FBXO40對心肌細(xì)胞增殖的作用

1、PAGE PAGE - 12 -FBXO40對心肌細(xì)胞增殖的作用謝敬儀王琪王濤錢麗麗摘要目的探究E3泛素連接酶FBXO40在心肌細(xì)胞增殖過程中的調(diào)控作用。方法轉(zhuǎn)染si-FBXO40小干擾RNA和FBXO40過表達(dá)載體分別敲低和過表達(dá)原代心肌細(xì)胞中的FBXO40，利用實時定量PCR（qPCR）方法檢測經(jīng)上述處理后原代心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)標(biāo)記基因（cdc20、Cyr61、Ccna2、Aurkb）的表達(dá)水平;轉(zhuǎn)染FBXO40過表達(dá)載體以及si-FBXO40小干擾RNA，在24h后利用CCK-8方法進(jìn)一步檢測原代心肌細(xì)胞增殖情況。結(jié)果與對照組相比，過表達(dá)FBXO40的原代心肌細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cc

2、na2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.203.90，P0.05）。與對照組相比，敲低FBXO40表達(dá)的原代心肌細(xì)胞中促增殖基因Cyr61的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.96，P0.05）。CCK-8檢測顯示，F(xiàn)BXO40過表達(dá)組的吸光度值高于對照組，敲低組的吸光度值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.72，P0.05）。結(jié)論FBXO40在心肌細(xì)胞增殖過程中具有重要的調(diào)控作用，可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。關(guān)鍵詞泛素蛋白連接酶類;FBXO40;肌細(xì)胞，心臟;細(xì)胞增殖中圖分類號R345.9;R329.25文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號2096-5532（2

3、022）02-0201-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.047開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）網(wǎng)絡(luò)出版https：/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1333.003.html;2022-03-1415：16：03EFFECTOFFBXO40ONTHEPROLIFERATIONOFCARDIOMYOCYTESXIEJingyi，WANGQi，WANGTao，QIANLili（InstituteofTranslationalMedicine，QingdaoUniversityMeadicalCollege，Qingdao

4、266021，China）ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheregulatoryroleoftheE3ubiquitinligaseFBXO40intheprocessofcardiomyocyteproliferation.MethodsPrimarycardiomyocytesweretransfectedwithsi-FBXO40small-interferingRNAorFBXO40overexpressionvectortoknockdownFBXO40orinducetheoverexpressionofFBXO40.Quantitativereal

5、-timePCRwasusedtomea-surethemRNAexpressionlevelsofproliferation-relatedmarkers（Cdc20，Cyr61，Ccna2，andAurkb）intheprimarycardiomyocytesaftertheabovetreatment，andCCK-8assaywasusedtomeasuretheproliferationofprimarycardiomyocytesat24hoursaftertransfectionwithFBXO40overexpressionvectororsi-FBXO40small-inte

6、rferingRNA.ResultsComparedwiththecontrolgroup，theprimarycardiomyocyteswithFBXO40overexpressionhadsignificantincreasesintheexpressionofproliferation-relatedgenes（Ccna2，Cdc20，Aurkb，andCyr61）（t=2.20-3.90，P0.05），whiletheprimarycardiomyocyteswithFBXO40knock-downhadasignificantreductionintheexpressionofth

7、eproliferation-promotinggeneCyr61（t=10.96，P0.05）.CCK-8assayshowedthatcomparedwiththecontrolgroup，theFBXO40overexpressiongrouphadasignificantlyhigherabsorbancevalueandtheFBXO40knock-downgrouphadasignificantlylowerabsorbancevalue（F=6.72，P0.05）.ConclusionFBXO40playsanimportantroleinregulatingtheprolife

8、rationofcardiomyocytesandcanpromotetheproliferationofcardiomyocytes.KEYWORDSubiquitin-proteinligases;FBXO40;myocytes，cardiac;cellproliferation嚴(yán)格的蛋白質(zhì)控制在心臟的發(fā)育與功能維持方面發(fā)揮重要作用，蛋白質(zhì)代謝或運(yùn)輸異常存在于多種心臟疾病中。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)控錯誤折疊蛋白或損傷蛋白降解方面發(fā)揮重要作用，其中，E3泛素連接酶尤為重要，它通過對細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的識別、相互作用和泛素化，在細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用1。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶參與

9、細(xì)胞增殖的調(diào)控，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（其中許多具有腫瘤抑制或致癌功能）的破壞與癌癥的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān);癌抑制蛋白的非正常或快速降解，或者是癌蛋白的大量堆積，都會導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。2022年，NAKAYAMA等2發(fā)現(xiàn)，Skp1-Cul1-F-box（SCF）E3泛素連接酶復(fù)合體的特異性泛素化導(dǎo)致細(xì)胞增殖、基因組不穩(wěn)定甚至是癌癥。2022年，LIU等3研究表明，泛素蛋白酶FAT10可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖。2022年，GUO等4研究表明，泛素蛋白酶HRD1在谷氨酰胺缺乏的條件下可特異性抑制三陰性乳癌細(xì)胞增殖。F-box蛋白是E3泛素連接酶的一種，F(xiàn)BXO40是2022年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白，其在骨

10、骼肌和心肌中特異性高表達(dá)，而且在去神經(jīng)性肌肉萎縮樣本中的表達(dá)也顯著上調(diào)5。2022年SHI等6研究結(jié)果表明，SCF-FBXO40復(fù)合體在骨骼肌中通過誘導(dǎo)胰島素受體底物1（IRS1）蛋白降解來抑制胰島素樣生長因子1（IGF1）誘導(dǎo)的骨骼肌肥大信號通路。然而，F(xiàn)BXO40在心肌中的研究尚未見報道。本研究旨在探討FBXO40對心肌細(xì)胞增殖是否具有調(diào)控作用以及發(fā)揮怎樣的作用，以期為心肌疾病的治療提供新的思路。1材料與方法1.1主要材料DMEM-F12培養(yǎng)液、PBS緩沖液（美倫生物公司），胎牛血清（BI公司），Trizol總RNA提取試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen預(yù)混型實時定量PCR（

11、qPCR）試劑盒（艾瑞克生物公司），胰液素（美國Sigma公司），型膠原酶（美國Worthington公司），DEPC原液、qPCR引物（擎科生物公司），siRNA序列及NC對照序列（上海吉瑪生物科技有限公司），Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所）。1.2實驗方法1.2.1原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)解剖大鼠乳鼠取出心臟，在PBS緩沖液中洗滌至無血污;將心臟剪碎后置于含有胰液素和膠原酶的消化工作液中（用PBS液加到50mL），在37恒溫水浴鍋中消化68min，收集每次消化后的上清液，剩余組織加入5mL消化液繼續(xù)消化，直至組織塊被完全

12、消化;將上清液收集到離心管中以8001000r/min離心56min，棄上清，將沉淀的細(xì)胞加入DMEM-F12培養(yǎng)液（加青霉素/鏈霉素雙抗）中吹打混勻清洗后，再次離心去上清，將剩余沉淀再次懸浮于DMEM-F12培養(yǎng)液（加青霉素/鏈霉素雙抗）中，經(jīng)260目過濾網(wǎng)過濾到培養(yǎng)皿，在37細(xì)胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.52.0h，最后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。整個過程在超凈工作臺中進(jìn)行無菌操作。1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)原代心肌細(xì)胞密度達(dá)60%70%時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分為對照組、敲低組和過表達(dá)組。對照組細(xì)胞不做處理。敲低組先將溶解的3.5Lsi-FBXO40小干擾RNA加入到125L無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻

13、（標(biāo)為1號管），過表達(dá)組則先將2.5L的FBXO40過表達(dá)載體加入到125L無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻（2號管），置室溫35min;將7LLipofectamin3000加入250L無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻（3號管），室溫放置35min;將3號管中試劑按11的比例分入1號、2號管中混勻，室溫下靜置2025min;敲低組和過表達(dá)組分別將1號、2號管中液體加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)檢測。1.2.3qPCR檢測增殖相關(guān)基因的表達(dá)用Trizol試劑提取原代心肌細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度及純度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR。模板cDNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qP

14、CR體系根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置。引物序列見表1。將qPCR的定量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，以GAPDH為內(nèi)參對照，計算Cdc20、Ccna2、Cyr61和Aurkb基因的相對表達(dá)量。實驗至少重復(fù)3次。1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將原代心肌細(xì)胞懸液接種于96孔板中（每孔約1104個細(xì)胞），分為對照組、敲低組和過表達(dá)組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，各組細(xì)胞的處理同1.2.2。細(xì)胞培養(yǎng)24h后進(jìn)行CCK-8檢測，每孔加入10LCCK-8溶液，37孵育2h后，用酶標(biāo)儀測量450nm波長處的吸光度值。實驗重復(fù)3次7。1.3統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)以xs表示，兩組比較采用

15、成組t檢驗，多組比較采用方差分析。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1過表達(dá)FBXO40后心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化qPCR檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞成功誘導(dǎo)FBXO40過表達(dá)（t=45.22，P0.01）;與對照組相比較，過表達(dá)組原代心肌細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ccna2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表達(dá)均明顯上調(diào)（t=2.203.90，P0.05）。見表2。2.2敲低FBXO40后心肌細(xì)胞中Cyr61基因的表達(dá)變化qPCR檢測結(jié)果顯示，敲低組的原代心肌細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染si-FBXO40小干擾RNA（t=8.27，P0.05）;與對照組相比，敲低組原代心肌細(xì)胞中促增殖基因

16、Cyr61的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.96，P0.05）。見表3。2.3FBXO40對心肌細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染24h后CCK-8檢測結(jié)果顯示，對照組、過表達(dá)組和敲低組的吸光度值分別為0.1910.005、0.2050.002和0.1540.030（n=3），過表達(dá)組的吸光度值高于對照組，敲低組的吸光度值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.72，P0.05）。表明敲低FBXO40會抑制原代心肌細(xì)胞增殖，而過表達(dá)FBXO40能促進(jìn)細(xì)胞增殖。3討論泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與多種細(xì)胞過程的調(diào)控，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、轉(zhuǎn)錄和凋亡等8-11。在細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞的有絲分裂周期是一個被嚴(yán)格調(diào)控

17、的過程，有絲分裂的進(jìn)程復(fù)雜，需要通過泛素連接酶的復(fù)雜催化和蛋白酶復(fù)合體對底物的降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期12。細(xì)胞周期調(diào)控過程主要是周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的連續(xù)性激活，通過CDKs以及周期蛋白激酶抑制劑（CKIs）的泛素介導(dǎo)來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解。在真核細(xì)胞中，E3泛素連接酶的兩個家族，即后期促進(jìn)復(fù)合物和SCF蛋白復(fù)合體，負(fù)責(zé)許多CDKs調(diào)節(jié)因子的泛素化和蛋白酶體降解，確保細(xì)胞周期的精確調(diào)控13-14。在過去的幾十年里，越來越多的證據(jù)表明，由于蛋白水解控制不力而導(dǎo)致的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，最終影響身體功能甚至是發(fā)生癌變15-17。一些泛素化因子通過調(diào)控細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期進(jìn)程來參與心

18、血管疾病的治療18。因此，更好地理解細(xì)胞增殖，了解細(xì)胞周期調(diào)控中泛素信號的多樣性和復(fù)雜性，將為精確控制細(xì)胞周期進(jìn)程和解決癌癥或心血管疾病的臨床治療問題提供新的思路。E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)-box蛋白作為一種E3泛素連接酶是SCF的重要組成部分，它通過F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1相互作用，并通過其他相互作用區(qū)域與蛋白結(jié)合并使其泛素化進(jìn)而介導(dǎo)蛋白水解19。F-box蛋白根據(jù)其特異性底物識別域可分為3個亞類：FBXW亞類含有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，由10個成員組成;FBXL亞類富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，有22個家族成員;其余37種F-box蛋白被指定為FBXO蛋白，其中包含各種尚未被完

19、全鑒定的結(jié)構(gòu)域20-23。FBXO40蛋白是2022年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO40在骨骼肌和心肌中特異性高表達(dá)5，然而FBXO40在心肌中的作用未見報道。本研究通過體外實驗，初步探究了FBXO40在心肌細(xì)胞增殖過程中是否具有調(diào)控作用，以及具有怎樣的調(diào)控作用。本研究首先采用qPCR方法檢測過表達(dá)FBXO40后原代心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在原代心肌細(xì)胞中過表達(dá)FBXO40后，與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因Ccna2、Cdc20、Aurkb、Cyr61的表達(dá)均顯著上調(diào)，提示FBXO40具有促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的作用。隨后，本研究又通過敲低原代心肌細(xì)胞中的FBXO40表

20、達(dá)，分別采用qPCR和CCK-8方法檢測了具有促增殖作用的基因Cyr61相對表達(dá)量的變化以及細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與過表達(dá)FBXO40相反，敲低FBXO40表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步驗證了FBXO40對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。在后續(xù)工作中我們將進(jìn)一步探究FBXO40在心肌細(xì)胞增殖中的具體調(diào)控通路，為心血管疾病的預(yù)防治療提供新的靶標(biāo)。參考文獻(xiàn)1DENGL，MENGT，CHENL，etal.TheroleofubiquitinationintumorigenesisandtargeteddrugdiscoveryJ.SignalTransductionandTargetedTherapy，2

21、022，5（1）：11.2NAKAYAMAKI，NAKAYAMAK.Ubiquitinligases：cell-cyclecontrolandcancerJ.NatureReviewsCancer，2022，6（5）：369-381.3LIUXX，CHENLF，GEJ，etal.Theubiquitin-likeproteinFAT10stabilizeseEF1A1expressiontopromotetumorproli-ferationinacomplexmannerJ.CancerResearch，2022，76（16）：4897-4907.4GUOX，WANGA，WANGW，etal

22、.HRD1inhibitsfattyacidoxidationandtumorigenesisbyubiquitinatingCPT2intriple-negativebreastcancerJ.MolecularOncology，2022，15（2）：642-656.5YEJW，ZHANGY，XUJL，etal.FBXO40，ageneencodinganovelmuscle-specificF-boxprotein，isupregulatedindenervation-relatedmuscleatrophyJ.Gene，2022，404（1/2）：53-60.6SHIJ，LUOLQ，EA

23、SHJ，etal.TheSCF-Fbxo40complexinducesIRS1ubiquitinationinskeletalmuscle，limitingIGF1signalingJ.DevelopmentalCell，2022，21（5）：835-847.7SARRIE，RAMOSB，SALIDOGM，etal.ThecholecystokininanaloguesJMV-180andCCK-8stimulatephospholipaseCthroughthesamebindingsiteofCCK（A）receptorinratpancreaticaciniJ.BritishJourn

24、alofPharmacology，2022，133（8）：1227-1234.8ZOUTT，LINZH.TheinvolvementofubiquitinationmachineryincellcycleregulationandcancerprogressionJ.InternationalJournalofMolecularSciences，2022，22（11）：5754.9TIWARIS，ROELC，WILLSR，etal.EarlyandlateG1/Scyclinsandcdksactcomplementarilytoenhanceauthentichuman-cellprolif

25、erationandexpansionJ.Diabetes，2022，64（10）：3485-3498.10BUDHIDARMOR，DAYCL.Theubiquitin-associateddomainofcellularinhibitorofapoptosisproteinsfacilitatesubi-quitylationJ.TheJournalofBiologicalChemistry，2022，289（37）：25721-25736.11EEG，LEHMINGN.Howtheubiquitinproteasomesystemregulatestheregulatorsoftransc

26、riptionJ.Transcription，2022，3（5）：235-239.12SWATEKKN，KOMANDERD.UbiquitinmodificationsJ.CellResearch，2022，26（4）：399-422.13WOODDJ，ENDICOTTJA.StructuralinsightsintothefunctionaldiversityoftheCDK-cyclinfamilyJ.OpenBiology，2022，8（9）：180112.14SURYADINATAR，SADOWSKIM，SARCEVICB.Controlofcellcycleprogressionby

27、phosphorylationofcyclin-depen-dentkinase（CDK）substratesJ.BioscienceReports，2022，30（4）：243-255.15TAKAHASHIH，UEMATSUA，YAMANAKAS，etal.Establishmentofawheatcell-freesynthesizedproteinarraycontaining250humanandmouseE3ubiquitinligasestoidentifynovelinteractionbetweenE3ligasesandsubstrateproteinsJ.PLoSOne，

28、2022，11（6）：e0156718.16TUNDOGR，SBARDELLAD，SANTOROAM，etal.Theproteasomeasadruggabletargetwithmultipletherapeuticpotentialities：cuttingandnon-cuttingedgesJ.PharmacologyTherapeutics，2022，213：107579.17SENFTD，QIJF，RONAIZA.Ubiquitinligasesinoncoge-nictransformationandcancertherapyJ.NatureReviewsCancer，2022，18（2）：69-88.18DREWSO，TAEGTMEYERH.Targetingtheubiquitin-prot