蛋白酶輔助法腐乳發(fā)酵工藝優(yōu)化和理化性質(zhì)分析

1、PAGE 11 -蛋白酶輔助法腐乳發(fā)酵工藝優(yōu)化和理化性質(zhì)分析腐乳是我國(guó)具有民族特色的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品，因其味道鮮美，具有抗氧化和降血壓等保健功能，深受消費(fèi)者歡迎1-3。腐乳的發(fā)酵過(guò)程分為前發(fā)酵和后發(fā)酵4，其中主要發(fā)生了生物化學(xué)和物理化學(xué)變化5。腐乳的前發(fā)酵是培養(yǎng)菌系和積累酶系的過(guò)程，一般為3648h；后發(fā)酵是酶系作用于腐乳毛坯的過(guò)程，其毛坯中毛霉分泌蛋白酶降解大豆蛋白，從而破壞凝膠結(jié)構(gòu)使其質(zhì)地軟化并產(chǎn)生大量游離氨基酸等。該過(guò)程需要較長(zhǎng)的后熟時(shí)間，一般為36個(gè)月，因此制約了其在我國(guó)的工業(yè)化生產(chǎn)6-7。近年來(lái)，針對(duì)縮短腐乳生產(chǎn)周期的研究較多。其中，在后發(fā)酵階段直接加入外源蛋白酶是一種較便捷的方法。

2、此外，腐乳后發(fā)酵溫度也在很大程度上影響腐乳的發(fā)酵周期，而如今對(duì)酶法輔助腐乳發(fā)酵中溫度影響的研究較少。本研究通過(guò)控制酶促腐乳后發(fā)酵的溫度，對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)變化進(jìn)行研究，了解溫度對(duì)蛋白酶輔助腐乳發(fā)酵的影響，旨在為優(yōu)化酶促腐乳工藝提供一定的理論和應(yīng)用依據(jù)。1材料與方法1.1材料與儀器鹽鹵型豆腐、食鹽、白酒(均為食品級(jí))，市售；雅致放射性毛霉菌粉，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(活性單位：1105U，均為食品級(jí))，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉、乙酰丙酮、硫酸銨、37%甲醛，阿拉丁工業(yè)公司。恒溫培養(yǎng)箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；冷凍干燥機(jī)，美

3、國(guó)Labconco公司；糖度儀，ATAGO(愛(ài)拓)中國(guó)分公司；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；組織研磨儀，上海凈信科技。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1酶促腐乳的生物釀制將鹽鹵型老豆腐切成約2cm2.5cm2.5cm的小塊，噴灑雅致放射毛霉菌懸液至終濃度約為1107CFU/mL，在25下前發(fā)酵3d后搓毛；毛坯稱(chēng)重后，按質(zhì)量比加入10%的食鹽腌制22h，制得咸坯；咸坯稱(chēng)重后，均勻分成11份，根據(jù)表1加入不同外源蛋白酶處理并裝瓶，其總添加量為腐乳總蛋白的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；最后加入10%食用乙醇至完全浸泡咸坯后加蓋密封，分別在20、30、37、50下后發(fā)酵2

4、0d8。表1添加外源蛋白酶樣品分組Table1Groupingofsampleswithexogenousprotease1.2.2腐乳的樣品采集及預(yù)處理樣品采集：每個(gè)酶促腐乳樣品的前發(fā)酵全部天數(shù)以及后發(fā)酵1、2、3、5、10、20d中取樣用于理化特性分析。預(yù)處理：將腐乳在無(wú)菌條件下進(jìn)行取樣，于-18冰箱保存待用；取固體樣品于-80超低溫冰箱中冷凍24h，于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24h，將干燥好的樣品碾碎過(guò)40目篩，進(jìn)行稱(chēng)重、研磨、離心并取上清液為液體樣品于4冰箱保存，現(xiàn)配現(xiàn)用9-10。1.2.3腐乳的pH值和可溶性固形物含量測(cè)定pH計(jì)測(cè)定腐乳樣品pH值，并使用ATAGO數(shù)顯糖度儀測(cè)定液體樣品的

5、可溶性固形物含量。1.2.4腐乳的氨基態(tài)氮含量測(cè)定精密吸取氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL管中，向各管分別加入4mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4mL顯色劑，用水稀釋至刻度并混勻。置于100水浴中加熱15min，取出后水浴冷卻至室溫并于400nm處測(cè)量吸光度，以氨氮含量(g)為橫坐標(biāo)，OD400為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品稀釋液于相同操作測(cè)量吸光度，從而計(jì)算樣品含量11，計(jì)算如公式(1)所示：(1)式中：X，氨基酸態(tài)氮含量，mg/g；m，氮的質(zhì)量，g；V，吸取試樣的體積，mL；V1，測(cè)定用試樣的體積，mL；V2，試樣前處理中的定容體積，

6、mL；0.01，樣品含量，mL/mg；100，單位換算系數(shù)。1.2.5統(tǒng)計(jì)分析方法所有試樣測(cè)定3個(gè)平行樣品，并采用Excel2022和Origin8.6軟件進(jìn)行作圖。2結(jié)果與分析2.1不同溫度發(fā)酵過(guò)程中腐乳樣品氨基態(tài)氮變化不同發(fā)酵工藝的腐乳產(chǎn)品品質(zhì)差異較大。其中，氨基態(tài)氮與游離氨基酸含量成正比關(guān)系，是腐乳成熟的重要指標(biāo)12-15。本研究通過(guò)控制不同后發(fā)酵溫度，分析其對(duì)酶促腐乳氨基態(tài)氮含量的影響。圖1圖4結(jié)果顯示，在發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中，腐乳的氨基態(tài)氮含量先上升后趨于穩(wěn)定。根據(jù)國(guó)內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T101702022腐乳的規(guī)定11,白腐乳的氨基態(tài)氮含量不小于0.35%，其中各組腐乳后發(fā)酵20d均符

7、合該標(biāo)準(zhǔn)。前發(fā)酵階段，毛霉生長(zhǎng)旺盛且產(chǎn)生大量蛋白酶，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量激增12；后發(fā)酵初期，由于鹽分的滲透和水分的析出以及對(duì)測(cè)定方法的影響，鹽坯中氨基態(tài)氮含量呈急劇下降；后發(fā)酵310d時(shí)，坯體中氨基態(tài)氮含量整體呈上升趨勢(shì)，主要?dú)w因于前發(fā)酵時(shí)毛霉產(chǎn)生的蛋白酶繼續(xù)分解蛋白質(zhì)成多肽，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量持續(xù)增加；在后發(fā)酵1020d時(shí)，由于水解產(chǎn)物的累積、鹽抑制使蛋白酶活力下降，蛋白質(zhì)酶解作用減弱，氨基態(tài)氮含量基本處于波動(dòng)平穩(wěn)狀態(tài)16。2.1.120后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化控制后發(fā)酵溫度為20屬于低溫發(fā)酵，低溫發(fā)酵有助于控制生物安全性以及腐乳的酸敗，減少對(duì)后發(fā)酵階段高鹽條件的依賴(lài)17，但同時(shí)會(huì)降低發(fā)

8、酵過(guò)程中的產(chǎn)酶水平和酶活性，延長(zhǎng)腐乳成熟周期從而不利于其生產(chǎn)效率。圖1顯示，對(duì)照組樣品的氨基態(tài)氮含量上升極為緩慢，后發(fā)酵20d其氨基態(tài)氮含量最低僅有4.33mg/g。同樣條件下，各酶促腐乳組別氨基態(tài)氮含量均比對(duì)照組高。多組腐乳氨基態(tài)氮在20d左右達(dá)到9mg/g以上，基本發(fā)酵成熟4。其中第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別達(dá)到9.60、9.51mg/g。結(jié)果顯示，添加外源蛋白酶有效解決了低溫蛋白質(zhì)降解和腐乳熟化的問(wèn)題，證明了腐乳的酶法輔助低溫發(fā)酵工藝的可行性，為腐乳發(fā)酵工藝研究提供了新的方向。圖120后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化Fig.1

9、Changesofaminonitrogencontentinsufusamplespost-fermentedat202.1.230后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化由圖2顯示，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量存在一定差異。其中，第2組(4%堿性蛋白酶)和第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別為9.51、9.02mg/g，最低為對(duì)照組僅有4.26mg/g。后發(fā)酵溫度的升高對(duì)腐乳中氨基態(tài)氮含量起促進(jìn)作用2，而30下各組腐乳的氨基態(tài)氮含量變化趨勢(shì)與20條件下相近甚至相對(duì)較低，推測(cè)使用不同批次腐乳使得結(jié)果受到一定程度的影響。圖230后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化Fig.2Ch

10、angesofaminonitrogencontentinsufusamplespost-fermentedat302.1.337后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化由圖3可得，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量呈快速上升趨勢(shì)，在后發(fā)酵10d左右其氨基態(tài)氮含量均已達(dá)標(biāo)且腐乳已基本成熟，之后均趨于平緩。37后發(fā)酵溫度接近復(fù)合蛋白酶的最佳溫度，活性達(dá)到最佳狀態(tài)，也使腐乳中蛋白質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)疏松，從而暴露出更多的酶作用位點(diǎn)17-18。各組腐乳氨基態(tài)氮含量仍存在一定差異。其中，第9組(2%堿性蛋白酶+2%木瓜蛋白酶)氨基態(tài)氮含量最高達(dá)到12.27mg/g，對(duì)照組僅為4.26mg/g，表明在37后發(fā)酵溫度下添加外源

11、蛋白酶對(duì)腐乳成熟起到極大的促進(jìn)作用，縮短了發(fā)酵周期使得發(fā)酵12d左右氨基態(tài)氮含量達(dá)到較穩(wěn)定狀態(tài)。圖337后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化Fig.3Changesofaminonitrogencontentinsufusamplespost-fermentedat372.1.450后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化由圖4可得，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量上升較緩并存在下降趨勢(shì)，相較于后發(fā)酵溫度為37的氨基態(tài)氮含量少。后發(fā)酵溫度50屬于高溫發(fā)酵，高溫導(dǎo)致酶蛋白發(fā)生部分變性，從而使反應(yīng)速率有所下降19；另外，高溫還會(huì)影響氨基化合物如氨基酸和多肽等的穩(wěn)定性和其他化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量的下降，體

12、現(xiàn)在多組腐乳樣品在后發(fā)酵1020d的氨基態(tài)氮含量均有明顯的下降趨勢(shì)。各組腐乳氨基態(tài)氮含量變化趨勢(shì)較雜亂，但添加外源蛋白酶的組別氨基態(tài)氮含量仍高于對(duì)照組。其中，第8組(2%堿性蛋白酶+2%胰蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別達(dá)到10.50、10.35mg/g，對(duì)照組最低為4.65mg/g。圖450后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化Fig.4Changesofaminonitrogencontentinsufusamplespost-fermentedat50結(jié)果表明，添加外源蛋白酶的組別氨基態(tài)氮含量均高于不加酶的對(duì)照組，有利于縮短腐乳生產(chǎn)周期。在一定范圍內(nèi)，隨著后發(fā)酵溫度的

13、升高，氨基態(tài)氮含量有明顯的增加。通過(guò)不同酶處理，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)低溫有更好的適應(yīng)性，在20、30后發(fā)酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用；而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對(duì)較高，更適于37、50后發(fā)酵條件，且復(fù)合酶的效果優(yōu)于單一酶作用。2.2不同溫度發(fā)酵過(guò)程中腐乳樣品pH變化發(fā)酵過(guò)程中pH值是微生物在特定環(huán)境下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，影響腐乳pH值變化的因素主要有氨基態(tài)氮含量和總酸含量19。從圖5可以看出，腐乳的發(fā)酵過(guò)程總體呈先下降后上升再下降后平穩(wěn)趨勢(shì)，且不同發(fā)酵溫度下各組pH值的變化規(guī)律基本一致20-21。前發(fā)酵階段，pH值先下降后迅速升高，初期毛霉處于生長(zhǎng)延滯期豆腐水分被消耗導(dǎo)致pH

14、下降，之后毛霉基本處于生長(zhǎng)平穩(wěn)期，大量毛霉菌體生長(zhǎng)消耗了以豆腐為基礎(chǔ)的碳源和氮源，生成了諸如生物胺等的堿性物質(zhì)導(dǎo)致pH升高。后發(fā)酵階段，毛霉產(chǎn)生大量蛋白酶分解蛋白生成各種酸性氨基酸以及碳水化合物、脂肪酸的分解，乳酸菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸導(dǎo)致pH值呈下降趨勢(shì)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，水解產(chǎn)物氨基酸的進(jìn)一步脫氨基作用產(chǎn)生氨22,對(duì)pH值產(chǎn)生一定的影響。由圖5-a和圖5-b可得，其pH值最終分別穩(wěn)定在6.06.4，在酶法輔助腐乳低溫發(fā)酵條件下，各組腐乳pH值均符合標(biāo)準(zhǔn)；由圖5-c顯示，37后發(fā)酵溫度下各組腐乳pH值穩(wěn)定在5.86.2；而圖5-d中50后發(fā)酵溫度各組pH值則穩(wěn)定在5.5左右。

15、a-后發(fā)酵溫度20；b-后發(fā)酵溫度30；c-后發(fā)酵溫度37；d-后發(fā)酵溫度50圖5不同蛋白酶處理腐乳pH的變化Fig.5ChangesofpHinsufutreatedwithdifferentproteases結(jié)果表明，不同后發(fā)酵溫度下腐乳的pH始終呈酸性，且酶促腐乳組別的pH值一般高于對(duì)照組，這是由于外源蛋白酶的添加可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物氨基酸快速分解，使得pH升高23-24。隨著后發(fā)酵溫度的增加，腐乳pH值有下降趨勢(shì)，可能的原因包括在高溫下易滋生細(xì)菌產(chǎn)生多種酸性雜質(zhì)，以及高溫條件下氨基化合物的分解等。此外，在酶促腐乳低溫發(fā)酵下，保證了腐乳的酸度以及安全性；而在高溫條件下，大大增加了腐乳的

16、酸性。2.3不同溫度發(fā)酵過(guò)程中腐乳樣品可溶性固形物變化可溶性固形物是腐乳滋味的主要來(lái)源，跟蹤檢測(cè)腐乳發(fā)酵過(guò)程中的可溶性固形物含量對(duì)于判斷腐乳的成熟有重要意義25。由圖6可知，腐乳可溶性固形物含量整體呈波動(dòng)上升后平穩(wěn)趨勢(shì)，且不同溫度下可溶性固形物含量變化規(guī)律趨于一致。前發(fā)酵階段，毛霉在大量累積蛋白酶，故可溶性固形物含量趨于平穩(wěn)且緩慢增加。后發(fā)酵初期，腐乳中的不溶性物質(zhì)被蛋白酶分解生成水溶性物質(zhì)；后發(fā)酵后期，水解產(chǎn)物的累積以及原料的減少使得蛋白酶活性受到抑制，使得可溶性固形物含量變化趨于平穩(wěn)。不同后發(fā)酵溫度處理下樣品中可溶性固形物含量最高均處于6.0%6.4%，最低為對(duì)照組均僅有4.3%4.8%。

17、其中，中性蛋白酶和堿性蛋白酶體現(xiàn)了其促熟的優(yōu)越性。結(jié)果表明，酶促腐乳組由于外源蛋白酶分解了更多的不溶性蛋白質(zhì)，從而使得酶促腐乳組可溶性固形物含量均高于對(duì)照組；可溶性固形物包括糖、氨基酸、脂肪酸等，故可溶性固形物含量的變化規(guī)律與氨基態(tài)氮含量具有相似性。a-后發(fā)酵溫度20；b-后發(fā)酵溫度30；c-后發(fā)酵溫度37；d-后發(fā)酵溫度50圖6不同蛋白酶處理腐乳可溶性固形物的變化Fig.6Changesofsolublesolidsinsufutreatedwithdifferentproteases3結(jié)論與討論研究結(jié)果顯示，可溶性固形物與氨基態(tài)氮含量變化規(guī)律具有相似性，各酶促腐乳組別均高于不加酶的對(duì)照組。不同溫度下，氨基態(tài)氮含量最高分別達(dá)到9.6、9.57、12.27、10.50mg/g，最低為4.264.65mg/g，最高含量為最低含量的23倍左右；可溶性固形物含量最高在6.0%6.4%，最低在4.3%4.8%，表明外源蛋白酶的添加有利于縮短發(fā)酵周期，利用添加外源蛋白酶來(lái)優(yōu)化腐乳發(fā)酵工藝具有一定的可行性。隨著發(fā)酵溫度的升高，兩者均有上升趨勢(shì)，但在高溫條件下會(huì)影響酶活性，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量降低。對(duì)比不同后發(fā)酵溫度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)低溫有更好的適應(yīng)性，在20、30后發(fā)酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用，而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對(duì)較高，更適于37、5