Hb的醋酸纖維薄膜電泳課件

1、電泳： 指帶電膠體粒子或分子在電場的作用下，作定向移動。 由于各種物質(zhì)分子的等電點不同在同一P環(huán)境中所帶的電荷各不相同,再由于分子量、分子結(jié)構(gòu)、形狀大小各有差異，因此在同一電場中泳動速度也就不一樣。一般來說，所帶的電荷多而分子量小、形狀越接近球形者，泳動速度快，反之則慢。電泳：電泳技術(shù)的分類：主要歸納為； 1）顯微電泳即在顯微鏡下觀察膠體粒子或細(xì)胞的移動度，也稱細(xì)胞電泳。 2）自由電泳即懸浮在介質(zhì)中的細(xì)胞和生物大分子，在電場作用下自由定向移動。電泳技術(shù)的分類：主要歸納為； 1）顯微電泳即 3）區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支持物上進(jìn)行直接分離，鑒定生物物質(zhì)，促使獲得各自電荷差異的生物

2、粒子或分子形成各自區(qū)域以帯形停留在載體上。如：濾紙、淀粉、瓊脂、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等，此類 電泳技術(shù)分離技巧簡便，運(yùn)用十分廣泛。 4）免疫電泳：即抗原與抗體在比例合適的瓊脂糖載體中相結(jié)合的一種電免疫技術(shù)，親和電泳即屬此類。 3）區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支根據(jù)緩沖液的性質(zhì)不同可分為： 1.連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液的離子成分、PH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液相同，帶電顆粒電泳時僅具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。 2.不連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液離子成分、pH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液不盡相同，帶電顆粒電泳時具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。根據(jù)緩沖液的性質(zhì)不同可分為： 1.連續(xù)系統(tǒng)

3、：電泳緩沖液的離子 血紅蛋白（Hb) 的組成及分類： 血紅蛋白（Hb)：由亞鐵血紅素、珠蛋白 組成 。每個珠蛋白分子由4條多肽鏈構(gòu)成 ，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的不同可分為、四種類型。 血紅蛋白（Hb) 的組成及分類：正常成人Hb種類： 組成 百分含量 pIHbA 22 9598% 6.95HbA2 22 23% 7.38HbF 22 6.95 正常成人Hb種類：實驗原理(Experimental Principles)在pH8.6的環(huán)境中，Hb是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（Hb的pI 8.6），在電場中向正極泳動。電泳時，由于各種Hb等電點不同，所帶電荷量不同；分子量大小、形狀不同，導(dǎo)致各自的泳動速度不同，

4、因而被分離。這種分離可初步鑒定不同的Hb。實驗原理(Experimental Principles)在 醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙酰化后而制成的，浸濕后有巨大的張力和柔韌性，幾乎對所有生物活性物質(zhì)均能通過電泳得到分離。 醋酸纖維素薄膜電泳因設(shè)備簡單、操作方便、電泳時間短、分辨率高、區(qū)帶分離清晰、無拖尾、易定量等，已成為臨床、實驗室首選的方法。 醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙?；瘜嶒灢牧稀⒅饕獌x器和試劑（Equipments , Materials and Agents）1、試劑 0.9%的NaCl溶液；蒸餾水； 四氯化碳；碘酊；75%酒精；TEB緩沖液（pH8.6）；麗春紅染液

5、；漂洗液。2、實驗器材 醋酸纖維薄膜；濾紙；電泳儀；一次性穿刺針；消毒棉簽。實驗材料、主要儀器和試劑（Equipments , Mate操作步驟（Operating Procedure）1.取血： 用2%碘酊棉球消毒受試者手指，再用75%酒精棉球脫碘，采血針穿刺，取血約0.05ml放入事先已加入0.9%NaCl 1ml 的1.5ml離心管中。如出血不暢，可對手指稍加擠壓。操作步驟（Operating Procedure）1.取血：2.制備Hb液：1）洗滌紅細(xì)胞：將上述離心管，顛倒混勻5-6次，4000rpm，離心3分鐘。棄上清，再加1ml 0.9%NaCl懸浮紅細(xì)胞，相同條件重復(fù)離心一次。2）

6、溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水1 2滴，搖勻，再加入四氯化碳1滴，振蕩混勻，相同條件再離心一次，取上清即得Hb液。2.制備Hb液：3.電泳1）膜條準(zhǔn)備：2）點樣：取出平衡好的膜條，用濾紙吸去多余的液體，然后平鋪,（毛面朝上），用小玻片沾取適量Hb液，按印于點樣線上，點樣處離膜條邊緣1.5cm左右。3.電泳3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，膜條點樣面向下，上樣一端靠近負(fù)極，蓋嚴(yán)電泳室。通電預(yù)電泳5-10min。調(diào)節(jié)電壓為100V，電泳3040分鐘。4）染色：電泳完畢后關(guān)閉電源。將膜條取下，放在麗春紅染色液中染色10分鐘。5） 漂洗：取出染色膜條，放入漂洗液中漂洗至凝膠背景無色為止。3）電泳：在電泳

7、槽內(nèi)加入緩沖液，膜條點樣面向下，上樣一端靠近結(jié)果與分析：（Results and Analysis ） 觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深淺。繪圖紀(jì)錄之。 結(jié)果與分析：（Results and Analysis ） Hb的醋酸纖維薄膜電泳 臨床意義異常血紅蛋白： 指珠蛋白鏈中一個或數(shù)個氨 基酸被置換、缺失或增加，造成血紅蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常，導(dǎo)致一系列病理和生理改變。是常見的遺傳病之一. 人類異常血紅蛋白高達(dá)兩千多種類型，約300人中即有一人是異常血紅蛋白攜帶者。因此，在臨床上快速、早期診斷尤為重要。 臨床意義異常血紅蛋白：血紅蛋白病分類1.異常Hb?。?基因突變導(dǎo)致珠蛋白結(jié)構(gòu)改變.例如：鐮狀紅細(xì)胞貧血.形成原因： 鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代，形成HbS（鐮狀Hb)取代了正常的Hb。在缺氧情況下，HbS聚合形成長棒狀聚合物，使紅細(xì)胞鐮變,變形能力低，導(dǎo)致溶血、貧血，引起血粘度增高，血管梗阻性繼發(fā)癥狀。血紅蛋白病分類1.異常Hb?。喊l(fā)病的分子基礎(chǔ)是： 鏈基因的一個堿基對GAG變?yōu)镚TG，致使血紅蛋白的鏈N端第6位的谷氨酸被纈氨酸取代形成HbS。2.地中海貧血： 基因突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成缺乏或合成量異常，如、地貧。發(fā)病的分子基礎(chǔ)是： 地中海貧血是由于，珠蛋白基因缺失、突變導(dǎo)致某種珠蛋白鏈合成障礙，造成鏈和鏈合成數(shù)量不平衡，引