還原型谷胱甘肽對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用

1、復(fù)原型谷胱甘肽對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用【摘要】目的研究復(fù)原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(VILI)的保護(hù)作用。方法24只安康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組n=8),A組為自主呼吸組;B組為大潮氣量機(jī)械通氣組;組為大潮氣量機(jī)械通氣加GSH處理組。B、2組呼吸參數(shù)：潮氣量(VT)=30l/kg、頻率(P)為40次/in、通氣時(shí)間為4h。每小時(shí)行1次動(dòng)脈血?dú)夥治?計(jì)算氧合指數(shù)(Pa2/Fi2)。實(shí)驗(yàn)完畢搜集肺組織和肺灌洗液標(biāo)本。光鏡觀察肺組織病理形態(tài)改變,免疫組化檢測(cè)Fas/FasL蛋白,檢測(cè)肺濕/干重比(/D)、肺組織丙二醛(DA)、超氧化物歧化酶(SD)、肺灌洗液中白細(xì)

2、胞計(jì)數(shù)、腫瘤壞死因子(TNF-)和蛋白總量。結(jié)果和A組比擬，B組肺組織病理學(xué)改變明顯,Fas/FasL蛋白增加,/D、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(B)、TNF-、DA等指標(biāo)升高，而SD及通氣3h以后Pa2/Fi2下降;和B組比擬,組肺組織病理學(xué)改變明顯減輕,Fas/FasL蛋白質(zhì)量減少,/D、B、TNF-、DA等指標(biāo)降低，SD、Pa2/Fi2上升。結(jié)論GSH對(duì)VILI有一定的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷;機(jī)械通氣;復(fù)原型谷胱甘肽Abstrat：bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetsfreduedglutathinenventilatr-induedlunginjur

3、y(VILI)inrats.ethds24aleSprague-Daleyratsererandlydividedint3grups(n=8eah):grupAreEivedrairithutehanialventilatin;grupBreEIvedehanialventilatinflargetidalvlue(VT)ithrair;grupastreatedithehanialventilatinflargetidalvlueithrairplusreduedglutathine.ThesetparaetersfehanialventilatiningrupsBand:VT=30l/kg

4、,breathingrate=40ties/in,andtiefventilatin=4h.Arterialbldgasesereeasuredhurlytalulatexygenatinindex(Pa2/Fi2).Ratseresarifiedandthelunglavageliquidandlungtissueerelletedandstredithrretethds.Theeasuredindexesinludingttalprtein,BsandTNF-inbrnhalvelarlavagefluid(BALF),et-t-dryeightrati(/D)flung,alndiald

5、ehyde(DA)andsuperxidedisutase(SD)levelsinthelungereassayed,respetively.LungpathlgialhangesandtheexpressinsfFas/FasLprteinserebservedbyirspy.ResultsparedithgrupA,ttalprtein,/D,Bs,TNF-,DAandtheexpressinfFas/FasLprteinssignifiantlyinreasedingrupB,hilethelevelsfSD,andPa2/Fi2at3hafterventilatinsignifiant

6、lydereased.paredithgrupB,ttalprtein,/D,Bs,TNF-,DAandexpressinsfFas/FasLprteinsdereasedingrup,andthelevelsfSDandPa2/Fi2inreased.nlusinReduedglutathinehasertainprtetiveeffetnventilatr-induedlunginjury.Keyrds:ventilatr-induedlunginjury;ehanialventilatin;reduedglutathine呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilatr-induedlunginj

7、ury,VILI)是肺功能嚴(yán)重受損的患者行機(jī)械通氣支持治療時(shí)的常見并發(fā)癥;其發(fā)生率高達(dá)15%。而且長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)增加急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(DS)的發(fā)生率。VILI本質(zhì)上是一種生物傷1，近些年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。其致病機(jī)制之一可能是由于過度的機(jī)械刺激引起肺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，從而激活多種和炎癥親密相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使各種致炎因子的表達(dá)增多,引起炎性細(xì)胞在肺組織“募集,從而造成肺損傷。因此，抗氧化劑可能對(duì)各類急性肺損傷有一定的保護(hù)作用。復(fù)原型谷胱甘肽(GSH)2是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以通過P38和JNK信號(hào)通路抑制促炎因子和去除機(jī)體內(nèi)氧化物質(zhì)

8、。有研究說明GSH能明顯減輕大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷3。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠VILI為模型，研究GSH對(duì)大鼠VILI的保護(hù)作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物準(zhǔn)備安康雄性清潔級(jí)SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)24只，體重(30020)g。10%水合氯醛(300g/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后,氣管切開及插入自制氣管導(dǎo)管;行尾靜脈穿刺保持靜脈通道;行右頸內(nèi)動(dòng)脈置管，以4U/(lh)速度輸注肝素維持動(dòng)脈通暢，每小時(shí)行1次血?dú)夥治觯看稳⊙髲奈察o脈補(bǔ)充注入等容量的膠體液以維持近似恒定的血容量;體溫維持在3738。1.2實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型24只大鼠隨機(jī)分為3組,每組8只。自主呼吸組(A組);大潮氣量機(jī)

9、械通氣組(B組),維庫(kù)溴銨1g/(lh)靜脈輸注抑制自主呼吸、維持肌松,接小動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠,DH-150型)開場(chǎng)機(jī)械通氣。呼吸參數(shù)設(shè)定：呼吸頻率40次/in,通氣時(shí)間4h，吸呼比(IE)=13，呼氣末正壓通氣(PEEP)=0，潮氣量(VT)=30l/kg;根據(jù)體重調(diào)節(jié)VT;大潮氣量機(jī)械通氣加GSH處理組(組)，機(jī)械通氣開場(chǎng)前30in從尾靜脈注射GSH90g/kg，A、B2組給予等量的生理鹽水，呼吸參數(shù)同B組。大鼠大潮氣量損傷性機(jī)械通氣的動(dòng)物模型是參考武慶平等4的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究并稍作修改制備的。1.3標(biāo)本采集通氣4h后,頸動(dòng)脈放血處死大鼠。開胸取出肺臟,取1小塊右上葉肺組織用作病理

10、學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè),取右中葉肺稱重;剩余右肺制成肺組織勻漿液:按每100g肺組織參加0.9lPBS(pH7.4),在冰浴下用組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿。左肺用4生理鹽水行支氣管肺泡灌洗,每次灌洗量為2l,共灌洗3次,回收率大于90%，搜集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺勻漿液分別于4，3000r/in離心15in,取上清-70凍存;BALF離心后沉淀，用1l生理鹽水稀釋行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法1.4.2BALF中總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法,用UV-2401型分光光度計(jì)測(cè)量光密度。1.4.3肺濕/干重比值(/D)取右中葉肺組織稱濕重后置于烤箱中,70烘烤至恒重后稱干重,計(jì)算

11、肺/D比值。1.4.4BALF中TNF-含量試劑盒由深圳晶美生物工程提供。采用雙抗體夾心ELISA法，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)展。先在酶標(biāo)儀上測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品光密度并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后測(cè)量樣品光密度,并根據(jù)測(cè)得的光密度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的濃度(ng/L)。1.4.5肺組織Fas/FasL蛋白表達(dá)試劑盒由武漢博士德公司提供。肺組織經(jīng)石蠟包埋切片免疫組化采用SAB法，DAB顯色，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)展。采用IagePr-plus6.0細(xì)胞圖像分析儀分析圖像。在顯微鏡(400)下以一樣外部條件(亮度)每張切片選擇10個(gè)視野，設(shè)定灰度值50250，計(jì)算平均灰度值。1.4.6肺組織SD和DA含量試

12、劑盒由南京建成生物工程研究所提供。分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)展。用UV-2401型分光光度計(jì)測(cè)量光密度。1.4.7氧合指數(shù)(Pa2/Fi2)是指動(dòng)脈血氧分壓與吸入氧氣濃度的比值，正常值應(yīng)大于300，是反映換氣功能較直接的指標(biāo),可動(dòng)態(tài)反映患者的換氣功能。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展單因素方差分析，兩兩比擬采用q檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果A.A組;B.B組;.組2.2Pa2/Fi2肺/D、DA、SD、BALF中總蛋白量、B和TNF-含量的變化和A組比擬,B組通氣3h以后Pa2/Fi2均下降(P0.05

13、)，肺/D、DA、BALF總蛋白量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和TNF-等各項(xiàng)指標(biāo)均增高(P0.05),SD下降(P0.05);組通氣3h以后Pa2/Fi2高于B組(P0.05)，肺/D、DA、BALF中總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和TNF-等各項(xiàng)指標(biāo)均低于B組(P0.05),SD高于B組(P0.05)。見表1、2。表1各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Pa2/Fi2的變化與A組比擬:*P0.05;與B組比擬:P0.05表2各組大鼠BALF中總蛋白含量、B、TNF-，肺/D和肺組織DA、SD的比擬與A組比擬:*P0.05;與B組比擬:P0.052.3肺組織Fas/FasL蛋白的表達(dá)2種蛋白表達(dá)陽(yáng)性反響物質(zhì)呈棕黃色,主要位于細(xì)胞質(zhì)中;陽(yáng)

14、性表達(dá)細(xì)胞為支氣管黏膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞(圖2、3);免疫組化半定量結(jié)果:B組Fas/FasL蛋白表達(dá)明顯高于A組(P0.05),組那么低于B組(P0.05)。見表3。圖2SP法檢測(cè)3組Fas蛋白表達(dá)(DAB染色，400)表3各組大鼠Fas、FasL蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論在急性肺損傷/ARDS患者治療過程中常需要機(jī)械通氣,然而機(jī)械通氣也是導(dǎo)致急性肺損傷發(fā)病的機(jī)制之一，其致病機(jī)制非常復(fù)雜，包括氧化-抗氧化失衡在內(nèi)的眾多機(jī)制都會(huì)增加VILI的敏感性。hess等5和Haershidt等6研究機(jī)械通氣可以加重肺的氧化應(yīng)激反響，產(chǎn)生多種氧化物質(zhì)。一系列研究說明2，7-9氧化

15、應(yīng)激狀態(tài)下的肺組織細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化失衡如GSH氧化復(fù)原系統(tǒng)，GSH氧化型增加而復(fù)原型減少，可以通過P38和JNK信號(hào)通路釋放出大量促炎因子和氧化物質(zhì)，抗氧化物質(zhì)減少;使機(jī)體去除氧化物質(zhì)(如H22)才能減弱，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而加重肺組織細(xì)胞損傷。同時(shí),炎癥因子能募集中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔,分泌蛋白酶類和大量活性氧類,釋放炎癥介質(zhì),造成肺泡毛細(xì)血管屏障的通透性增加,導(dǎo)致肺內(nèi)炎癥反響,進(jìn)一步加重組織細(xì)胞損害1。盡管已經(jīng)研究出許多不同的通氣策略降低VILI的發(fā)生率,但它仍然是嚴(yán)重呼吸衰竭治療過程中的一個(gè)重大問題。近年來(lái),越來(lái)越多的研究致力于探究新的藥物治療生物傷方法。GSH是人體內(nèi)重要的抗氧化劑之一，

16、是GSH氧化復(fù)原系統(tǒng)的組成部分，GSH有氧化型和復(fù)原型2種形式,可以互變11。該系統(tǒng)具有對(duì)抗氧自由基、保護(hù)肺組織免受氧化損傷的作用,被稱為組織抗氧化系統(tǒng)。劉慶輝等12研究說明使用GSH前體N-乙酰半胱甘酸對(duì)VILI有保護(hù)作用。Hartl等13研究說明氣道吸入GSH對(duì)肺的纖維化有保護(hù)作用。大鼠大潮氣量機(jī)械通氣致肺損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是模擬臨床上急性肺損傷/ARDS患者需要大潮氣量通氣治療以及此類患者可能會(huì)發(fā)生嬰兒肺13，即使采用小潮氣量通氣，但由于部分肺不張等原因在肺其他正常部位也會(huì)產(chǎn)生像大潮氣量通氣引起的肺損傷。Fas/FasL蛋白表達(dá)、肺/D、Pa2/Fi2、BALF總蛋白可反映肺受損以及肺水腫的

17、程度;B、TNF-可反映白細(xì)胞的浸潤(rùn)以及炎癥反響的程度;DA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,是檢測(cè)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的客觀指標(biāo)。SD在體內(nèi)能去除生物氧化產(chǎn)生的自由基而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，B組大潮氣量機(jī)械通氣產(chǎn)生了明顯的肺損傷,機(jī)體抗氧化應(yīng)激才能下降,同時(shí)Fas/FasL參與了肺損傷過程。和B組相比,組大鼠抗氧化才能增強(qiáng)，F(xiàn)as/FasL表達(dá)下降,機(jī)械通氣所致的肺損傷有所減輕，但重于A組。說明GSH可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化才能，抑制組織脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,減少Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡，減輕組織水腫及中性粒細(xì)胞的聚集，對(duì)肺組織有一定的保護(hù)作用。其可能的作用機(jī)制:急性肺損傷時(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng),GSH在

18、血中、肺泡上皮襯液及肺部其他細(xì)胞中含量降低3，14。靜脈使用GSH增加肺細(xì)胞內(nèi)外GSH含量，去除氧化產(chǎn)物，可能通過抑制P38和JNK通路抑制炎癥遞質(zhì)的釋放，減輕炎癥反響;同時(shí)可能通過影響Fas/FasL抑制凋亡，減少肺和毛細(xì)血管的損傷。上述結(jié)果說明GSH對(duì)大鼠VILI具有一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與氧化、凋亡有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)沒有觀察VILI大鼠遠(yuǎn)期存活率及其作用的詳細(xì)相關(guān)信號(hào)通路，仍需要進(jìn)一步深化研究。【參考文獻(xiàn)】1HalbertsaFJ,Vaneker,ShefferGJ,etal.ytkinesandbitrauainventilatr-induedlunginjury:aritialr

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