物力學(xué)評(píng)價(jià)22生物力學(xué)測(cè)試標(biāo)本的抗壓縮強(qiáng)度隨時(shí)間逐步增加。24周后，第2組標(biāo)本抗壓縮強(qiáng)度接近正常骨的抗壓縮強(qiáng)度。兩組標(biāo)本3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比擬均具有顯著性差異P005表1。第2組標(biāo)本無論是抗壓縮強(qiáng)度還

15、是彈性模量均明顯大于第1組動(dòng)物標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005表1。23組織學(xué)評(píng)估231光學(xué)顯微鏡下觀察2個(gè)實(shí)驗(yàn)組新骨生成情況在組織學(xué)上存在差異性。復(fù)合體植入骨缺損區(qū)12周后，第2組磷酸三鈣材料周圍新骨生成較第1組多。大量的新生骨組織沿著陶瓷材料的孔隙及其連接徑從材料的四周向中央長(zhǎng)入，新生骨與陶瓷的兩端嚴(yán)密相連，就如X線片所見的一樣，一個(gè)連續(xù)性的骨橋從骨斷端長(zhǎng)入陶瓷材料的孔隙中。在橫切面和縱切面上都可以看到新生的編織骨和哈佛氏系統(tǒng)存在。新生骨與陶瓷材料的孔隙間很少有間隙和纖維組織存在，但偶然有成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞出現(xiàn)。在磷酸三鈣陶瓷的中央?yún)^(qū)域還可以看到塊狀的新生骨互相連接，將磷酸三鈣陶瓷分成數(shù)不清

16、的小島狀，但陶瓷材料仍然存在。而第1組動(dòng)物，只是在接近宿主骨端的陶瓷內(nèi)有一定程度的骨生成，陶瓷的中央仍然空缺或由纖維組織填充。24周時(shí)，第2組動(dòng)物植入材料的中央和外表都可見成熟的骨細(xì)胞和再生的板狀骨，宿主骨和新生骨分界明晰因?yàn)樗鼈兊墓羌y理不同。尤其令人驚訝的是，24周時(shí)該組動(dòng)物標(biāo)本切片極少能發(fā)現(xiàn)磷酸三鈣陶瓷的痕跡圖3、5。第1組中，植入材料中只是偶然有成熟的骨細(xì)胞出現(xiàn)，新生的編織骨，仍占主導(dǎo)地位，特別是在植入材料的中段。另外，還可見有少量的未吸收的陶瓷顆粒圖4、6。232偏振光顯微鏡下觀察偏振光顯微鏡下，型膠原表現(xiàn)為黃色、橙紅色或紅色的粗纖維，并且其顏色隨纖維的直徑大小變化，纖維越粗大，顏色越

17、明晰；型膠原表現(xiàn)為細(xì)小的綠色纖維；型膠原顯色微弱。第2組動(dòng)物，術(shù)后6周骨折區(qū)主要由型膠原纖維占據(jù)；術(shù)后12周，型膠原纖維增加明顯，但呈無序狀排列；隨著時(shí)間的增加，型膠原增多、增粗，并呈螺旋狀排列；24周時(shí)，粗大的型膠原纖維占據(jù)了全部骨缺損區(qū)，排列更加嚴(yán)密、有序。無論是橫切片還是縱切片，細(xì)小的型膠原纖維都已看不見圖7。第1組動(dòng)物，術(shù)后12周骨缺損區(qū)以型膠原纖維為主，雖然型膠原纖維也有增加，偶然還有型膠原纖維出現(xiàn)；但直到術(shù)后24周，型膠原纖維仍占據(jù)了骨缺損區(qū)的部分區(qū)域圖8。233熒光顯微鏡下觀察四環(huán)素鹽酸鹽作為新生骨的特異性的標(biāo)記物，能選擇性地與鈣鹽結(jié)合，并沉積在新生的骨組織中。在熒光顯微鏡下，標(biāo)

18、記有四環(huán)素鹽酸鹽的新生骨組織發(fā)出亮堂的金黃色熒光，每次標(biāo)記表現(xiàn)為一條亮堂的金黃色熒光帶，兩條熒光帶間的空隙代表兩次標(biāo)記間新生的骨組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2組熒光帶亮度圖9及其帶間寬度都強(qiáng)于第1組圖10。3討論骨缺損修復(fù)的最大障礙就在于缺乏生成新骨所需的足夠的骨誘導(dǎo)因子。絕大部分的修復(fù)反響都需要骨髓中成骨祖細(xì)胞參與，而骨缺損區(qū)往往缺乏成骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞，因此常常修復(fù)才能缺乏導(dǎo)致骨折不愈合。常用的骨移植方式包括自體骨移植、異體骨移植和人工合成骨移植。異體骨來源充足但有些患者無法承受，而且療效也欠佳。自體骨移植對(duì)患者來說來源有限且存在供區(qū)感染等風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，組織工程化骨只需要少量的自體細(xì)胞就能制造

19、出大塊骨組織5，而且還防止了上述的問題。骨髓細(xì)胞中包括有造血干細(xì)胞和具有成骨才能的干細(xì)胞。100多年前就自體骨髓移植具有成骨潛能并成功地用其進(jìn)展動(dòng)物和人體骨缺損的修復(fù)實(shí)驗(yàn)。Gujn在1896年首次發(fā)現(xiàn)自體骨髓移植能生成新骨。Burell及其他一些學(xué)者那么用自體骨髓與自體骨、異體骨和陶瓷復(fù)合修復(fù)牙槽和骨缺損6、7。nnlly和Shindell也曾成功地進(jìn)展自體骨髓注射治療脛骨骨不連。但由于骨髓不能形成必要的機(jī)械連接，因此較少用其進(jìn)展骨缺損填充再造或原發(fā)性或惡性骨腫瘤切除后重建。另外，由于難以在骨折區(qū)長(zhǎng)期保存骨髓，臨床單獨(dú)應(yīng)用骨髓治療的成功率也不肯定。本研究中，第1組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)終末21骨缺損仍未完全

20、修復(fù)，進(jìn)一步證實(shí)大節(jié)段骨缺損的修復(fù)需要大量有成骨潛能的祖細(xì)胞。因此，在臨床運(yùn)用骨髓細(xì)胞進(jìn)展骨重建前應(yīng)該增加其具有成骨潛能的祖細(xì)胞。雖然一些學(xué)者認(rèn)為骨髓細(xì)胞本身就具有促進(jìn)新骨形成的作用，但富集骨髓細(xì)胞中最有活力的成分間充質(zhì)干細(xì)胞才是最重要的。已有學(xué)者嘗試過在鼠、兔、狗等動(dòng)物體內(nèi)用間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨移植物來修復(fù)骨缺損8。通過比擬新穎骨髓細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨才能，結(jié)果證實(shí)種植有間充質(zhì)干細(xì)胞的陶瓷能促進(jìn)新骨更快、更廣泛形成。究其原因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后數(shù)量巨增，成骨才能增強(qiáng)。附著在載體上的干細(xì)胞能在整個(gè)陶瓷上快捷、均勻地生成新骨。這種增加原始植入祖細(xì)胞的方法正是組織修復(fù)或再生所必需的。本實(shí)驗(yàn)

21、最大的優(yōu)點(diǎn)也正是增加了部分祖細(xì)胞的數(shù)量，使其到達(dá)組織修復(fù)或重建所必需的細(xì)胞數(shù)量，這對(duì)臨床中許多骨髓源性成骨祖細(xì)胞減少的情況特別重要，其中包括年齡的增加、骨質(zhì)疏松和其它的代謝性疾患3。由于細(xì)胞整體數(shù)量減少使得細(xì)胞庫(kù)中可用于組織修復(fù)的細(xì)胞數(shù)量減少，而且還可能讓這些患者處于損害性治療狀態(tài)即為了修復(fù)組織而抽取患者一定量的祖細(xì)胞后對(duì)患者產(chǎn)生的損害。而從患者體內(nèi)抽取間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后再回植到特定的部位，既可以增加骨的生成，又克制了組織再生才能的自然性減弱。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅在體外具有良好的增殖才能，回植入體內(nèi)后仍然具有良好的成骨才能，不需經(jīng)過軟骨過程就能直接形成新骨，并且新骨生長(zhǎng)均勻，與宿主骨交融良好，顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞良好的應(yīng)用前景。本文附圖見加頁(yè)1參考文獻(xiàn)：1hsaaK,Ne,atsukaH,etal.TheexpressinfbneatrixprtEinRNAsarundbetaTPpartilesiplantedintbneJ.JBiedaterRes,2000,52:460466.2KadiyalaS,YungRG,ThiedeA,etal.ultureexpandedanineSpssessstehndrgenieptentialinvivandinvi