β射線內(nèi)照射對人增生前列腺細胞凋亡的阻礙

1、射線內(nèi)照射對人增生前列腺細胞凋亡的阻礙谷欣權(quán) 曹霞 孔祥波 馬慶杰【摘要】 目的 探討射線內(nèi)照射對人增生前列腺細胞凋亡的阻礙。方式 20 例前列腺增生 (BPH)患者隨機分為 4 組：對照組未行內(nèi)照射， 3 組照射組于前列腺切除術(shù)前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射線內(nèi)照射，采納 TUNEL染色、流式細胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳檢測前列腺細胞凋亡轉(zhuǎn)變。結(jié)果 與對照組比較， 射線內(nèi)照射后前列腺細胞凋亡增多，并隨時刻延長而增加（ P），對照組基因組DNA維持完整，射線輻射7 d 后基因組 DNA呈現(xiàn)梯狀帶凋亡改變。結(jié)論射線內(nèi)照射能夠有效誘發(fā)人增生的前列腺細胞凋亡，進而引發(fā)前列腺組織萎縮。【關鍵詞

2、】前列腺增生；電離輻射；細胞凋亡【 Abstract】ObjectiveTo investigatetheeffectofirradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatictissues.Methods 20 patientswithbenign prostatichyperplasia(BPH) were dividedinto4 groups accordingto the differenttimetreated with 90Sr/90Y irradiation to prostatic hyperplasia a

3、pplicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of humanhyperplastic prostatic tissues was detected by TUNELandflow cytometryand agarose gelCompared with control group, thepercentageofcellapoptosisarose aftertreatedwith90Sr/90Y irradiation and grew more with time going (P. DNA keptcomplet

4、eincontrolgroup while typicalDNAladderband appearedin DNA fragment electrophoresis and the positive cells thatpresentedbrowedwere observed in irradiation7 group.Conclusions rays irradiation can efficiently induce cellapoptosisfrom humanprostatichyperplasiatissueand cause theatrophy of prostatic tiss

5、ue.【 Key words 】Benignprostatichyperplasia； Radiation；Apoptosis細胞凋亡在前列腺增生（BPH）的發(fā)生、進展中具有關鍵性作用1，2。電離輻射作為一種基因毒素，除可使前列腺組織中與細胞凋亡相關的基因和細胞因子發(fā)生改變外，還能直接或間接引發(fā) DNA損傷而誘發(fā)凋亡 3，4。本實驗采納 TUNEL染色、流式細胞術(shù)（ FCM）和瓊脂糖凝膠電泳檢測射線內(nèi)照射對增生前列腺細胞凋亡的阻礙，為采納電離輻射醫(yī)治 BPH提供實驗依據(jù)。材料與方式實驗分組 BPH患者 20 例，年齡 5872 歲，病程 213 年，患者隨機分為 4 組，每組 5 例： 3 個

6、照射組于前列腺切除術(shù)前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射線內(nèi)照射，照射劑量為 3050 Gy，對照組未行內(nèi)照射。各組均行經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)或經(jīng)膀胱前列腺摘除術(shù)取得前列腺標本。TUNEL 染色檢測細胞凋亡4%多聚甲醛固定前列腺組織46 h，石蠟包埋。切片加蛋白酶K 37消化 5 min，TBS洗滌。加含有TdT和 DIGdUTP的標記液 20 l/ 片， 37標記 2 h ，TBS洗滌 2 min 3次。加封鎖液 50 l/ 片室溫 30 min，加封鎖液 1100 稀釋生物素化抗地高辛抗體 50 l/ 片， 37反映 30 min，TBS洗滌。加 SABC37 反映 60 min ，T

7、BS洗滌。 DAB顯色 15 min ，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下凋亡陽性細胞核呈深淺不一的棕黃色，正常細胞核呈藍色，在每張切片上隨機選取 10 個高倍鏡視野， 計陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算陽性反映細胞數(shù)占細胞總數(shù)的平均百分比。FCM 檢測凋亡細胞 DNA含量 新鮮組織研磨成單細胞， 70%冷乙醇固定， 4留宿。 600 r/min 離心 5 min ，棄上清，加 mol/L PBS 5 ml ，混勻 1 500 r/min 離心，棄上清，反復 3 次。用 PBS調(diào)整細胞濃度 106/ml ，過 350 目濾網(wǎng)，制成單細胞懸液，加入濃度 200 g/ml 的 RNase A，3

8、7水浴 30 min，加入低滲熒光染料溶液混勻， 4避光染色 30 min。用流式細胞儀攝取 PI 熒光，測凋亡細胞核百分率。DNA 瓊脂糖凝膠電泳 組織研碎后，離心去上清，加入 10 倍體積的DNA抽提液混勻， 37水浴 1 h，加入蛋白酶 K，50水浴 3 h，12 000 r/min 離心 5 min，用飽和苯酚抽提上清 1 次，再用苯酚 / 氯仿 / 異丙醇（25241） 1ml 充分混勻， 8 500 r/min 離心 5 min ，棄酚相，保留上清，上清中加入 3 mol/L 醋酸鈉和冷乙醇， -20 沉淀留宿。 -10 12 000 r/min 離心 10 min，將沉淀溶于 2

9、0 l TE緩沖液，加入 1 RNA酶， 37保溫 1 h。加 4 l 樣本緩沖液到含有 g/ml 溴化乙錠的 1%2%的瓊脂糖凝膠的樣品孔中，室溫、恒流75 mA，于1TAE緩沖液中電泳 12 h ，紫外燈下觀看實驗結(jié)果。統(tǒng)計學處置 數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處置，組間比較采納 t 查驗。結(jié) 果TUNEL 法染色檢測前列腺細胞凋亡 對照組僅見少數(shù)散在的凋亡細胞，經(jīng) 90Sr/90Y 射線輻射后細胞凋亡增多，并隨時刻而慢慢增加。與間質(zhì)細胞比較，腺上皮細胞凋亡加倍明顯，見圖 1。FCM 檢測凋亡細胞DNA含量 經(jīng)流式細胞儀分析凋亡細胞的DNA含量，可見對照組凋亡細胞百分率為（）%，射線輻射可使前

10、列腺組織細胞周期時相發(fā)生改變，在二倍體峰前顯現(xiàn)亞二倍體峰即凋亡峰。隨時刻延長凋亡細胞慢慢增多，輻射一、4、 7 d 凋亡細胞百分率別離為 %， %， %，與對照組比較不同顯著（P）。DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 對照組基因組 DNA維持完整，經(jīng)射線輻射 7 d 后基因組 DNA發(fā)生斷裂，呈現(xiàn)典型的凋亡改變即 DNA 梯形帶（DNALadder），說明射線可使細胞核內(nèi) DNA在核小體連接處發(fā)生斷裂，形成 180200 bp 及其整數(shù)倍的核苷酸片段，見圖 2。圖 1 TUNEL染色檢測前列腺組織中細胞凋亡 ( 400)圖 2 DNA瓊脂糖凝膠電泳 3 討 論細胞凋亡涉及一系列基因表達、 蛋白

11、質(zhì)和酶的激活， 是細胞為了適應生存環(huán)境而主動采取的死亡方式，良性增生的前列腺組織中很少見到細胞的有絲割裂， DNA的合成也少于正常細胞，提示 BPH的病因可能不是前列腺細胞的過度增殖引發(fā)，而是細胞凋亡減少所致 5。細胞凋亡的特點是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞染色體 DNA被切割，顯現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口， 并產(chǎn)生與 DNA斷點數(shù)量相同的 3 OH結(jié)尾。結(jié)尾脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶可將地高辛標記的 dUTP(DIG dUTP)標記至 3 OH結(jié)尾，DIG dUTP結(jié)合在 DNA斷點部位，能夠通過堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體反映后，加入顯色底物予以顯示。此種方式靈敏度很高，在凋亡初期就能夠夠檢測到DNA斷裂。

12、在本實驗中，通過原位結(jié)尾脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶將地高辛標記的 dUTP(DIG dUTP)標記至 DNA斷點部位，以顯示細胞凋亡的程度，陽性細胞核呈棕黃色。實驗結(jié)果可見對照組僅見極少數(shù)散在的凋亡細胞，經(jīng) 90Sr/90Y 射線輻射后凋亡細胞數(shù)量隨時刻延長而慢慢增多， 與間質(zhì)細胞比較，腺上皮細胞凋亡加倍明顯，說明輻射能使增生的前列腺細胞發(fā)生凋亡，而前列腺的腺上皮關于輻射加倍靈敏 6。前列腺細胞凋亡進程中， 由于細胞漿和染色質(zhì)濃縮、 核裂解，產(chǎn)生凋亡小體，使細胞的光散射性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，通過流式熒光細胞儀的分析顯示，射線輻射可使前列腺組織細胞周期時相發(fā)生改變，凋亡細胞核在二倍體峰前顯現(xiàn)亞二倍體峰“凋亡峰”

13、 ，隨著輻射后時刻的延長，可檢測到的凋亡細胞慢慢增多。前列腺細胞發(fā)生凋亡時的生物化學特點主若是細胞內(nèi)發(fā)生一系列信號傳遞反映，有新的 RNA和蛋白質(zhì)合成，核酸內(nèi)切酶被激活，染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解，產(chǎn)生假設干大小不一的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)階梯狀圖譜 (DNA ladder) ，利用這一特點能夠?qū)毎蛲鲞M行檢測。 DNA瓊脂糖凝膠電泳可見對照組基因組 DNA維持完整，經(jīng)射線輻射 7 d 后基因組 DNA發(fā)生斷裂，呈現(xiàn)典型的凋亡改變即 DNAladder ，說明射線可使細胞核內(nèi)DNA在核小體連接處發(fā)生斷裂，形成180200 bp 及其整數(shù)倍的核苷酸片段。本實驗通過TUNEL染

14、色、流式細胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳等方式證明，射線內(nèi)照射能夠有效地令人增生的前列腺細胞凋亡，進而引發(fā)前列腺組織萎縮，為采納電離輻射醫(yī)治BPH提供了實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1Kyprianouandterazosinsuppressprostategrowthbyinducing apoptosis：clinical significanceJ.J Urol，2003；169(4) ：15205.2 IacopinoF，Angelucci C，LamaG，etrelatedgene expressioninbenignprostatichyperplasiaandprostatecarcinomaJ.Anticancer Res，2006；26(3A) ：184954.3 MaQJ，Gu XQ，Cao X，et ofbeta radiationon TGFbeta1 andbFGFexpressionin hyperplasticprostatictissues J .AsianJAndrol ，2005；7(1) ：4954.2 和 bax 表達的阻礙 J. 中國老年學雜志， 2003；23(5) ：2812.5 JustulinLA，DelellaFK，F(xiàn)elisbi