缺血后處理對再灌注損傷大鼠胃黏膜細(xì)胞ERK表達(dá)的影響

1、缺血后處理對再灌注損傷大鼠胃黏膜細(xì)胞ERK表達(dá)的影響【摘要】目的討論缺血后處理(isheipst-nditining,I-pst)對大鼠胃黏膜再灌注(GI-R)損傷的影響及細(xì)胞機制。方法制備胃缺血后處理模型。實驗分為3組(n=6):假手術(shù)組(Sha組)、缺血-再灌注組(I-R組)、缺血后處理組(I-pst組)。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測胃黏膜細(xì)胞的凋亡，用免疫組化方法檢測胃黏膜細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因p-ERK的表達(dá)。結(jié)果與Sha組相比，I-R組胃黏膜細(xì)胞凋亡增加及增殖減少，p-ERK表達(dá)下調(diào)；與I-R組相比，缺血后處理顯著降低胃黏膜細(xì)胞凋亡率，同時可以

2、增加胃黏膜增殖率及p-ERK的表達(dá)。結(jié)論缺血后處理可抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。其機制可能與p-ERK的表達(dá)上調(diào)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】胃缺血-再灌注；缺血后處理；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsandellularehanisfisheipst-nditining(I-pst)nI/R-induedgastriusalinjuryinrats.ethdsAnialdelfgastriI-Rinjuryasestablishedin18Sprague-Daleyrats,hihererandlydividedint3grups:shagr

3、up,I-Rgrupandisheipst-nditininggrup(I-pstgrup).TdT-ediateddUTP-bitinnikendlabeling(TUNEL)aseplyedtdetetthegastriusalellsapptsis,andeplyedtdetettheiunhistheistryeplyedtdetettheexpressinfp-ERK.ResultsparedithShagrup,thegastriusalellularapptsisinI-Rgrupinreased,theprliferatindereased,andtheexpressinfp-

4、ERKasdn-regulated.paredithI-Rgrup,isheipst-nditininguldarkedlyreduegastriusalellularapptsis,andeanhileinreasetheprliferatinratefgastriusaandprtetheprtEinexpressinfp-ERK.nlusinTheI-pstinhibitesellularapptsisandprtesellularprliferatinanditsprtetiveehanisisassiatediththeup-regulatedexpressinfp-ERK.Keyr

5、ds:gastriisheia-reperfusin;isheipst-nditining;extraellularsignal-regulatedkinase近年來，探究器官缺血-再灌注(I-R)損傷的特點、規(guī)律和發(fā)活力制已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點。2022年，Zha等1利用犬心肌梗死模型證實，1h缺血后再灌注開場前給予3輪再灌注30s/缺血30s(R-30s/I-30s)處理，明顯縮小心肌梗死面積，提出了缺血后處理(isheipst-nditining,I-pst)的概念。如今已經(jīng)在不同動物的心饑腦組織、腎臟得到證實2-3，但胃缺血后處理鮮見報道。胃黏膜是人和動物體內(nèi)較易受損的組織，各種嚴(yán)重

6、的應(yīng)激刺激常可引起不同程度的胃組織缺血而造成胃黏膜細(xì)胞的損傷。此前我們的研究已經(jīng)初步證實缺血后處理對胃黏膜損傷可以起到保護(hù)作用4，在此根底上我們進(jìn)一步觀察了缺血后處理對胃黏膜組織損傷的影響，試圖提醒缺血后處理對胃黏膜損傷的細(xì)胞保護(hù)機制。1材料和方法1.1試劑抗p-ERK單克隆抗體、小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原(PNA)單克隆抗體(Santaruz公司)；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒HEIN公司；PerVisin二步法免疫組化檢測系統(tǒng)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖鹽溶液(北京中山生物技術(shù))；其他試劑均為市售化學(xué)純。1.2實驗動物及分組成年安康Sprague-Daley(SD)大鼠，

7、體質(zhì)量200250g，雌雄不拘，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗前禁食24h，自由飲水。大鼠隨機分為3組(n=6)：假手術(shù)組(Sha組)，開腹后僅別離腹腔動脈而不夾閉；缺血-再灌注組(I-R組)；缺血后處理組(I-pst組)。1.3動物模型制備1.3.1大鼠胃缺血再灌注模型的制備按本實驗室方法5，大鼠經(jīng)10水合氯醛0.3l/100g，ip麻醉后，仰臥固定于操作板上，消毒后采取腹正中切口，開腹長約3，別離并用無創(chuàng)傷血管夾夾閉腹腔動脈30in后，去除動脈夾恢復(fù)血流，于再灌注后1h處死動物，快速取胃。1.3.2缺血后處理I-pst模型制備參照文獻(xiàn)1，夾閉腹腔動脈進(jìn)展胃缺血30in后，即刻松開血管夾

8、灌注20s，然后再夾閉缺血20s，如此反復(fù)3次灌注20s、缺血20s作為后處理，后處理操作完畢后去除血管夾，并于再灌注1h后處死動物，快速取胃。1.4原位凋亡檢測胃組織石蠟切片5，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；雙蒸水洗2in3次，3%H22室溫作用10in；蒸餾水洗2in3次，每片組織滴加0.1l/LPBS液pH值為7.51200新穎稀釋的PrtEInaseK，37消化15in；0.1l/LPBS液洗2in3次，滴加標(biāo)記緩沖液保持切片組織潮濕，每片組織滴加混合標(biāo)記液20lTdT6l+ReatinBuffer14l，置于濕盒中，37標(biāo)記2h；0.1l/LPBS液洗2in3次，滴加封閉液50l/片

9、，置于室溫30in；甩去封閉液，不洗，滴加地高辛抗體稀釋液110020l/片，置于濕盒中，37反響30in；0.1l/LPBS液洗5in4次，DAB顯色，鏡下觀察，顯色后自來水沖洗；蘇木素復(fù)染，充分自來水沖洗，中性樹脂封片。光鏡下觀察到細(xì)胞完好、體積縮小固縮成團(tuán)或形成凋亡小體、胞核呈棕黃色即凋亡陽性細(xì)胞。每張切片隨機選擇5個高倍視野，鏡下計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，并計算凋亡率。凋亡率%=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目100%。1.5PNA、p-ERK免疫組化染色胃組織石蠟切片(5)，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；雙蒸水洗2in3次，3%H22室溫作用10in，去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；雙蒸水洗2in3次，

10、枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)15in；0.01l/LPBS洗2in3次，分別加一抗(PNA150、p-ERK150)4冰箱過夜。0.01l/LPBS洗2in3次，加二抗PV-6002室溫孵育0.5h；0.01l/LPBS洗2in3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。光鏡下觀察到胞質(zhì)或胞核內(nèi)有黃色或者棕色顆粒者，即為陽性細(xì)胞。圖像分析儀對陽性細(xì)胞數(shù)或表達(dá)強度分別進(jìn)展半定量分析，檢測胃黏膜細(xì)胞PNA、p-ERK表達(dá)。1.6統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用STATA7.0軟件進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以s表示，組間比擬采用單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1缺血后處理對再灌注后胃黏膜

11、細(xì)胞凋亡的影響Sha組胃黏膜中可見一些凋亡陽性細(xì)胞散在分布于上皮層、黏膜下層與腺區(qū)；與Sha組相比，I-R組胃黏膜凋亡陽性細(xì)胞密集分布于黏膜上皮層和腺區(qū)，細(xì)胞凋亡率顯著升高；經(jīng)缺血后處理后，與I-R組相比，I-pst組凋亡率明顯降低，凋亡陽性細(xì)胞分布范圍也較小，但與Sha組相比擬仍有統(tǒng)計學(xué)差異P0.05或P0.01。見表1、圖1。2.2缺血后處理對再灌注后胃黏膜細(xì)胞增殖的影響Sha組胃黏膜PNA陽性細(xì)胞(即增殖陽性細(xì)胞)在胃黏膜的上中層1/3交界處有少量的表達(dá)。與Sha組相比，I-R組可見增殖陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少；與I-R組相比，I-pst組增殖陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，但仍然低于Sha組P0.05或

12、P0.01。見表1、圖1。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3缺血后處理對再灌注后胃黏膜細(xì)胞p-ERK表達(dá)的影響p-ERK陽性細(xì)胞主要分布于胃黏膜中下層胃底腺細(xì)胞中，p-ERK在胞質(zhì)、胞核中均有分布。與Sha組相比，I-R組可見p-ERK陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少；與I-R組相比，缺血后處理能明顯進(jìn)步復(fù)灌早期p-ERK的程度，但仍然低于Sha組程度P0.05或P0.01。見表1、圖1。表1胃黏膜PNA的陽性細(xì)胞數(shù)和TUNEL及p-ERK的陽性細(xì)胞累積光密度值(略)3討論臨床上各種嚴(yán)重的應(yīng)激性刺激，均可造成體內(nèi)血液的重新分布，引起不同程度的胃組織缺血而造成胃黏膜的再灌注損傷。延緩和減輕胃黏膜I-R損傷是亟待解決

13、的重要問題，而胃黏膜I-R損傷主要發(fā)生在再灌注階段。所以，如何控制再灌注條件或狀態(tài)來減輕再灌注損傷，引起了人們的關(guān)注。作為一種強有力的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象,I-pst為I-R的防治提供了新而有效的方法。本實驗室已經(jīng)證實I-R造成的胃黏膜損傷是由于胃黏膜細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡受到破壞引起的6，而胃黏膜組織的完好性那么取決于胃黏膜細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，胃缺血后處理可抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖。我們分別利用PNA表達(dá)和TUNEL來檢測細(xì)胞的增殖和凋亡，PNA是DNA聚合酶的輔助因子，參與DNA合成，能較好地反響細(xì)胞增殖情況，TUNEL那么是公認(rèn)的檢測凋亡的手段。在本實驗中

14、我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過缺血后處理的胃黏膜細(xì)胞中PNA表達(dá)明顯增多，同時胃黏膜細(xì)胞凋亡減少。據(jù)文獻(xiàn)報道，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)在心、腦等器官的I-R損傷中被激活發(fā)揮保護(hù)作用7-8，在調(diào)節(jié)胃上皮增生、分化、凋亡中也發(fā)揮重要作用9-10。本實驗室以前的研究中也已經(jīng)證實細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑在大鼠I-R損傷引起的胃黏膜細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用5。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)I-R組胃黏膜細(xì)胞p-ERK表達(dá)較Sha組明顯降低，而I-pst組胃黏膜細(xì)胞p-ERK表達(dá)較I-R組明顯增加，提示p-ERK的表達(dá)可能具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖的作用。但胃黏膜細(xì)胞的凋亡是一個多基因調(diào)控的互相作用、互相影響的復(fù)雜

15、過程，而不是某一種或某一類基因表達(dá)的結(jié)果，這其中的機制還有待進(jìn)一步討論。綜上所述，本實驗證實缺血后處理對胃缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機制與降低胃黏膜細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖有關(guān)。但對缺血后處理確切機制，以及缺血后處理對細(xì)胞保護(hù)的遠(yuǎn)期效果確實認(rèn)有待更多的實驗進(jìn)一步證明?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ZhaZQ,rveraJS,HalksE,etal.Inhibitinfyardialinjurybyisheipstnditiningduringreperfusin:parisnithisheiprenditiningJ.AJPhysilHeartirPhysil,2022,285(2):H579-58

16、8.2LiuXH,ZhangZY,SunS,etal.Isheipstnditiningprtetsyardiufrisheia/reperfusininjurythrughattenuatingendplasiretiulustressJ.Shk，2022，30(4):422-427.3ZhuY,TangTL,uiS,etal.Theeffetfisheipstnditiningnapptsisinduedbyautehtrenalishei-reperfusinJ.SihuanDaXueXueBa(YiXueBan)，2022，39(6):921-924.4丁雷，張建福，杜東書.缺血后處理

17、對缺血/再灌注胃黏膜自由基損傷的影響J.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2022,29(5)：298-300.5LiL，ZhangY,QiaL,etal.Rlefitgen-ativatedprtEinkinasesintheregulatinfparaventriularnuleustgastriisheia-reperfusininjuriesJhinedJ，2022,120(12):1082-1087.6LiL，ZhangY,QiaL,etal.EffetsfhypthalaiparaventriularnulEInapptsisandprliferatinfgastriusalellsinduedby

18、isheia/reperfusininratsJ.rldJGastrenterl,2022,13(6):874-881.7JinY,KiKJ,KiY,etal.Anti-appttieffetfagnllinyardialisheiaandreperfusininjuryrequiresextraellularsignal-regulatedkinase1/2pathaysinratinvivJ.ExpBiled,2022,233(10):1280-1288.8SungS,JungDS,KnH,etal.Hypxia/rexygenatinstiulatesprliferatinthrughPK-dependentativatinfERKandAktinuseneuralprgenitrellsJ.NeurheRes,2022,32(11):1932-1939.9DingSZ,SithFJr,GldbergJB.Helibaterpylrianditgen-ativated