新一代測序技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

1、新一代測序技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀一、我們將如何應(yīng)對海量的基因信息新一代測序技術(shù)帶給人們大量遺傳信息的同時，卻成為限制其廣泛應(yīng)用的一個障礙。1980 年 ， 英國生物化學(xué)家Frederick Sanger與美國生物化學(xué)家Walter Gilbert 建立了 DNA 測序技術(shù)并獲得諾貝爾化學(xué)獎， 至今已有近三十年了。 在這三十年， DNA測序技術(shù)取得了令人矚目的進(jìn)展。 目前已進(jìn)入市場的循環(huán)陣列測序平臺采用的是與 Sanger生物化學(xué)測序方法完全不同的原理。在過去幾年，應(yīng)用極為廣泛的毛細(xì)管電泳測序法采用的則是多線并行陣列格式， 它運用尖端的熒光成像技術(shù)進(jìn)行堿基識別。上述各類新技術(shù)為生物學(xué)研究領(lǐng)域開辟了新的視

2、角，也使實驗研究達(dá)到一個新的水平。學(xué)界對開發(fā)這類新技術(shù)的興趣持續(xù)高漲，與此同時，人們卻發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)存在一定的不足 大量信息數(shù)據(jù)的產(chǎn)生限制了技術(shù)更加廣泛的應(yīng)用，并降低了其市場價值。過去，研究人員使用Applied Biosystems( ABI )公司的3730XL 毛細(xì)管電泳測序儀進(jìn)行基因分析，每年至多能完成六千萬堿基的測序量。隨著測序技術(shù)日新月異的發(fā)展，這種情況已經(jīng)成為歷史。在2005 年剛剛開始進(jìn)行新一代測序技術(shù)開發(fā)時， Roche公司和 454公司聯(lián)合開發(fā)的焦磷酸測序儀的分析速度就已經(jīng)達(dá)到了上述提及的ABI 儀器速度的50倍之上。也就是從那時起，因基因數(shù)據(jù)過多而產(chǎn)生的問題凸顯了出來， 而

3、且這個問題隨著其他制造商開發(fā)出更多更快的測序儀而愈加嚴(yán)重。舉個例子，ABI 的新一代測序平臺SOLiD( supported oligonucleotideligation and detection)單次運行，便可以分析6Gb 的堿基序列；而Roche/454測序儀單次運行可以將上述結(jié)果轉(zhuǎn)換成12-15 個千兆字節(jié)( gigabytes) 的數(shù)據(jù)信息；Illumina Genome Analyzer( GAII ) 測序系統(tǒng)僅在兩個小時的運行時間里，就得到10兆兆字節(jié)(terabytes)的信息。盡管對于像Applied Biosystems這樣的制造商而言，可以為用戶提供高達(dá)11.25TB

4、 的存儲量，但對于多數(shù)實驗室所具有的信息管理系統(tǒng)來說，規(guī)模如此龐大的數(shù)據(jù)信息，就好像是迎面而來的洪水，讓人感到難以控制。過量信息所帶來的一個副作用在于，用戶無法將初始圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分類存檔，而必須交給相關(guān)公司，利用軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取，然后才能對數(shù)據(jù)進(jìn)行保存。對于大多數(shù)研究人員來說， 像這樣在每次實驗后對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理的方式既繁瑣又不經(jīng)濟(jì)。與花費上萬美元對每一段序列進(jìn)行備份分析相比，對每一次測序結(jié)果進(jìn)行重新測定顯然是一個更簡單、更便宜的選擇。測序儀制造商稱，對原始數(shù)據(jù)再次進(jìn)行分析并不能得到更多新的信息。但是，對于454 測序儀而言，用戶至少可以通過更新的軟件從原始數(shù)據(jù)得到質(zhì)量更高的序列，從而提高

5、堿基識別分辨率，減少誤差。除數(shù)據(jù)處理問題之外，研究人員還需要擁有一個足夠強大的計算機平臺，以便將來自多個測序技術(shù)的短小基因片段進(jìn)行組合，形成基因組外顯子。目前問題在于，測序儀生產(chǎn)商僅僅提供用于某些特定基因信息分析的軟件，如靶標(biāo)重測序、基因表達(dá)分析、染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)或基因組從頭測序等，而并未提供任何其它類型的下游生物學(xué)信息分析軟件。 研究界越來越熟悉這些測序平臺對循證生物學(xué)的巨大潛力，這也就產(chǎn)生了新的研究問題以及全新類型的試驗方法，而這單憑依賴目前的生物學(xué)信息是無法滿足的。從這個角度看，SOLiD 軟件研發(fā)公司( HYPERLINK /gf/)%e4%ba%8e%e4%bb%8a%e5%b9%

6、b4 /gf/)于今年七月剛剛兼并了兩個新的軟件公司，這一舉動無疑朝正確的方向邁進(jìn)了一步。該公司在開放源碼許可證下開發(fā)軟件分析工具， 目的就是為了給生物信息學(xué)領(lǐng)域提供支持，并為其開發(fā)新的算法。對用戶而言， 如果能夠?qū)?shù)據(jù)格式與不同測序平臺獲得的結(jié)果進(jìn)行比較所得的統(tǒng)計數(shù)字進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，無疑具有重大的意義。特別是由于目前以測序平臺為核心的市場競爭激烈，因此每個生產(chǎn)商都努力提供最好的數(shù)據(jù)結(jié)果。在這樣的大環(huán)境下，對數(shù)據(jù)及不同產(chǎn)品的比較結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，便顯得尤為重要。有一個方法可以更好地對不同的新一代測序技術(shù)進(jìn)行比較，那就是建立一個微陣列定性分析小組(Microarray Quality Control

7、consortium)，不僅可以對不同的技術(shù)結(jié)果進(jìn)行比較， 而且還可以將新技術(shù)結(jié)果與DNA 微陣列或定量PCR進(jìn)行比較。綜合以上各類因素，可以預(yù)見的是，新一代測序平臺在近幾年內(nèi)，仍然會局限于少數(shù)實驗室及研究者， 而大多數(shù)缺少能夠?qū)蛐畔⑦M(jìn)行進(jìn)一步分析的實驗室則無法從新測序技術(shù)中獲益。對大多數(shù)實驗室而言，即使新一代的測序平臺能夠提供更多的信息，DNA 微陣列分析仍然是一個相對便宜的選擇。例如，在轉(zhuǎn)錄分析中，雖然新一代測序結(jié)果不僅能給出具有很大動態(tài)范圍的基因豐度信息，同時還可提供剪切變異信息以及SNP 數(shù)據(jù)，但是這些數(shù)據(jù)結(jié)果都需要進(jìn)行不同的DNA 微陣列分析才能獲得。那么，有沒有什么方法可以解決

8、這些問題呢？首先，相關(guān)的資金授予機構(gòu)應(yīng)該對生物信息學(xué)的發(fā)展予以與測序技術(shù)同等的關(guān)注；此外，由于生物信息學(xué)發(fā)展中的瓶頸已經(jīng)限制了測序機器的銷售，測序儀生產(chǎn)商也應(yīng)該聯(lián)合起來解決這一難題。同時 ， 制造商應(yīng)該致力于制定以研究領(lǐng)域為基礎(chǔ)而不是以不同公司為基礎(chǔ)的生物信息學(xué)解決方案。因此 ， 如果新一代測序平臺真的能夠帶動基因組測序“普及化 ” 讓基因組測序從大型測序中心走入每個研究人員的實驗室或者小型研究小組， 那么還需要研究人員付出更多努力，開發(fā)出經(jīng)濟(jì)實惠的分析軟件以及數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。目前的狀況是，與新一代測序技術(shù)相關(guān)的生物信息學(xué)分析工作僅僅掌握在少數(shù)人手里，但是這一具有重要價值的技術(shù)毫無疑問應(yīng)該由大多

9、數(shù)人掌握。 如果數(shù)據(jù)處理問題不能得到有效解決，那么ABI 公司的 SOLiD 系統(tǒng)、 454 公司的超高通量基因組測序系統(tǒng) GS FLX、 Illumina 公司的 GAII 系統(tǒng)等新一代測序儀就永遠(yuǎn)無法真正出現(xiàn)在能夠展現(xiàn)其價值的舞臺上。原文檢索：Editorial. (2008) Prepare for the deluge. Nature Biotechnology, 26(10):1099.二、傳統(tǒng)的DNA 測序技術(shù) Sanger測序法自上世紀(jì)90 年代初，所有的DNA 測序操作幾乎無一例外地全部采用半自動化毛細(xì)管電泳Sanger測序法（圖1a）。而后來出現(xiàn)的高通量測序方法則首先采用以下

10、兩種方法中的一種對DNA 進(jìn)行預(yù)處理（表1）。無論采用以上哪種方法處理后， 我們均可以得到大量的待測序模板片段 質(zhì)?；?PCR 產(chǎn)物。隨后，測序儀會進(jìn)行“循環(huán)測序 ”反應(yīng)。在每一輪測序反應(yīng)的引物延伸步驟中，會隨機引入已被四種不同顏色熒光分別標(biāo)記的ddNTP（ ddATP、ddTTP、 ddGTP、 ddCTP）以終止延伸反應(yīng)。這樣就形成了大量末端被熒光標(biāo)記的、長短不一（終止位點不同）的延伸產(chǎn)物。接著，再用高分辨率的毛細(xì)管凝膠電泳分離這些延伸產(chǎn)物，通過對延伸產(chǎn)物末端四種不同熒光顏色的區(qū)分，計算機軟件會自動“讀出 ” DNA序列。不過，該方法在“讀取 ”每一個堿基信息時都有可能出錯。后續(xù)操作中，比

11、如基因組組裝或者找出變異位點等就是具體情況具體解決了 。 一般 ， 這種高通量測序儀一次最多只能同時進(jìn)行96 個或 384 個樣品測序。Sanger DNA 測序技術(shù)經(jīng)過了30 年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對長達(dá)1,000bp 的 DNA 片段進(jìn)行測序了，而且對每一個堿基的讀取準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%。在高通量基因組鳥槍法測序操作當(dāng)中，使用Sanger測序法的費用大約為 0.5美元/1,000個堿基。原文檢索：Jay Shendure & Hanlee Ji. （2008） Next-generation DNA sequencing.Nature Biotechnology, 26（10

12、）:1135-1145.三、新一代DNA 測序技術(shù)DNA 測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，很多生物學(xué)問題都可以借助高通量DNA 測序技術(shù)予以解決。過去三年，大規(guī)模平行測序平臺(massivelyparallel DNA sequencing platform)已經(jīng)發(fā)展為主流的測序技術(shù)，這項測序技術(shù)的出現(xiàn)不僅令DNA 測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權(quán) ”能夠被眾多研究人員分享。目前，新的測序技術(shù)及手段還在不斷涌現(xiàn)，比如最新的進(jìn)展就包括建立序列數(shù)據(jù)庫、建立序列數(shù)據(jù)分析新方法以及設(shè)計測序試驗等等。新一代DNA 測序技術(shù)有助于人們以更低廉的價格，

13、更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項數(shù)據(jù)。今后，各種測序?qū)⒊蔀橐豁棌V泛使用的常規(guī)實驗手段，這有望給生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域帶來革命性的變革。DNA 測序技術(shù)經(jīng)歷了漫長而曲折的發(fā)展歷程。迄今為止，我們獲得的絕大部分DNA 序列都是基于Sanger測序法獲得的。在過去5年間，人們至少從以下四個方面刺激了DNA 測序技術(shù)的發(fā)展(表2)。具有代表性的新一代DNA 測序儀最近市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品， 例如美國Roche Applied Science公司的 454 基因組測序儀、美國Illumina 公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的 Illu

14、mina 測序儀 、 美國 Applied Biosystems公司的 SOLiD 測序儀 、 Dover/Harvard公司的Polonator測序儀以及美國Helicos 公司的 HeliScope單分子測序儀。 所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略 循環(huán)芯片測序法(cyclic-arraysequencing)，也可將其稱為“新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)”。DNA 樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于DNA（模板變性、引物退火雜交及延伸）以及熒光序列讀取反應(yīng)。20053），但實際上它們背后的原理和技術(shù)都是非常相1b） 。新一代測序法首先也是將基因組DNA 隨機切割成小DNA 分子，然后在體外

15、給這些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫，也mate-paired tag）制成跨步文庫（jumping libraries） 。隨后可以通過原位polony( in situ polony，小詞典1)、微乳液PCR( emulsion PCR)或橋式PCR( bridge PCR)(圖5)等方法獲得測序模板。上述方法有一個共同點， 那就是任何一個小片段DNA 分子的 PCR擴增產(chǎn)物都是在空間上聚集的：原位polony法和橋式PCR法中所有的產(chǎn)物都集中在平板的某處，在微乳液PCR 法( emulsion PCR)中所有的產(chǎn)物都集中在微珠的表面。真正的測序反應(yīng)本身和傳統(tǒng)測序法一樣， 是由重復(fù)的聚

16、合酶促反應(yīng)和最后的熒光讀取分析反應(yīng)組成(圖6) 。 本文討論的所有測序儀都是使用合成測序法( sequencingby synthesis) ，即通過聚合酶或連接酶不斷地延伸引物獲得模板序列，最后對每一輪反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行熒光圖像采集、分析，獲得序列結(jié)果。注 ： 雖然目前測序片段長度短和準(zhǔn)確率不高這兩個缺點限制了新一代測序技術(shù)的應(yīng)用，不過應(yīng)該堅信，我們最終一定會克服這些問題。就好像經(jīng)過了30 年的努力，傳統(tǒng)的測序技術(shù)也今非昔比，到達(dá)了今天的水平一樣。454 測序儀454 測序儀的出現(xiàn)極大促進(jìn)了測序業(yè)務(wù)的開展，科研人員已經(jīng)將測序技術(shù)作為解決科研工作中許多常見問題的利器。 這是因為454 測序儀在以下

17、幾個方面取得了質(zhì)的突破：首先是解決了高通量測序問題；其次它簡化了樣品準(zhǔn)備步驟，將以往轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴增質(zhì)粒的繁瑣過程全部用簡單的體外PCR 擴增法替代了；最后，它縮小了測序反應(yīng)體積，節(jié)省了試劑。這樣，454 測序儀做到了以極其低廉的價格進(jìn)行大規(guī)模平行測序反應(yīng)。它的測序規(guī)模之大、測序費用之低是以往的測序儀無法匹敵的。454 測序儀與其它的新一代測序儀一起，降低了測序檢測的費用，推動了測序技術(shù)平民化進(jìn)程，使得小實驗室也能開展測序檢測項目，打破了以往只有少數(shù)幾個大型測序中心才能進(jìn)行測序研究的“壟斷地位 ”。在過去的18個月里，由于有了454 測序儀的幫助，人們對人類基因組的結(jié)構(gòu)有了更深入的了解，同時第

18、一次使用非Sanger測序法對個人進(jìn)行了測序，還建立了一種發(fā)現(xiàn)小RNA 的新方法。不過，要能讓更多的人使用上新一代的測序產(chǎn)品，它們還需要變得更便宜，并且更加容易操作。在一段時間之內(nèi)，454 測序儀必定會進(jìn)一步降低測序費用，幫助人們迎接個人基因組時代的到來。自從諾貝爾獎得主Frederick Sanger和 Walter Gilbert(圖2)分別發(fā)明了鏈終止法 DNA 測序技術(shù)(sequencing by chain termination technique)和鏈斷裂法DNA測序技術(shù)(sequencing by chain fragmentation technique)之后，人們就一直希望

19、能夠擴大DNA 測序技術(shù)的處理規(guī)模。到了今天，我們對測序技術(shù)的需求和對計算機技術(shù)的需求一起出現(xiàn)了迅猛的增長， 因為測序技術(shù)的發(fā)展速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上實驗要求的增長速度。 于是出現(xiàn)了好幾種替代Sanger測序法的新型測序方法，比如雜交測序法、借助原子力顯微鏡(atomic force microscopy)直接DNA 成像測序法(direct imaging of DNA sequence)、質(zhì)譜分析法、合成測序法以及微液流測序法等等。在我們進(jìn)行人類基因組計劃時還出現(xiàn)了三項技術(shù)改進(jìn)方法，即使用熒光標(biāo)記物取代了放射性標(biāo)記物來標(biāo)記終止堿基(雙脫氧堿基)；使用毛細(xì)管電泳(capillary electr

20、ophoresis)取代了傳統(tǒng)的平板凝膠電泳；建立了末端配對測序法(paired-end sequencing)來對質(zhì)粒、fosmid、人工細(xì)菌染色體(BAC)等短片段序列進(jìn)行測序，解決了測序長度帶來的限制問題。同時，開展研究的自動化液體分裝技術(shù)(liquid-handling robotics)幫助我們擺脫了人工試管操作，可以用自動化的方式在微量滴定板(microtiter plate)上裝載待測序樣品(質(zhì)粒等)，極大地降低了測序的費用和勞動強度。隨著美國454 Life Sciences公司(該公司現(xiàn)已被美國羅氏公司收購)的第一臺新一代測序儀 454 測序儀的面世，我們獲得了一種完全不同的

21、測序方式。454 測序儀引領(lǐng)的新一代測序技術(shù)在一直困擾傳統(tǒng)測序技術(shù)的三個瓶頸問題上取得了突破。這三個問題分別是文庫制備、模板制備和測序。而且，在隨后出現(xiàn)的其它新一代測序儀產(chǎn)品身上，我們或多或少都會發(fā)現(xiàn)在454 測序儀上使用到的技術(shù)，這也足以說明454 測序儀的技術(shù)創(chuàng)新的確取得了巨大的成功。454 測序儀的先行者地位使它對整個測序業(yè)的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它新一代測序儀競爭對手。這一點從Leamon、 Rothberg 等人撰寫的一篇介紹2005 年技術(shù)進(jìn)展的論文被引用了570 多次的事實， 以及有 100 多篇經(jīng)過同行審議的關(guān)于人類遺傳學(xué) 、 代謝組學(xué) 、 生態(tài)學(xué) 、 進(jìn)化學(xué)以及古生物學(xué)的論文( p

22、eer-reviewed publications)都是使用454 測序儀開展的研究多個事實中都能夠得到證明。454 測序儀技術(shù)是繼 Sanger 測序技術(shù)之后出現(xiàn)的第一個用于對細(xì)菌基因組進(jìn)行從頭測序的新技術(shù)，也是第一個被用來對人類基因組進(jìn)行測序的非Sanger測序技術(shù)。其它使用454 測序儀開展的重要研究項目包括探究蜜蜂消失原因的項目、研究人類基因組重排復(fù)雜性的項目、 建立用于研究傳染性疾病新方法的項目以及對尼安德特爾人( Neandertha)基因組的測序項目等。l摩爾定律對454測序儀的影響454 測序儀的迅猛發(fā)展不是因為我們想要Sanger測序儀小型化， 而是因為新型奔騰芯片的出現(xiàn)以及

23、摩爾定律法則給我們帶來的希望。很明顯，常規(guī)的人類基因測序項目會對我們處理測序技術(shù)的能力提出更高要求， 這與我們對計算機處理能力的要求是一樣的。不過，只有將計算機的電子管換成晶體管，才為后來集成電路技術(shù)的發(fā)展提供了可能，這正是計算機產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵所在。而希望對傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行改良，提高它的速度和處理規(guī)模，正如只用電子管直接制作集成電路一樣不可能。因此，如果將各種測序技術(shù)比作一個個晶體管，將一系列測序步驟整合起來比作集成電路，那么也就可以用摩爾定律來預(yù)測DNA 測序技術(shù)的發(fā)展速度了。合成測序法概念雖然在提出的時候還不算成功， 但它的出現(xiàn)為測序儀小型化奠定了基礎(chǔ) 。 基于合成測序法出現(xiàn)了兩種

24、策略： 一種是循環(huán)可切除終止測序法( cyclicreversible termination technology)，即依次逐個添加熒光標(biāo)記的堿基，繼而檢測熒光信號，切除熒光基團(tuán)，如此往復(fù)；另一種策略是焦磷酸測序法( sequenced by detecting pyrophosphate releas）。e 454測序儀采用的正是焦磷酸測序法，因為它似乎比第一種方法的效率更高。結(jié)果證明，454 公司的選擇是正確的。454 測序儀采用的是小型化焦磷酸測序反應(yīng)， 測序模板準(zhǔn)備和焦磷酸測序反應(yīng)步驟都是在固態(tài)芯片上完成的。實際上，早在上世紀(jì)90 年代中期，焦磷酸測序技術(shù)就已經(jīng)被科研界用來進(jìn)行基因分

25、型工作了，但那時的焦磷酸測序技術(shù)還不能夠滿足標(biāo)準(zhǔn)的測序?qū)嶒炓?，因為它的測序長度太短，因此只能用于旨在發(fā)現(xiàn)SNP 的基因分型研究當(dāng)中。當(dāng)時進(jìn)行基因分型操作時，是在微量滴定板（microtiter plate）上進(jìn)行的，可以連續(xù)進(jìn)行最多96 次基因分型實驗，平均每個樣品花費20 美分。那時焦磷酸測序還不能用于從頭測序工作， 因為從頭測序需要對每一個尤其是第一個堿基都能準(zhǔn)確地區(qū)分清楚，而焦磷酸測序只能簡單地對已知位點的堿基進(jìn)行檢測，而且從頭測序要求的測序長度也是焦磷酸測序法無法達(dá)到的。不過，由于焦磷酸測序的原理是通過檢測堿基摻入時發(fā)出的光來進(jìn)行測序的（圖3），所以它并不需要類似于電泳之類的物理分離

26、過程來對堿基進(jìn)行區(qū)分。這也就是說焦磷酸測序儀可以“縮小（減）”到只需要檢測光線就夠了，而不需要像傳統(tǒng)的測序儀還需要電泳設(shè)備，而這正是限制傳統(tǒng)電泳儀小型化的關(guān)鍵所在。發(fā)光檢測方法還能夠進(jìn)行多路平行操作，但是直到454測序儀出現(xiàn)之前，還沒有人這樣做過，以前都是依次進(jìn)行檢測的。和晶體管早期的遭遇一樣（當(dāng)時人們也懷疑晶體管替代不了電子管），人們同時對高密度的，用于并行焦磷酸測序的反應(yīng)也充滿了疑問。不過，當(dāng)我們不再在溶液中進(jìn)行測序反應(yīng)，而是將測序模板、所有的試劑（酶）都固定在平板上制成芯片之后，就獲得了小型化的，能進(jìn)行多路并行處理的測序儀，這就與晶體管被小型化并整合成集成電路的過程一樣。此外，借助微量滴

27、定板上一個個的小孔所達(dá)到的將不同測序反應(yīng)進(jìn)行分隔這一目的，也能通過在單個固相支持物上進(jìn)行嚴(yán)密包裹（隔離）的反應(yīng)來實現(xiàn)。在這些各自隔絕的反應(yīng)體系中，鏈聚合反應(yīng)速度和發(fā)光速度都能通過對反應(yīng)試劑和產(chǎn)物彌散狀況進(jìn)行嚴(yán)密的控制來進(jìn)行精密的調(diào)整。新的并行試驗方法在開發(fā)新型高通量、高并行運行方法時碰到的一個關(guān)鍵問題是，如何將反應(yīng)試劑同時加入數(shù)量如此之多的各個反應(yīng)體系中？在焦磷酸測序的過程當(dāng)中需要反復(fù)加入不同的堿基以供測序反應(yīng)使用， 而當(dāng)時的自動化加樣設(shè)備無法有效地做到對這么多的反應(yīng)體系同時循環(huán)加樣。于是，開發(fā)一種全新的高密度并行處理方法這一重要課題又再一次擺在了科研人員的面前。這一次，我們找到了一個非常簡單

28、但是又很巧妙地方法。在高密度的反應(yīng)芯片表面使用層流(laminar flow)加樣方式，反應(yīng)試劑會通過擴散作用很好地進(jìn)入每一個反應(yīng)體系，而且也可以用層流的方式洗去多余的反應(yīng)試劑。現(xiàn)在，所有的新一代測序儀都采用了這種層流加樣方法。為了將每個單獨的測序反應(yīng)都分隔開來，我們一開始使用平板(芯片)，不過在平板上平均每一平方厘米的面積上最多只能同時進(jìn)行數(shù)百至數(shù)千個反應(yīng)。 但我們希望達(dá)到的是在每平方厘米的面積上同時進(jìn)行100 萬個測序反應(yīng)， 這樣才能令測序儀小型化，同時節(jié)省試劑并進(jìn)行快速成像和測序。為了實現(xiàn)更高密度的測序反應(yīng)，我們在平板上制作了很多小孔，將每個反應(yīng)體系都安置在這些小孔中，這些小孔都足夠深，

29、足以分隔每個反應(yīng)體系。雖然這種方法極大提高了測序反應(yīng)的密度，縮小了平板的面積，但是要達(dá)到我們的要求還是需要60mm 60mm 大小的芯片才行。針對圖像采集問題使用了商業(yè)化的天文學(xué)照相( astrological grade camer)a 器材，在電荷偶合裝置(CCD)的表面連接上光纖束(fiber-optic bundle)。這些光纖是錐形排列的，這樣可以將大范圍的光信號都傳輸?shù)紺CD 表面上很小的一個范圍。采取下面兩個步驟，我們就可以制成含有高密度小孔的芯片：先將光纖束連接到類似于載玻片一樣的一次性芯片上，然后用酸蝕刻(acid etching procedure)技術(shù)在玻片的另一面打上小

30、孔。 這種酸蝕刻技術(shù)是根據(jù)制作生物傳感器的技術(shù)改進(jìn)而來的。454 公司制作的每張芯片上可以達(dá)到數(shù)百萬個小孔，每一個小孔都是一個獨立的“反應(yīng)站 ”，互不干擾，測序反應(yīng)發(fā)出的光被連接在芯片上的光纖傳送到CCD 記錄下來(圖4)。這種芯片就好像集成電路一樣一次可以同時處理數(shù)百萬個測序反應(yīng)。這種芯片同樣也能被其它通過發(fā)光檢測技術(shù)的產(chǎn)品所使用。454 測序儀也沒有像以前的96 孔板焦磷酸測序儀那樣使用液態(tài)的試劑，而是將試劑和模板統(tǒng)統(tǒng)都吸附在一個個微珠上，然后把這些微珠一個個地放到芯片上的小孔中，每孔一個微珠。這種固定步驟不僅保證了每孔測序反應(yīng)的獨立性，也極大地節(jié)省了試劑消耗費用。要想實現(xiàn)高通量基因組測序

31、，只對測序步驟進(jìn)行優(yōu)化還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。人類基因組計劃花費的30 億美元經(jīng)費中有很大一部分都用在了測序樣品制備階段。當(dāng)時即使是采用最簡單的制備樣品方法也需要將目標(biāo)片段克隆到細(xì)菌中，挑克隆，再轉(zhuǎn)到 96 孔板，然后進(jìn)行克隆擴增，提取質(zhì)粒，制備測序模板。這種工作流程既耗時也耗錢。如果采用新型的文庫制備方法就可以極大地節(jié)省這部分開支， 這種新型的方法是先分離基因組DNA，隨機切割成小片段分子，然后通過有限稀釋（limitingdilution）和聚合酶擴增反應(yīng)，即體外克隆方式（clones without bacterial）制備模板片段。這樣，從模板制備到最后的測序反應(yīng)整個過程都能夠在體外完成。從發(fā)

32、明到創(chuàng)新從概念的提出到最后技術(shù)上的實現(xiàn)，454 測序儀主要關(guān)注兩個方面，首先是開發(fā)蝕刻光纖玻片；其次，改進(jìn)焦磷酸測序方法使其能在固相支持物上進(jìn)行，即將其改造成固態(tài)焦磷酸測序法，同時也對模板及文庫構(gòu)建方法進(jìn)行了改進(jìn)，讓454測序儀能進(jìn)行長片段測序工作和從頭測序工作。在蝕刻板上的小孔中進(jìn)行固態(tài)、長片段焦磷酸測序反應(yīng)蝕刻技術(shù)經(jīng)過改良之后能在75mm 75mm 的玻片上刻出深55m、寬44m的小孔。而開發(fā)固態(tài)測序方法和改良測序長度則是兩個緊密相關(guān)的問題，因為在固定的小孔中反應(yīng)實際上就能改進(jìn)測序質(zhì)量和測序長度。 由于反應(yīng)試劑能迅速滲透到小孔中，因此反應(yīng)速度也會加快。而且這里也沒有使用三磷酸腺苷雙磷酸酶（

33、 apyrase） 提取未參與反應(yīng)的堿基，而是將芯片置入反應(yīng)池中通過層流液體的快速滲透作用將多余的未參與反應(yīng)的堿基和反應(yīng)副產(chǎn)品洗掉，由此得到 100bp500bp的測序長度。在能有效去除多余堿基的同時，每輪反應(yīng)中聚合酶的效率也得到了極大提高。 這樣高效率的聚合反應(yīng)使得454 測序儀具有較長測序長度的同時也保證了高準(zhǔn)確性，測序長度在200bp 時的準(zhǔn)確率高達(dá)99.5%。這是因為通過降低小孔中殘存的未參與反應(yīng)的堿基濃度， 可以降低這些堿基對聚合酶活性的抑制作用，或者降低這些堿基導(dǎo)致的延后錯誤（carry-forward error，即由于未參與反應(yīng)的堿基導(dǎo)致的測序反應(yīng)不同步現(xiàn)象）的發(fā)生率。454測

34、序儀在測序長度和準(zhǔn)確率方面具有優(yōu)勢還因為其在應(yīng)用流體學(xué)、表面化學(xué)和酶學(xué)（包括選擇更好的聚合酶、在更高的溫度進(jìn)行測序反應(yīng)以及更換及平衡各個酶組分）等方面都有創(chuàng)新（表4）。還有一些能提高測序精度和測序長度的技術(shù)，不過暫時還沒有商業(yè)化產(chǎn)品。這些技術(shù)包 括 使 用 可 切 除 的終止 堿 基 ( reversible terminator)提高對 同 聚 物( homopolymers)的檢測精度；雙末端測序法(double-ended sequencing)，即同一模 板 的 兩 條 鏈 均不測 序 ； 以 及 選 擇 性 酶 固 定法(alternativeenzyme-immobilizatio

35、n method)等。這些技術(shù)改進(jìn)還都沒有用到測序儀產(chǎn)品中，有一部分原因是因為現(xiàn)在還沒有必要使用。注：蜜蜂群崩潰癥(honeybee colony collapse)，指的是來自養(yǎng)蜂業(yè)的蜂箱或自然界存在的歐洲蜜蜂群的工蜂突然消失的現(xiàn)象，又稱作Colony collapse disorder( CCD)。模板制備程序完全的體外大規(guī)模模板制備工作是達(dá)成高通量、低價格測序技術(shù)的前提。已廣泛使用的乳液PCR 擴增技術(shù)就是一種很好的方法。不過，由于很難在熱循環(huán)測序反應(yīng)中保證乳液微滴的穩(wěn)定性，因此最開始實驗的模板擴增方法是恒溫擴增法( isothermal)。乳液 PCR 不需要借助細(xì)菌的幫助就能擴增模板

36、，雖然這一點非常誘人，但最開始時并沒有合適的表面活性劑能幫助乳液在熱循環(huán)過程中保持穩(wěn)定。 于是出現(xiàn)了恒溫擴增法，即滾環(huán)擴增反應(yīng)(RCA) 。雖然滾環(huán)擴增反應(yīng)的產(chǎn)量非常高，但這些產(chǎn)物中大部分都不能用來作為測序模板。因此，還需要找到一種不需要細(xì)菌擴增，能用于有限稀釋的模板擴增新方法。于是，人們又把目光轉(zhuǎn)回了PCR 法。在 RCA 法中，首先將模板克隆有限稀釋之后置入光纖玻片上的小孔中，然后用橡膠襯墊把光纖玻片封閉起來，將玻片放入傳統(tǒng)的平頂PCR 儀進(jìn)行擴增。這種方法取得了成功，但是效率不高，因為在玻片中的熱質(zhì)量(thermal mass)和它的鉗效應(yīng)(clamping mechanism)需要更長

37、的PCR 循環(huán)時間，而且模板的有限稀釋度不能低于10%。 孔與孔之間的相互污染現(xiàn)象也是一個不容忽視的問題。不過無論如何，該方法還是第一個首先從全基因組文庫中擴增模板然后使用非Sanger、非Gilbert 測序法對基因組進(jìn)行從頭測序的方法，也是第一個使用體外模板擴增技術(shù)進(jìn)行全基因組(腺病毒基因組)測序的方法。乳液滴的熱穩(wěn)定性問題最終通過加入用于制造炸藥的表面活性劑得到了解決， 于是乳液 PCR技術(shù)馬上在眾多新一代測序儀中得到了廣泛的應(yīng)用。因為乳液PCR技術(shù)具有高效性、可擴展性，既能從30Kb 的腺病毒基因組中擴增模板，也能從好幾 Mb 的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoni

38、a)基因組中擴增模板。e隨著測序精度、測序長度、乳液滴穩(wěn)定性等各方面技術(shù)的不斷發(fā)展，454 測序儀已經(jīng)不僅僅用于對細(xì)菌級別的基因組進(jìn)行測序了，還能對更高級、更復(fù)雜的生物基因組進(jìn)行測序，例如現(xiàn)代人類基因組、尼安德特人基因組以及環(huán)境基因組等。文庫制備文庫制備包括以下幾個步驟，首先隨機切割樣品基因組，獲得大量DNA 片段，然后接上接頭進(jìn)行擴增反應(yīng)。454 測序儀的樣品制備程序和Craig Venter等人的鳥槍法樣品制備程序有著本質(zhì)的差別。454 公司采用的是如圖4 中所示的有限稀釋、乳液PCR 擴增法，而沒有鳥槍法中的細(xì)菌克隆繁殖步驟。去掉了細(xì)菌繁殖步驟極大地提高了整個測序工作的速度和效率， 同時

39、避免了由于細(xì)菌繁殖導(dǎo)致的序列丟失的可能性。這種方法同樣對古老DNA 和代謝基因組學(xué)的研究也非常適用 。 末端配對文庫制備方法的建立同樣幫助454測序儀獲得了對復(fù)雜基因組從頭測序 、 對重復(fù)片段測序以及對基因組結(jié)構(gòu)(復(fù)制 、 重排) 展開系統(tǒng)研究三種能力。這種末端配對文庫的制備方法是受到了Bender科研小組對果蠅(Drosophila)制備跨步文庫(jumping library)方法的啟發(fā)而發(fā)展得來的。應(yīng)用范圍隨著越來越多重要的研究領(lǐng)域受到測序技術(shù)的影響，454 公司開始和其它商業(yè)和學(xué)術(shù)機構(gòu)開展合作，進(jìn)行樣品測序和分析工作。這些合作項目又進(jìn)一步驗證了454 測序儀使用的技術(shù)能夠在眾多領(lǐng)域中發(fā)

40、揮作用，例如末端配對文庫技術(shù)對于研究基因組結(jié)構(gòu)的作用和乳液PCR技術(shù)捕獲目的DNA 片段的作用等。細(xì)菌基因組測序和比較基因組研究為了測試454 測序儀在全基因組測序方面的能力，454 公司一開始就參與了一項合作項目，該研究項目會對4 株結(jié)核分支桿菌基因組進(jìn)行測序，這四株結(jié)核分支桿菌分別是一株對R207910 具有耐藥性的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)菌株，基因組大小約4Mb；兩株對R207910 具有耐藥性的恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis) ，基因組大小約6Mb；以及一株正常的恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegm

41、atis) ，基因組大小約6Mb。他們希望能發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)對R207910產(chǎn)生抗藥性的機制。該項研究清晰的展現(xiàn)了454 測序儀在測序速度和測序精度方面的優(yōu)勢。使用傳統(tǒng)的Sanger測序法對一個4Mb 的基因組和3個 6Mb 的基因組進(jìn)行測序需要好幾個月的時間，而用454 測序儀，在只有一位實驗人員參與實驗的情況下，包括樣品制備等步驟在內(nèi)所用的時間僅需要一周。 而且使用454 測序儀還避免了傳統(tǒng)測序方法中細(xì)菌克隆階段可能出現(xiàn)的錯誤，獲得了高質(zhì)量的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對R207910 產(chǎn)生抗藥性的兩個點突變位點。這項研究成果讓我

42、們在最近的 40 年內(nèi)第一次找到了特異性治療結(jié)核病的藥物，同時也對454測序儀在細(xì)菌基因組測序方面的應(yīng)用價值有了深刻的體會。隨后，454測序儀又參與了比較基因組學(xué)研究項目、對高致病性細(xì)菌空腸彎曲菌(Campylobacter jejun)基因組的從頭測序項目、對幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)在慢性胃炎致病過程中的進(jìn)化研究項目、從南極海冰細(xì)菌(Antarctic sea ice bacterium)中新發(fā)現(xiàn)冰結(jié)合蛋白(ice-binding protein)并對其測序的研究項目，以及在引起肺炎、腦膜炎和泌尿道感染的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)致病因素的研究項目等。由于454 測序儀不會因為細(xì)

43、菌克隆產(chǎn)生測序誤差， 所以在對結(jié)核分枝桿菌抗藥性的研究中表現(xiàn)出了非常強的發(fā)現(xiàn)突變位點的能力， 這一點也被后來的其它研究項目所證實。此外，最近在用454 測序儀進(jìn)行的人類基因組測序項目中發(fā)現(xiàn)了長達(dá)29Mb 的片段與人類基因組參考序列build-36 不相符，這些片段被認(rèn)為是參考序列中不存在的序列，屬于基因組中的常染色質(zhì)部分。不過，還需要注意的是，有些報道稱由于重復(fù)片段的存在會出現(xiàn)序列組裝錯誤，而且小模板片段霧化( nebulization)處理這種方式也會造成測序錯誤出現(xiàn)。小 RNA 測序?qū)τ诎╩iRNA 在內(nèi)的小RNA 的研究興趣從2005年開始就持續(xù)不斷升溫，而2005年恰好也是454測序

44、儀上市的那一年。 454測序儀以其不需要進(jìn)行傳統(tǒng)的細(xì)菌克隆步驟和足以覆蓋只有21bp 長的 miRNA 的測序長度等優(yōu)勢，很快就在miRNA 的作用研究之中占據(jù)了一席之地。454測序儀最早參與進(jìn)行的miRNA 研究是對擬南芥(Arabidopsis thaliana) miRNA 開展的研究。隨后馬上又參與了另一項研究項目，在這個項目中我們在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新型的小 RNA piRNA。這些研究項目為我們在人類、黑猩猩、斑馬魚和腫瘤細(xì)胞系中開展小 RNA 研究鋪平了道路。 454測序儀具有的這種對小RNA 進(jìn)行研究的能力使它在眾多有關(guān)RNA 的研究領(lǐng)域都能有所作為，例如轉(zhuǎn)錄體研究領(lǐng)域、EST

45、研究領(lǐng)域、5 -RATE 研究領(lǐng)域和基于轉(zhuǎn)錄體的SNP研究領(lǐng)域等。在古生物學(xué)和古DNA 研究領(lǐng)域的作用要用傳統(tǒng)的測序方法對尼安德特人的基因組進(jìn)行測序研究非常困難， 因為這些古老 DNA 量非常少，而且都早已裂解成了片段。一開始，454 公司使用比較容易得到的不太重要的古代DNA 樣品檢驗了454測序儀對它們的測序能力，結(jié)果非常好，盡管當(dāng)時454 測序儀的測序長度只有100bp。不過，尼安德特人的基因組片段長度基本上都介于40bp90bp之間，而且最近開發(fā)的乳液PCR 方法也能夠?qū)ξ⒘?單分子)樣本進(jìn)行很好的擴增。于是，454 測序儀參與了對38,000年前古老的尼安德特人的基因組進(jìn)行測序的工作

46、， 研究結(jié)果分別發(fā)表在了好幾篇論文當(dāng)中，引起了廣泛的關(guān)注，并促進(jìn)了古生物學(xué)基因組的研究。隨后有人對長毛象( woolly mammoth) 和更新世狼( Pleistocene wolves) 的基因組開展了測序研究。環(huán)境基因組學(xué)和感染性疾病研究領(lǐng)域美國在 2001 年爆發(fā)了炭疽恐怖襲擊危機之后，454 公司便對如何使用454 測序儀對復(fù)雜的、未知的、未人工培養(yǎng)的環(huán)境微生物基因組進(jìn)行測序展開了研究。前后兩個合作研究項目均表明454 測序儀能夠用于從DNA 混合樣品中發(fā)現(xiàn)未知微生物并對其進(jìn)行分類。在第一個研究項目中，有三名患者都接受了同一名澳大利亞器官捐贈者的器官，之后均因不明原因而死亡。從這三

47、名死者身上提取了非人類 DNA 樣品進(jìn)行測序，結(jié)果獲得了144,000條序列。分析后發(fā)現(xiàn)，這些序列分別屬于一種沙粒病毒科(Arenaviridae)家族病毒的14個不同基因。隨后進(jìn)行的第二項研究在對健康蜂群和患病蜂群進(jìn)行環(huán)境基因組學(xué)比較研究之后發(fā)現(xiàn)， 以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus)是導(dǎo)致蜜蜂蜂群崩潰癥的元兇。上述這些研究都突出了454 測序儀的一個特點， 即在樣品準(zhǔn)備前不需要進(jìn)行克隆或預(yù)擴增步驟，因此非常適用于對未知的未能人工培養(yǎng)的物種進(jìn)行測序。這些特點也在其它對地下礦藏、深海、土壤和高鹽等環(huán)境下進(jìn)行的環(huán)境微生物構(gòu)成方面的研究所證實?；蚪M結(jié)構(gòu)

48、研究領(lǐng)域454 測序儀技術(shù)的進(jìn)步使它能夠適用于更多的科研領(lǐng)域。最新開發(fā)的末端配對測序法 ( paired-end sequencing) 就非常適合用于發(fā)現(xiàn)人類基因組當(dāng)中的結(jié)構(gòu)變異。末端配對作圖過程( paired-end mapping) ，簡單來說就是對一個非洲人和一個歐洲人的基因組進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異并對其作圖， 最終將 1,000多個 3Kb 或更長的結(jié)構(gòu)變異片段定位到人類基因組參考序列中。研究發(fā)現(xiàn)，在人類基因組當(dāng)中存在的結(jié)構(gòu)變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了人們的預(yù)計， 其中有很多變異都會造成非常重要的表型改變。這項對諾貝爾獎得主James Watson 基因組進(jìn)行測序的項目和其它相關(guān)研究，一起使得“

49、人類基因多樣性(human genetic variation) ”這一科學(xué)命題成為了科學(xué)(Science)雜志的年度重大科技突破。Illumina 測序儀Illumina 測序儀通常也被稱作Solexa 測序儀(Illumina 測序儀的特點見表5)。它適用于采用各種方法制備的DNA 文庫，文庫中DNA 片段可以長達(dá)數(shù)百bp，并可通過橋式PCR 來擴增模板片段(圖5b) 。在橋式PCR 反應(yīng)中，正向引物和反向引物都被通過一個柔性接頭( flexible linker ) 固定在固相載體( solid substrate)上。經(jīng)過PCR 反應(yīng)，所有的模板擴增產(chǎn)物就都被固定到了芯片上固定的位置。

50、值得注意的是，Illumina 測序儀使用的橋式PCR與傳統(tǒng)的橋式PCR有所不同，它會交替使用Bst 聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)以及使用甲酰胺(formamide)進(jìn)行變性反應(yīng)。這樣，經(jīng)過橋式PCR擴增之后，也會在固相載體上形成一個個的模板“克隆 ”。 一塊芯片的8 條獨立 “泳道 ”上每一條泳道都可以容納數(shù)百萬的模板“克隆 ”，這樣一次就可以同時對8 個不同的文庫進(jìn)行測序。經(jīng)過上述PCR 擴增步驟之后，所有的模板都被線性化處理(linearization)而形成單鏈模板，接著與測序引物退火、雜交。隨后使用修飾的DNA 聚合酶和四種核苷酸混合試劑進(jìn)行單堿基延伸測序反應(yīng)(圖6b)。這些核苷酸試劑都經(jīng)過兩

51、種方式處理過，它們都是可逆的終止子( reversible terminator) 。這些核苷酸的3羥基端都有一個可被化學(xué)法切除的基團(tuán)，這樣每一次反應(yīng)都只會摻入一個核苷酸，同時每種核苷酸都標(biāo)記上了可被化學(xué)法切除的不同顏色的熒光基團(tuán)，以標(biāo)識每種堿基。經(jīng)過一輪單堿基摻入反應(yīng)采集到信號之后，就可以通過化學(xué)方法切除上述被摻入核苷酸上標(biāo)記的兩個基團(tuán)，然后就能夠繼續(xù)摻入下一個核苷酸，重復(fù)測序反應(yīng)了。這種測序方法對36bp 長度的序列測序準(zhǔn)確率是非常高的，不過如果處理更長的序列，準(zhǔn)確率就會有所降低了。AB SOLiD 測序儀AB SOLiD 測序儀可以對由任何方法制成的DNA 文庫進(jìn)行測序。AB SOLiD

52、 測序儀有一個極大的特點就是能夠?qū)⒏患０迤蔚奈⒅樵谛酒线M(jìn)行高度可控的任意排列。AB SOLiD 測序儀也是使用如圖5a中所示的微乳液PCR方法擴增模板片段的，不過，它這里使用的是直徑只有1m的小磁珠。PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束之后，微乳液滴被打破，小磁珠被富集起來固定到固態(tài)平板上，制成高密度測序芯片。后面的合成測序法由DNA 連接酶而非DNA 聚合酶完成。首先，通用引物與模板片段兩端的接頭序列互補結(jié)合，然后連接酶將一個被熒光標(biāo)記的 8bp 長的核酸探針片段（fluorescently labeled octamers）連接到引物末端（圖6c）。這段8bp 長的核酸探針片段是經(jīng)過設(shè)計的，比如其中

53、第五位堿基上就標(biāo)記了熒光。連接反應(yīng)完成之后，就可以采集熒光圖像，然后在第五位堿基和第六位堿基之間切斷，去掉熒光標(biāo)簽。如此反復(fù)，就可以獲得每間隔四個堿基的第五號堿基的確切信息，比如第5 號堿基、第10 號堿基、第15 號堿基以及第20 號堿基等等。經(jīng)過幾輪這樣的循環(huán)之后，已經(jīng)獲得延伸的引物會變性脫落，再重新結(jié)合上新的引物從頭開始新一輪測序， 不過這一次可能獲得的是第4 號堿基、第 9 號堿基、第14 號堿基以及第19 號堿基的信息。我們可以使用不同長度的引物（+1 或者 -1）或者使用在不同位點（比如第2 號堿基）標(biāo)記熒光的8bp核酸探針片段達(dá)到這個目的。如此反復(fù)，最終就能獲得整條模板片段的完整

54、序列信息。AB SOLiD 測 序 儀 還 有 一 個 特 點 就 是 使 用 了 雙 堿 基 編 碼 技 術(shù) （ two-base encoding），該技術(shù)具有誤差校正功能，因為它是通過兩個堿基來對應(yīng)一個熒光信號而不是傳統(tǒng)的一個堿基對應(yīng)一個熒光信號，這樣每一個位點都會被檢測兩次，因此出錯率明顯降低。Polonator測序儀是一個和AB SOLiD 測序儀比較相似的產(chǎn)品，因為它也運用了J.S等人和哈佛大學(xué)Church研究小組開發(fā)的部分系統(tǒng)。 Polonator測序儀同樣也使用微乳液PCR法擴增模板片段，使用連接酶法測序。不過，Polonator測序儀的價格要比其它第二代測序儀低得多。而且更重

55、要的是，Polonator 測序儀是一個開源的設(shè)備，用戶可以通過自己編程“設(shè)計 ”出最適合自己的測序儀。不過，Polonator測序儀目前可測序的長度還非常有限。值得注意的是，454 測序儀、 SOLiD 測序儀以及Polonator 測序儀還都存在一個共同的不足，那就是微乳液PCR 技術(shù)實在是太過麻煩并且對實驗操作的技術(shù)要求較高。不過從另一方面來說，使用僅僅只有1m 大小的磁珠構(gòu)成的高密度測序芯片進(jìn)行測序(不論是使用聚合酶法、連接酶法，還是其它的生化方法)是最有可能實現(xiàn)的高通量測序方法。因為1m 是衍射技術(shù)(diffraction )所能分辨的極限大小了。另一方面，最近報道的使用1m磁珠進(jìn)行

56、高分辨率芯片點樣技術(shù)的突破 ， 使我們有望實現(xiàn)每個測序模板一個像素( one pixel per sequencing featur)e的愿望。HeliScope測序儀HeliScope測序儀是由Quake團(tuán)隊設(shè)計開發(fā)的，它實際上也是一種循環(huán)芯片測序設(shè)備。不過，HeliScope 測序儀最大的特點是無需對測序模板進(jìn)行擴增，它使用了一種高靈敏度的熒光探測儀直接對單鏈DNA 模板進(jìn)行合成法測序。首先，將基因組 DNA 切割成隨機的小片段DNA 分子，并且在每個片段末端加上poly-A尾。然后通過poly-A 尾和固定在芯片上的poly-T 雜交，將待測模板固定到芯片上，制成測序芯片。最后借助聚合酶

57、將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上(圖6d)。采集熒光信號，切除熒光標(biāo)記基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)，如此反復(fù)，最終獲得完整的序列信息。根據(jù)最近的報道，經(jīng)過數(shù)百輪這種單堿基延伸可以獲得25bp或更長的測序長度。HeliScope測序儀的其它特點見表6?；⒃靼l(fā)元y-GAACATAOXX產(chǎn)CTA.W附珠TO3AT .-35FWXXnnn=化英元索發(fā)元y-GAACATAOXX產(chǎn)CTA.W附珠TO3AT .-35FWXXnnn=CH dATP S. *.腕*三雙明韻注海ATP -美元素二.dGTP. aw.ATP -美元素dCTP.庭腕管三事依雙安洗法dTTP,底粉.牌音三碩馥雙項族酹澆注，1黃元基團(tuán)l

58、dATP（范鋁初基團(tuán)戶靈藥基團(tuán)dGTP（lfi竭號圣團(tuán)戶貢元萎團(tuán)3YCTFH阻姆號芟團(tuán)靈光芟S4TTPT阻姆物基團(tuán)）、2. 國人遒道上美元成慘3：憶法切除美元標(biāo)記基團(tuán)及信明有終止基團(tuán)K連接上精定的8bp猊A.賓奧信號、切除.重復(fù)5次.重新開始新一維測序x I. CyS-dATP.集實懵號.切除靈光標(biāo)記（2. CyS-dGTP.哭宴信號，切除英元標(biāo)記、3. CyS-dCTP.會案信號.切除英允標(biāo)記. CyS.dTTP.梟真信號.切除熒光標(biāo)記圖6網(wǎng)作右片停技術(shù)示量雷（hax漁停儀使用的方法型苗乳液PCR法獷看.慎帝喜大量殖喙分子的工逐城依宣2芯片上翁懂孔中.4 集生用保項區(qū)沒泡，序.星一鴕浪停發(fā)退

59、鴕會陪入一個核尋窿,4三入反式比黃先案臺5艮營型優(yōu)酷.這樓在 整一個小于.中福黑合味咨幡m赧承入時針會發(fā)光.聶信用朦號三保戰(zhàn)本儡區(qū)及浣漆去捕多余的與看酷.D） Sorxr賽停儀使用，式POR宜？i在芯片上進(jìn)行模壩片收？TR 然言同時匯入四橋J3過修言的稅或住蓄18每一個核 營窿籍以窄一稗黃光不無匕一個可唳去信的終二荃團(tuán).笆過像定兌DN78含IV化引荏連幅漁序五底采集圖像. 加修6年員先行記*團(tuán)七線二*團(tuán).重亶上逑笈a.亮成海序.8） 一口口到停儀犯PlocagdR序使味組增我 :3PCR法！T，喙片收.然售國列弓大量獷:片收的克往2門的話誄喊用戌高箋金海序芯片米倏用麥?iH而 不是京含聯(lián)滿浮法

60、克鐵U序.在SOLD汽浮儀中.每一次及立紀(jì)會在引枕束城匯上一個美光壇記的iiDp的發(fā)料在 發(fā)It中央吃兩個11星上（而不僮I個琳即本我螃旦技術(shù)）辱文尋莢光荃團(tuán)探討發(fā)；SK上之急發(fā)出黃光 4 后聶光萎圖，分（H） 切除.重新進(jìn)行下T 3幾乾這樓岬M停及匯二=對一蹴不訪的91，* 列熊啟空慢去紳三狼延住的引精.重新靖臺上酢的引柳透行新一艙灌件反應(yīng)“）He，S8ps灌率儀.簞旗跋分 子不過，rl霍淘序.叫7酒加財81人文寡片收束通二與固定在芯片上的41互沖條文甚9厲/曲建 ，右片上,我發(fā)涌序芯片 4沃上壇12有63以后很出它，:在芯片上的仁 DNMR畬院檔靈光壇記第年模音戰(zhàn)冷 入i,引物上采集贄光1