靈芝活性多糖的提取工藝研究

1、靈芝活性多糖的提取工藝研究【摘要】目確實(shí)立水提醇沉法與超聲提取法相結(jié)合提取靈芝活性多糖的最正確工藝。方法以脾細(xì)胞代謝TT活力為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對超聲時間、水提溫度和水提時間等因素進(jìn)展考察，尋求最正確的提取工藝。結(jié)果各因素對靈芝多糖脾細(xì)胞代謝TT活力的影響大小排列為:超聲時間水提溫度水提時間,超聲時間對靈芝多糖活性影響顯著。提取最正確工藝為：超聲提取時間20in，水提取溫度80，水提取時間2h。結(jié)論本工藝為提取活性靈芝多糖提供了一定的參考?！娟P(guān)鍵詞】靈芝多糖;脾細(xì)胞;提取工藝;正交試驗(yàn)Abstrat:bjetiveTexplreanptiuextratinpredure(aterextra

2、tinalhlpreipitatinandultrasniextratinethd)fativeplysaharidesfrGanderaluidu.ethdsByusinglrietriethylthiazlyltetrazliu(TT)assayfspleniellsfieasevaluatinindiatr,rthgnaltestasndutedtevaluateultrasniextratintie,aterextratinteperature,andaterextratintietexplretheptialextratinpredure.ResultsTheaininfluenin

3、gfatrsflrietriethylthiazlyltetrazliu(TT)assayfspleniellsfieereultrasniextratintie，aterextratinteperature，andaterextratintieinturn.Theptialnditinsfrthgnalexperient：ultrasniextratinfr20inutes,aterextratinat80fr2hurs.UltrasniextratintiehadsignifianteffetnextratinfativeplysaharidesfrGanderaluidu.nlusinT

4、hetehnlgyprvidedreferenesfrextratinfativeplysaharidesfrGanderaluidu.Keyrds:Ganderaluiduplysaharides;spleniells;extratinpredure;rthgnalexperients靈芝是我國傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，現(xiàn)代研究說明靈芝多糖是其主要活性成分之一，靈芝多糖具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用1，2。靈芝多糖提取方法有傳統(tǒng)的水提醇沉法3，4、超聲波法4-6、酶法，還有冷凍預(yù)處理法、超聲波催化纖維素酶法、超臨界萃取法等。靈芝多糖的活性在不同的提取工藝中變化很大，提取率高并不意味其有效活性高?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對靈

5、芝多糖提取工藝的研究未與其活性聯(lián)絡(luò)起來。本文擬采用水提醇沉法和超聲波法相結(jié)合提取靈芝活性多糖，應(yīng)用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，討論提取工藝中影響因素對多糖活性的影響，采用小鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測多糖的免疫活性，確立優(yōu)化的提取工藝。1實(shí)驗(yàn)材料1.1動物1.2材料靈芝(產(chǎn)地：廣西，批號：20220101，廣州市藥材公司中藥飲片廠)。1.3儀器1.4試劑95%乙醇(廣東廣寧縣葡萄糖藥業(yè)，批號：20221101);葡萄糖、硫酸等試劑均為分析純;重蒸苯酚(南方醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室);RPI1640培養(yǎng)基(GIB公司產(chǎn)品);噻唑蘭(TT)、nA(刀豆蛋白A)均為Siga公司產(chǎn)品。2方法2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報道，

6、超聲提取時間(因素A)、水提取溫度(因素B)、水提取時間(因素)對靈芝多糖的提取影響較大，最正確的提取條件在一定范圍之內(nèi)，超聲時間為2040in，提取時間為1.53h，提取溫度為801006-8。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)，本文正交試驗(yàn)對上述三因素，每個因素設(shè)三程度進(jìn)展考察，以脾細(xì)胞代謝TT活力作為考察指標(biāo)。根據(jù)正交試驗(yàn)的綜合評分選擇最正確方案。正交設(shè)計(jì)選用L9(34)正交表，見表1。2.2提取方法精細(xì)稱取靈芝粉50g置圓底燒瓶中，參加10倍量乙醇，70水浴回流30in作預(yù)處理，過濾，濾渣置圓底燒瓶中，參加15倍量水后按照正交程度表進(jìn)展試驗(yàn)，先進(jìn)展超聲(因素A)處理，超聲完成后，放入恒溫水浴器內(nèi)，按照提

7、取溫度(因素B)和時間(因素)條件的三程度平行操作，水提完成后過濾，濾液于210冷藏放置過夜，抽濾，濾液減壓濃縮至約100L，參加3倍量乙醇，210冷藏放置過夜，抽濾，沉淀用100L熱水溶解，水浴蒸至稍干后60恒溫枯燥，得水溶性粗多糖，精細(xì)稱量后計(jì)算多糖提取率和含量。表1正交試驗(yàn)的因素程度表2.3多糖的測定2.4脾細(xì)胞代謝TT活力測定取安康BALB/小鼠，脫頸椎處死，無菌取出脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,用含10%新生牛血清RPI1640培養(yǎng)液(以下簡稱全培)調(diào)整細(xì)胞濃度為8106個/L,在已加好待測樣品或者對照試劑的96孔板中每孔參加上述細(xì)胞懸液100L。使總體積為200L，置培養(yǎng)箱中在飽和濕度

8、、5%2、37條件下培養(yǎng)48h。小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)完畢前4h，每孔參加0.25%TT(生理鹽水配制)20L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后每孔加二甲基亞砜100L，振搖2in使TT的紫色復(fù)原產(chǎn)物完全溶解。最后用酶標(biāo)儀在570n處測定光密度，結(jié)果用570n處的吸光度值(A)表示。2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的正交設(shè)計(jì)方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果見表23。從表2中脾細(xì)胞代謝TT活力極差(R)可知，影響因素主次順序?yàn)锳B，各因素的最正確程度分別為A123，B123，213;從表3方差分析結(jié)果可見，除A因素對脾細(xì)胞代謝TT活力有顯著性影響外，其他因素均無顯著性

9、影響。綜合以上結(jié)果，確定最正確提取工藝為A1B12，即超聲提取時間20in，水提取溫度80，水提取時間2h。表2正交試驗(yàn)結(jié)果表3方差分析(根據(jù)多糖脾細(xì)胞代謝TT活力)4討論4.2超聲20in的脾細(xì)胞代謝TT活力比30in和40in的高。原因是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長時間作用使多糖構(gòu)造破壞，導(dǎo)致多糖活性下降。另外，超聲時間過長，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)溶出去雜質(zhì)時造成多糖損失，這也是多糖提取率有所下降的原因之一。4.3水提時間2h的脾細(xì)胞代謝TT活力比1h和3h的高;水提溫度80的脾細(xì)胞代謝TT活力比90和100的高。原因是提取時間增加，促進(jìn)細(xì)胞的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散，但隨著時間和溫度進(jìn)一步增加

10、，細(xì)胞破碎程度過大，長時間熱水提取，多糖分子容易受熱分解，使多糖活性有所下降。4.4有文獻(xiàn)報道有關(guān)靈芝多糖有水不溶性多糖、水溶性多糖、酸性多糖、堿性多糖等10，11。本文的提取工藝可能使一局部多糖，如水不溶性多糖，在乙醇的預(yù)處理和熱水提取后參加乙醇沉淀的過程中被棄去，得到的主要是水溶性多糖，因此這可能是本文實(shí)驗(yàn)中的靈芝多糖提取率比文獻(xiàn)報道8，10要低的原因之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1戴那么林，董昌武.靈芝多糖的生物活性研究進(jìn)展J.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2022，24(5):60-62.2寧安紅，曹婧，黃敏等.靈芝多糖對荷瘤小鼠腫瘤免疫系統(tǒng)的影響J.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2022，16(1):16-17.3李艷，趙海燕，率建寧.靈芝多糖提取工藝研究J.中成藥，2022，28(7):1052-1054.4胡斌杰，陳金鋒，王宮南.超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比擬研究J.食品工業(yè)科技，2022，28(2):190-192.5郭孝武.超聲技術(shù)在中草藥成分提取中的應(yīng)用J.中草藥，1993，24(10):548.6徐凌川，張華，許興盛，等.超聲波提取靈芝多糖的最正確工藝討論J.中國中藥雜志，2022，30(6):471-472.7劉英梅，李春華，陳鴻雁.靈芝孢子粉中多糖提取工藝的研究J.中成藥，2022，28(3):332-335.8羅立新，姚汝華，周少奇.靈芝多糖的別離與純化J.食品工業(yè)科技，19