植物組織培養(yǎng)技術

1、第2章植物組織培育技術第二節(jié)植物組織培育歸納一、授課章節(jié)第二節(jié)植物組織培育歸納。二、學時安排學時。三、授課目的1掌握植物組織培育的含義。2認識植物組織培育的種類劃分。3理解植物組織培育的應用原理。4掌握植物組織培育的特色和應用。四、授課重點、難點分析重點：植物組織培育的含義、特色和應用。難點：植物組織培育的應用原理。五、教具電化授課設備，植物組織培育試管苗。六、授課方法解說法，多媒體課件。七、授課過程.導入前面我們學習了相關植物育種的一些知識，今天，請看我給同學們看同樣東西(教師拿出試管苗)，問同學們這是什么呢？這就是我們要學的植物組織培育。新課一、植物組織培育的含義植物組織培育是指在無菌條件

2、下，將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質體培育在人工培育基上，恩賜合適的培育條件，使其長成完滿植株的過程。由于培育物走開母株在試管內培育，故又稱離體培育、試管培育。二、植物組織培育的種類植物組織培育由于分類依照不一樣可劃分為不一樣的種類。植株培育：對幼小植株的器官培育：對根、莖、葉、花、果實、種子等離體器依照培育對象組織培育：對植物體的各部分組織進行的培育。細胞培育：對單個細胞或較小細胞團的培育。植原生質體培育：對除掉細胞壁的原生質體的培固體培育：加入瓊脂等凝固劑，使培育基固體化，在此培物依照培育方液體培育：培育基中不加凝固劑，培育基為液體，在此培組初代培育：將外植體進行的第一次培育?？椧勒?/p>

3、培育過繼代培育：將培育一段時間的培育物轉接到新鮮培育基繼依照培育條光培育：培育過程中需要光照的培育。暗培育：培育過程中不需要光照三、植物組織培育的應用原理（一）植物細胞全能性植物細胞全能性，是指植物體上每個擁有完滿細胞核的植物細胞，都擁有該植物體的所有遺傳信息和產(chǎn)生完滿植株的能力。植物的體細胞一旦走開所在器官或組織的拘束成為離體狀態(tài)時，在必然的營養(yǎng)、激素和外界條件作用下，即可能表現(xiàn)出全能性，而生長發(fā)育成為完滿的植株。（二）細胞的分化和形態(tài)建成（三）植物的再生功能四、植物組織培育的特色（一）研究資料本源單一，無性系遺傳信息同樣（二）試驗經(jīng)濟，管理方便，工作效率高（三）培育條件人為控制，可周年連續(xù)

4、進行試驗或生產(chǎn)（四）生長快，周期短，生殖率高五、植物組織培育的應用（一）優(yōu)秀品種的迅速生殖（二）脫毒及脫毒苗的再繁育（三）植物新品種的培育（四）種質資源的保存和交換（五）適用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)作業(yè)簡述植物組織培育的看法和培育種類。植物組織培育技術有哪些特色？植物組織培育在生產(chǎn)上有哪些方面的應用？經(jīng)過學習，你對植物組織培育技術是怎樣理解的？第二節(jié)植物組織培育廠房的設計與成立一、授課章節(jié)第二節(jié)植物組織培育廠房的設計與成立。二、學時安排學時。三、授課目的1認識組培工廠的基本構造、各部分構造的詳盡功能。2理解組培工廠的設計原則與整體要求，能夠依照需要和實質情況科學設計組培工廠。3掌握廠房的基本組成，儀

5、器設備裝備與設計要求。4認識常用儀器與用具的使用方法。四、授課重點、難點分析重點：組培工廠的設計原則與整體要求。難點：依照需要和實質情況科學設計組培工廠。五、教具電化授課設備、組培工廠現(xiàn)場或實驗室。六、授課方法解說法，演示法。七、授課過程.導入復習：植物組織培育的看法，種類及應用。提問：細胞全能性的看法。前一次課我們學習了植物組織培育的基本知識，那么從事植物組織培育的生產(chǎn)需要一些基本的儀器和設備，今天我們來學習植物組織培育的廠房的設計與成立。新課一、植物組織培育廠房的設計（一）設計原則環(huán)境干凈、沉寂、遠離污染源。依照工作的目的和規(guī)模決定廠房的設計。依照自然工作程序先后合理布局，防范生產(chǎn)環(huán)節(jié)倒排

6、。經(jīng)濟合用，節(jié)能安全。（二）詳盡要求廠房選址時應選擇周圍沉寂、陽光充分、無高大建筑物遮擋的環(huán)境；最幸好常年主風向的上風方向，盡量減少污染；要求交通便利，便于產(chǎn)品的運送。廠房各車間的大小和比率相對合理，車間的設計和設備的配置、擺放與其功能相適應。廠房必定滿足3個基本的需要：生產(chǎn)準備（器皿沖洗與存放、培育基制備、各種用具的滅菌）、無菌操作和控制培育。廠房的建筑與裝修資料要耐腐化，便于消毒和干凈。（三）廠房基本組成廠房依照構造和應用范圍一般設計為藥品配制間、沖洗間、培育基制作間、緩沖間、無菌操作間、試管苗培育間、試管苗馴化移植間。藥品配制間1）任務：主要用于化學藥品的積蓄、稱量和溶液的配制。2）設計

7、要求：干燥、通風、無直射光輝。房間內成立工作臺，工作臺最好用抗鹽堿，耐腐化的臺面，要牢固、平穩(wěn)，擁有較好的抗震性能。注意磁力攪拌器與電子天平要分開臺面放置。3）儀器與用具配置：大型工作臺、藥品柜、一般冰箱、電子分析天平、托盤天平、磁力攪拌器、容量瓶、燒杯、量筒等。2.沖洗間（1）任務：沖洗室用于達成玻璃器皿等儀器的沖洗、干燥和儲藏；外植體的預辦理與沖洗；試管苗的出瓶、沖洗與整理等工作。2）設計要求：房間內應廣闊光明，方便多人同時操作；裝備大型水槽，上下水道要暢達；地面、天花板及墻壁應耐濕和便于干凈；應有晾干臺，用于放置沖洗后的培育器皿。3）儀器與用具配置：水槽、晾干臺、周轉箱、烘箱等。3.培育

8、基制作間1）任務：主要負責培育基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。2）設計要求：房間廣闊光明、通風優(yōu)秀，方便多人同時操作；當前滅菌大多采用電加溫，墻體建筑時要起初設計電路線，保證用電線路和滅菌鍋的用電安全。在滅菌鍋上方的墻壁設置換氣窗，利于通風排氣。地面、墻壁應用耐濕資料鋪設，防水、防潮、防腐化。3）儀器與用具配置：托盤天平、酸度計、工作臺、高壓滅菌鍋、周轉箱、儲物柜等。4.緩沖間（1）任務：防范工作人員進出時帶進雜菌。2（2）設計要求：面積一般23m為宜；緩沖間應安裝紫外燈，用以照射滅菌；裝備鞋柜、衣柜、拖鞋，用于工作人員進入無菌操作室前在此換衣?lián)Q鞋，（3）儀器與用具配置：紫外燈、鞋柜、衣

9、柜、工作服等。5.無菌操作間(接種間)（1）任務：進行植物質料的分別接種及培育物轉移。2（2）設計要求：接種室宜小不宜大，一般78m。地面、天花板及四壁要求盡可能密閉圓滑，易于干凈和消毒。配置推拉門，以減少開關門時的空氣擾動。房間密閉，干爽沉寂，干凈光明。在合適地址吊裝12盞紫外燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調，使室溫可控，這樣可使門窗封閉，減少與外界空氣對流。3）儀器與用具配置：超凈工作臺、紫外燈、空調機、醫(yī)用小推車、接種用具消毒器、酒精燈、接種工具、擱物架等。6.試管苗培育間1）任務：接種資料的培育生長。2）設計要求：培育間的大小可依照生產(chǎn)規(guī)模和培育架的大小、數(shù)量及其他隸屬設備而定。其

10、設計以充分利用空間和節(jié)約能源為原則。高度比培育架略高為宜，周圍墻壁和天花板要求圓滑平坦、有絕熱防火的性能。能夠控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境；合適地址安裝紫外燈進行照射滅菌。3）儀器與用具配置：培育架、空調機、光照時控器、溫度計、搖床等。7.試管苗馴化移植間1）任務：進行試管苗的馴化和移植。2）設計要求：平時在日光溫室內進行，其面積大小依照生產(chǎn)規(guī)模而定。要求能夠控溫調濕、控光通風、控菌防蟲。3）儀器與用具配置：移栽容器、彌霧裝置、遮陽網(wǎng)、移栽基質等。二、基本儀器設備和用具（一）滅菌設備1.濕熱滅菌設備（高壓蒸汽滅菌鍋）：用于培育基、玻璃器皿以及其他可高溫滅菌用品的滅菌，依照規(guī)模大小有小型

11、手提式、中型立式、大型臥式等不一樣規(guī)格；依照控制方式分為手動控制、半自動控制和全自動控制等不一樣種類。2.過濾滅菌設備（防細菌濾膜）：防細菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下，當溶液經(jīng)過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。主要用于赤霉素、玉米素、零散酸等不耐熱物質的滅菌。3.干熱滅菌設備：利用高溫烘烤或灼燒的方法進行滅菌，包括烘箱（器皿和器械的滅菌）、酒精燈（用于接種工具的滅菌）、接種器械滅菌器等。4.其他滅菌設備：利用紫外光波、超聲波、臭氧等殺菌，主要用于對空氣和物體表面進行消毒。常用設備包括紫外燈、超聲波沖洗器

12、、臭氧發(fā)生器等。（二）接種設備與用具1.超凈工作臺：超凈工作臺是植物組織培育最常用、最普及的無菌操作裝置。依照風幕形成的方式可分為水平風和垂直風兩種；依照使用方式分為單人單面、雙人單面、雙人雙面等。2.接種工具：外植體接種或培育物繼代轉接時使用的各種工具。常用的有：尖頭鑷：用于分別植物組織等；槍型鑷：用于夾取植物器官繼代轉接和外植體接種；解剖剪：用于幼嫩組織、細胞團等剪??；彎頭剪：用于轉接、剪取試管苗莖段等；解剖刀：用于外植體或培育物切割；接種針：用于莖尖剝離和愈傷組織轉移；切割盤：用于原球莖、愈傷組織、植物器官等切割分別。3.顯微鏡：包括雙目體視顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子

13、顯微鏡，用于剝離莖尖和進行培育物的觀察、分析、拍照等。（三）培育設備與用具1.培育架：試管苗在培育間里培育時平時擺放在培育架上。培育架大多由金屬制成，一般設58層，最低一層離地高約20cm，其他每層間隔30cm左右。培養(yǎng)架長度依照日光燈的長度而設計，如采用40W日光燈，則長1.3m，寬度一般為60cm。2.恒溫振蕩器：用于液體培育時改進培育過程的氧氣供給情況。光照培育箱：對于一些對環(huán)境條件要求特別嚴格的培育物，可培育在能自動調控溫度、濕度、光照等的智能光照培育箱里。4.培育器皿：依照培育目的和要求不一樣，可采用不一樣種類和規(guī)格的培育容器。1）三角瓶：主要用于外植體靜置培育、振蕩培育或試管苗繼代

14、培育。規(guī)格有50mL，l00mL，150mL，250mL，500mL等，一般使用l50mL三角瓶。優(yōu)點：其培育面積大，利于組織生長；透光度好；由于瓶口較小，不易污染。2）試管：主要用于莖尖培育、液體培育。試管要求口徑大，長度稍短、以2cm15cm、2.5cm15cm、3cm15cm為宜。優(yōu)點：占空間少，單位面積容納的數(shù)量多。3）果醬瓶：主要用于繼代和生根培育。優(yōu)點：在工廠化大批量生產(chǎn)時使用，價格廉價，成本低；口徑較大，便于操作。缺點：污染率較高；透光性稍差。4）塑料瓶：主要用于蘭科植物的培育。有100mL、150mL、200mL、250mL的規(guī)格。優(yōu)點：密封好、透氣性差、瓶內濕度大；質輕，便于

15、操作，不易破壞，污染率低；長方盒形的培育株數(shù)多，且疊摞起來節(jié)約空間。缺點：可重復利用性較差。（四）稱量設備與用具天平：用于進行瓊脂、蔗糖和各種藥品的稱量，需要有稱量微量元素和植物激素等的分析天平；稱量大批元素、蔗糖和瓊脂等的托盤天同樣不一樣精度的天平。2.燒杯：用于配制培育基母液時溶解各種化合物，規(guī)格有501000mL不等。3.量筒：用于量取不一樣體積的液體，規(guī)格有501000mL不等。4.試劑瓶：用于儲藏不一樣容量的溶液，規(guī)格有501000mL不等。5.移液管：用于吸取各種用量較少的母液，規(guī)格有0.110mL不等。6.容量瓶：用于配制培育基母液時進行定容，規(guī)格有501000mL不等。（五）環(huán)

16、境控制設備與用具空調機：自動控制植物組織培育廠房的溫度，為培育物供給最合適的溫度條件。2.冰箱：用于母液和某些試劑的儲藏及培育資料的保鮮或與辦理等。3.光照時控器：用于自動控制培育間的光照時間。（六）其他設備與用具磁力攪拌器：磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質，如各種化學物質等。磁力攪拌器還可加熱，加速物質的溶解。2.蒸餾水發(fā)生器或純水機：用于制備配制母液和培育基的蒸餾水或去離子水。3.藥品柜：用于存放各種化學藥品。加熱設備：制備固體培育基時需加熱使固化劑溶化，因此需要加熱設備如液化氣灶、電爐、恒溫水浴鍋等。5.pH計：用于精確測量和調治培育基的pH，大規(guī)模生產(chǎn)中一般用精美pH試紙代替。作業(yè)植物

17、組織培育廠房的設計原則和要求有哪些？植物組織培育的工藝流程是怎樣的？組建一個植物組織培育生產(chǎn)車間應包括哪幾部分，各部分的設計要求以及主要功能是什么？植物組織培育需要哪些基本設備，各有何作用？第三節(jié)植物組織培育操作技術（1）一、授課章節(jié)第三節(jié)植物組織培育操作技術（1）。二、學時安排學時。三、授課目的1掌握組培的一般工作程序。2掌握不一樣種類培育器皿和用具的沖洗技術。3認識常用消毒滅菌方法的原理，掌握其操作技術，能依照物品種類正確選用消毒滅菌方法。四、授課重點、難點分析重點：常用的消毒滅菌技術。難點：滅菌和消毒的差異及無菌意識的成立。五、教具電化授課設備。六、授課方法解說法，演示法。七、授課過程.

18、導入提問：植物組織培育實驗室的基本組成。本次課主要介紹的是植物組織培育沖洗和消毒滅菌技術。新課一、沖洗技術植物組織培育除了要對培育資料和接種用具進行嚴格消毒外，各種用具更要求沖洗干凈，由于各種滅菌方法的有效作用時間都是以資料或用具干凈為前提的。（一）沖洗液1.洗衣粉、洗潔精沖洗液合用于玻璃器皿和金屬類用具的沖洗。2.鉻酸沖洗液由重鉻酸鉀和濃硫酸混雜而成，屬強氧化劑，對無機離子、灰塵收效好，對油污無效。鉻酸沖洗液的配制：稱取重鉻酸鉀50g，加入1L蒸餾水，加熱攪拌至完滿溶解；冷卻后注入90mL濃硫酸，混雜平均即可。剛配好的洗液是棕紅色，屢次使用至變成青褐色則無效?！咀⒁馐马棥浚?）配制時重鉻酸鉀

19、溶液必然要冷卻后才能加濃硫酸，且只能把濃硫酸遲緩加入重鉻酸鉀溶液中，決不能夠將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。（2）由于鉻酸沖洗液擁有極強的氧化能力和腐化作用，故不要用手直接接觸沖洗液。（二）各種器皿和用具的沖洗方法1.新的玻璃器皿：使用前先用1%稀鹽酸浸泡1224h用毛刷蘸洗衣粉水洗漱干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。2.已用過的培育器皿：除掉容器內的殘渣自來水沖洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛洗刷漱干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。3.已被霉菌等雜菌污染的器皿：121高溫高壓蒸汽滅菌30min趁熱倒去殘渣自來水沖洗浸泡在洗衣粉水中1

20、530min用毛洗刷漱干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。4.移液管、量筒等量器：鉻酸沖洗液中浸泡2h以上拿出后在流水中沖洗30min蒸餾水沖淋1次晾干（或烘干）后備用。5.載玻片和蓋玻片：沖洗液中浸泡數(shù)小時水洗綢布擦干放在95%的灑精中備用。6.解剖刀、鑷子、剪刀等：新購置金屬器皿因其上有潤滑油或防銹油，用蘸有四氯化碳的棉布擦去油脂，再用濕布擦凈，干燥備用。每次使用后先用洗衣粉水洗漱，再用酒精擦拭。二、滅菌與消毒技術（一）滅菌與消毒的差異有菌和無菌的范圍有菌的范圍是：凡是裸露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，最少它的表面都是有菌的。無菌的范圍是：經(jīng)高溫灼燒或一準時間

21、蒸煮過后的物體，經(jīng)其他理化滅菌方法辦理后的物體一般能夠為是無菌的。2.滅菌與消毒的差異滅菌是指用物理或化學方法殺死物體表面和孔隙內所有微生物或生物體。消毒是指殺死、除掉或充分控制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。由滅菌和消毒的含義能夠看出，二者的主要差異是：滅菌是把所有有生命的物質所有殺死；而消毒主要殺死或控制物體表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不會死亡。（二）常用的消毒滅菌方法（三）消毒滅菌技術環(huán)境消毒：方法主要有空氣過濾滅菌、紫外線照射消毒、噴霧消毒和熏蒸消毒等?？諝膺^濾滅菌：成規(guī)模的植物組織培育車間可采用空氣過濾系統(tǒng)對整個環(huán)境進行空氣過濾滅菌，這類方法投入較高，操作要求比較嚴格，一般較

22、少采用。組織培育中寬泛采用的是對無菌操作的微環(huán)境進行空氣過濾滅菌，如超凈工作臺的局部無菌環(huán)境。紫外線照射消毒：利用紫外光波照射滅菌，細菌吸取紫外線后，蛋白質和核酸發(fā)生構造變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。緩沖間、接種間、培育間等均可采用紫外線照射消毒，一般照射2030min。噴霧消毒：利用70%75%的酒精或0.2%的新潔爾滅對環(huán)境進行噴霧，既能夠起到直接殺死環(huán)境中微生物的作用，又能夠使飄浮的灰塵降落，防范灰塵上附著的雜菌污染培育基和培育資料。熏蒸消毒：利用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變成氣體狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，按2mL30.2g/

23、m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間m用量，將甲醛置于廣口容器中，加可起初噴濕，封閉親密，24h后打開門窗通風。2.用具的消毒滅菌：依照用具種類不一樣分別采用干熱滅菌、濕熱滅菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。干熱滅菌：利用烘箱進行烘烤滅菌的方法，合用于各種玻璃器皿和器械的滅菌消毒。方法是將沖洗后的玻璃器皿和器械妥為包扎，放入箱內，將箱溫控制在150170，烘烤120min，即可達到滅菌收效。在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞抗熱性大為提高，故能源耗資大，又浪費時間，因此當前多采用濕熱滅菌代替，接種工具也可采用消毒器烘烤和酒精燈外焰灼燒的方法消毒。濕熱滅菌：合用于培育基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金屬用具等的

24、滅菌，一般滅菌掌握在0.10.15MPa壓力下2030min。浸泡消毒：在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入70%75%的酒精中浸泡，使用從前拿出在酒精燈外焰上灼燒，待冷卻后使用。擦拭消毒：接種用具及超凈工作臺表面等使用前可用70%酒精或0.10.2%新潔爾滅溶液進行擦拭消毒。3.培育基滅菌：培育基滅菌一般采用濕熱滅菌，特別情況下采用過濾無菌。濕熱滅菌：采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。過濾滅菌：主要針對一些不能夠處于高溫高壓環(huán)境的物質，如GA3、IAA、ABA（零散酸）、ZT（玉米素）、部分維生素、多數(shù)抗生素和酶。過濾滅菌的原理是細菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下，當溶液經(jīng)過濾膜后，細菌的細胞和真

25、菌的孢子（直徑1m以上）等因大于濾膜網(wǎng)孔直徑而被阻。外植體消毒：從外界或室內采用的植物質料，都不一樣程度地帶有各種微生物，因此，植物質料必定經(jīng)嚴格的表面消毒辦理。接種的植物質料叫做外植體。外植體的消毒要求比較嚴格，既要能有效殺滅微生物，又要保證植物組織盡量少受損害。外植體一般采用浸泡消毒的方法，詳盡方法在今后課程中解說。作業(yè)不一樣的培育器皿怎樣選擇與沖洗？植物組織培育環(huán)境怎樣進行消毒滅菌？3過濾滅菌的技術原理？第三節(jié)植物組織培育操作技術（2）一、授課章節(jié)第三節(jié)植物組織培育操作技術（2）。二、學時安排學時。三、授課目的1掌握培育基的作用。2掌握培育基中生長調控物質的作用。3認識培育基的種類。四、

26、授課重點、難點分析重點：培育基的基本成分。難點：培育基中生長調治物質的作用。五、教具電化授課設備。六、授課方法解說法，演示法。七、授課過程.導入培育基是進行植物組織培育的基質，進行植物組織培育必定掌握培育基的基本知識，今天我們就學習培育基的種類和基本成分。新課三、培育基制備技術（一）配制培育基的目的配制培育基的目的是人為供給離體培育資料的營養(yǎng)源。配制的不一樣培育基，是為滿足不一樣種類植物質料對營養(yǎng)的不一樣需要。沒有一種培育基能夠合適所有類型的植物組織或器官，在成立一項新的培育系統(tǒng)時，第一必定找到一種合適的培育基，培育才有可能成功。（二）培育基的種類1.培育基的種類劃分固體培育基：在液體培育基中

27、加入必然量凝固劑，使其成為依照形液體培育基：培育基中沒有凝固劑為液體培初代培育基：初代培育階段所用的培養(yǎng)依照培育繼代培育基：繼代培育階段所用的培育基基本培育基：只含有無機鹽、蔗糖、維生素和水等最基本成分的合種依照營養(yǎng)完滿培育基：在基本培育基中加入合適的植物激素和有機附類引誘培育基：初代培育時引誘外植體生長與脫分化的依照培育增殖培育基：繼代培育中促使培育物迅速增殖的培育基，也生根培育基：引誘試管苗生根的培育基。2.常用培育基的配方和特色當前已公開報道的基本培育基有好多種類，各有不一樣的特色和合用范圍，在植物組織培育生產(chǎn)中應依照不一樣的植物種類和培育部位及不一樣的培育目的采用不一樣的培育基。常用的

28、培育基配方：含量（mg/L）(NH4)2S04NH4N03KN03Ca(N03)24H20CaCl22H20Ca3(PO4)2MgS047H20KH2PO4NaH2P04H20Na2SO4Na2EDTAFeSO47H20Fe2(SO4)3KClFe2(C4H4O6)3NH4H2PO4MnSO4H20MnS044H20ZnSO47H20H3B03KINa2Mo042H20MoO3CuSO45H20CoCl26H20表1常用培育基配方MSB5WhiteSHKnudsonVWN6（196（196（194（19C（194（192）8）3）72）（1946）9）74）165013480250050050

29、0463l900250052528302002001000440150200166370250720400250250185170150174001525025037.337.320037.32.527.827.820252827.86522.3103005108.62.031.04.46.23.01.55.03.80.830.757.57.50.751.01.60.250.250.0010.10.80.0250.0250.010.20.0250.0250.1鹽酸硫胺素VBl煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖pH0.1100.15.010.51.00.35.00.50.51.00.15.00.

30、51001003100022.0300002000020000300020000200005000005.85.55.65.85.85.55.8表2常用基本培育基的特色基本培育設計由來特色合用范圍基種類MS1962年由無機鹽和離子濃度較高，寬泛地用于植物的Murashige和為較牢固的平衡溶液；它器官、花藥、細胞Skoog為培育煙草的硝酸鹽和銨鹽含量較細胞而設計其他培育基為高，比率也比較合適，不需要增加更多的有機附加物。B1968年由Gamborg除含有較高的鉀鹽外，還等為培育大豆根細含有較低的氨態(tài)氮和較5胞而設計高的鹽酸硫胺素White1943年由White為無機鹽數(shù)量較低，提高了培育番茄根

31、尖而設MgSO的濃度4計1972年由Schenk鹽分濃度較高，銨態(tài)氮含SH和Hidebrandt設量較低，鹽酸硫胺素和硝計酸鉀含量較高Knudson1922年由Knudson成分簡單，不能夠滿足大多為蘭科種子培育而數(shù)植物組織細胞的生長C設計，后經(jīng)多次改發(fā)育所需的營養(yǎng)物質良和原生質體培育合適雙子葉植物，特別木本植物的培育適于生根培育在很多單據(jù)葉和雙子葉植物的組培中應用收效較好合用于蘭科植物種子培育和萌生VWVacin和Went在1949年設計1974年朱至清等為培育基的總離子強度稍低些，磷以磷酸鈣的形式供給成分較簡單，KN03和合用于氣生蘭的組培合用于單據(jù)葉植物花藥培育，寬泛應N6水稻等禾谷類作

32、物花藥培育而設計(NH4)2S04含量高用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)（三）培育基的組成培育基主要有水、無機鹽、有機物、植物生長調治物質、培育基的支持資料五大類組成。水水是植物原生質體的組成成分，也是所有代謝過程的介質和溶媒。它是生命活動過程中不能缺少的物質。配制培育基母液時要用蒸餾水，以保證母液及培育基成分的精確性，防范積蓄過程發(fā)霉變質，大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少許研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良收效。2.無機元素大批元素指濃度大于0.5mmolL的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS047H20、C

33、aCl22H20等化合物來提供。微量元素指濃度小于0.5mmolL的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成必要的。培育基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促使作用。在制作培育基時不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性積淀)，而用FeS047H20和Na2-EDTA結合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培育中不能缺少的元素，缺少這些物質會以致生長發(fā)育異常。3.有機化合物糖類：這類有機物的作用一是培育物賴以生長的碳源；二是使培育基保持必然

34、的浸透壓。種類：常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖，麥芽糖、半乳糖、甘露糖等在組織培育中也有應用。使用濃度：一般在23。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。（2）維生素類：這類化合物在植物細胞中主要以各種輔酶的形式參加多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促使作用。種類：硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3，又稱維生素PP)、泛酸(維生素B5)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素B11）等。使用濃度：0.11.0mg/L肌醇(環(huán)己六醇)：作用：在糖類的相互轉變中起重要作用；參加細胞壁和細胞膜的成立；能促使愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成；對組織和細胞的生

35、殖、分化有促使作用。使用濃度：一般為1OOmgL。氨基酸：作用：是很好的有機氮源，可被細胞直接吸取利用。常用種類：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有時應用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），但由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培育中無特別需要，以不用為宜。天然復合物：其成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促使作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，因此一般盡量不使用。椰乳是椰子的液體胚乳。它是使用最多、收效最大的一種天然復合物，一般使用濃度在1020。它在愈傷組織和細胞培育中有促使作用。在馬鈴薯

36、莖尖分生組織和草莓微莖尖培育中起明顯的促使作用，但莖尖組織的大小若高出1mm時，椰乳就不發(fā)生作用。香蕉用量為150200g/L。主要在蘭花的組織培育中應用，對原球莖增殖有明顯促使收效，并有利于壯苗與生根。馬鈴薯去掉皮和芽后，加水煮30min，經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150200gL。增加后可獲取強壯的植株。4.植物生長調治物質植物生長調治物質是培育基的重點性物質，對植物組織培育起著決定性作用，控制著培育物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。（1）生長素類：作用：在組織培育中，生長素主要被用于引誘愈傷組織形成，引誘根的分化和促使細胞分裂、伸長生長。種類及活性：常用種類有IAA(吲哚乙酸)、NAA(

37、萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的強弱序次為：2，4-DNAAIBAIAA。牢固性：IAA是天然存在的生長素，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解，故要避光儲藏，過濾滅菌。其他3種生長素為人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞。特別是NAA牢固性好，活性較高，價格廉價，因此應用最寬泛。溶解性：生長素不溶于水，IAA、NAA、IBA配制時可先用少許95酒精助溶。2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶。（2）細胞分裂素類：作用：引誘芽的分化促使側芽萌生生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內細胞分裂素生長素的比值高時

38、，引誘愈傷組織或器官分化出不定芽。促使細胞分裂與擴大?？刂聘姆只?。因此，細胞分裂素多用于引誘不定芽的分化、莖、苗的增殖，而防范在生根培育時使用。種類及活性：這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐氨基嘌呤)、Kt(激動素)、Zt(玉米素)等。作用能力的強弱序次是：ZT6-BAKT，常用的是人工合成的、性能牢固的、價格適中的6-BA。溶解性：細胞分裂素不溶于水，也不溶于酒精，一般可溶于0.1mol/L的鹽酸或NaOH溶液中。（3）赤霉素(GA)：有20多種，培育基中增加的是GA3，主要用于促使幼苗莖的伸長生長，促使不定胚發(fā)育成小植株；其他，赤霉素還用于打破休眠，促使種子、塊莖、鱗莖等提前

39、萌生。一般在器官形成后，增加赤霉素可促使器官或胚狀體的生長。赤霉素溶于酒精，配制時可用少許95酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70-100無效，應當過濾滅菌。生長調治物質的使用量甚微，一般用mgL表示濃度。在組織培育中生長調節(jié)物質的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內源激素等的不一樣而異，一般生長素濃度的使用為0.055mgL，細胞分裂素0.0510mgL。5.培育基的其他成分瓊脂：在固體培育時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，自己其實不供給任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在90以上熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在610gL之間。一般瓊脂以顏

40、色淺、透明度好、干凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式相關外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH等因素相關，長時間的高溫會使凝固能力降落，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。加入瓊脂的固體培育基與液體培育基對照，優(yōu)點在于操作簡略，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，缺點是培育物的吸取面積?。桓鞣N養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；培育物排出的一些代謝廢物，齊聚在吸取表面，對組織產(chǎn)生傷害作用。(2)抗生物質：抗生物質有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mgL之間。增加抗生物質可防范菌類污染，減少培育中資料的損失。抗生

41、素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但應當注意抗生素對植物組織的生長也有控制作用。3）抗氧化物：培育基中增加抗氧化物是為了控制外植體和培育物褐變。常用的抗氧化劑有半胱氨酸、維生素C、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。4）活性炭：活性炭有很強的吸附作用，它能夠吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培育物分泌的酚類、醌類物質及激素等。通常使用濃度為0.110gL。培育基中增加活性炭的作用：防范褐化；促使生根；降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率；活性炭在胚胎培育中也有必然作用。但是，活性炭擁有副作用：吸附培育基中的生長調治物質；削弱瓊脂的凝固能力，增加時須注意。作業(yè)培育基的作用

42、是什么？培育基一般包括哪些基本成分？培育基中增加的植物生長調控物質有哪些？各有什么作用？第三節(jié)植物組織培育操作技術（3）一、授課章節(jié)第三節(jié)植物組織培育操作技術（3）。二、學時安排學時。三、授課目的1掌握培育基母液的配制技術。2掌握培育基的配制、分裝包扎技術。3掌握培育基高壓滅菌技術。4掌握無菌操作技術。四、授課重點、難點分析重點：1培育基母液配制。2培育基的制備技術。3培育基的高壓蒸汽滅菌。4無菌操作技術。難點：1培育基母液、培育基配制的計算。2無菌操作技術步驟的分析。五、教具電化授課設備、試管苗、接種工具、培育基。六、授課方法解說法，模擬實驗法。七、授課過程.導入提問：培育基的作用。復習：培

43、育基的基本成分。新課（四）培育基的配制培育基母液的配制：所謂母液是欲配制培育液的濃縮液，也稱貯備液。母液配制的目的一是方便迅速配制培育基，二是保證各物質成分的正確性及配制時的迅速移取。（1）母液配制方法單配法：將培育基配方中的各種成分分別配成必然濃度的母液。一般mg/mL表示。混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大必然倍數(shù)稱量，分別溶解后各種混雜在一起定容到必然體積配成混雜母液。（2）母液配制流程確定培育基確定母液種計算稱量溶解記錄冰箱保貼標分裝混雜定（3）母液配制要求母液濃縮倍數(shù)：大批元素1020倍；微量元素100200倍；鐵鹽100倍；有機物100200倍。采用蒸餾水，分析純或化學純試劑

44、，防范積淀。激素母液濃度：0.51mg/mL，1次配成50mL或100mL（4）藥品用量的計算：配制母液時藥品用量(mg)=配方用量制備容量（L）（5）母液配制技術以MS培育基為例，配制過程以下：(mg)濃縮倍數(shù)表1MS培育基母液配制（單位：mg/L）配1L培育擴大倍稱取母液體積母液種類成分規(guī)定量基吸取量數(shù)量(mL)(mL)KNO3190019000大NH4N03165016500量MgSO7H0370103700100010042元KHP0170170024素CaCl22H2O4404400MnS044H2022.32230ZnS047H208.6860微HB06.262033量KI0.83

45、10083l00010元Na2Mo042H200.2525素CuS05H00.0252.542CoCl26H200.0252.5鐵Na2EDTA37.31003730100010鹽FeS044H2027.82780甘氨酸2.0200有鹽酸硫胺素0.110機鹽酸吡哆醇0.510050100010物煙酸0.550肌醇10010000大批元素母液配成濃縮10倍的母液。用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別加入100mL左右蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌促使溶解，爾后倒入1000mL容量瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。注意2+23Ca和SO4、PO4易發(fā)生積淀，因此CaCl22H2O充

46、分溶解后最后加入。微量元素母液配成濃縮100倍的母液。用感量0.0001g分析天平按表2-4正確稱取藥品后，分別溶解，混雜后加水定容至1000mL。鐵鹽母液配成濃縮100倍的母液，用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別溶解，混雜后加水定容至1000mL。有機物母液配成濃縮100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-4分別稱取藥品，溶解，混雜后加水定容至1000mL。每種激素必定單獨配成母液，濃度一般配成0.51mgmL，用時依照需要取用。多數(shù)激素難溶于水，要先溶于特定溶劑，爾后才能加水定容。詳盡方法為：IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少許95的酒精中，再加水定容到必然體積；

47、2，4-D可用少許0.1mol/L的NaOH溶解后，再加水定容到必然體積；Kt和BA先溶于少許0.1mol/L的HCl中再加水定容。（6）母液的保存將配制好的母液分別倒入試劑瓶中，貼好標簽，在標簽上注明母液名稱，配制倍數(shù)與日期。爾后放入冰箱內4低溫保存，用時再按比率稀釋。2.培育基的配制（1）培育基配制工藝流程玻璃器皿洗計算母液用移取母確定培育干燥稱取瓊脂、蔗培育基熬定容調治pH分裝高壓滅表記、記封口（2）培育基制備的操作步驟確定培育基配方及用量：依照培育對象、培育目的等，經(jīng)過查閱資料及咨詢等確定培育基配方，爾后據(jù)外植體的數(shù)量和試驗辦理的多少確定培育基的用量。稱取瓊脂、蔗糖：用托盤天均分別稱取

48、0.6%1%的瓊脂、2%3%的蔗糖。培育基熬制：量取純凈水放入加熱容器，純凈水的體積應少于所配制培育基體積，約占終體積的2/33/4，加入稱量好的瓊脂和糖，接通電源加熱。邊加熱邊攪拌，防范糊底和溢出，至完滿溶化。母液取用量的計算：基本培育基配方成分母液取用量（mL）=1000濃縮倍數(shù)制備培育基的體積（L）；生長調治物質母液取用量（mL）=配方中的濃度（mg/L)母液濃度（mg/mL)制備培育基體積（L）移取母液：依照計算出的母液用量，按大批元素、微量元素、鐵鹽、有機成分、植物激素的序次將母液拿出，混雜。定容：將母液混雜液加入到瓊脂完滿溶化的培育基中，攪拌混勻，并加水定容到所需體積。調治pH：用

49、酸度計或精美pH試紙測試培育基溶液的pH(5.56.8)，偏堿滴加0.1mol/L的HCl調整，偏酸滴加0.1mol/L的NaOH調整，直到達到配方要求值。分裝：用乳膠管把配制好的培育基趁熱分裝到培育瓶中，100150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入3035mL左右的培育基，分裝時數(shù)量要平均、合適，培育基不沾附瓶口和瓶壁。封口：用合適的封口資料和線繩包扎。表記與記錄：封裝好的培育基做好標記放到高壓滅菌鍋中準備滅菌。3.培育基的高壓滅菌加水：滅菌鍋加水至淹沒電熱絲（或高低水位線之間）。裝鍋：將培育瓶及培育器械放入高壓滅菌鍋。密封：封閉高壓滅菌鍋各出氣口。加壓：接通電源加壓至0.05MPa。排氣：斷開電源，打

50、開排氣閥，排冷氣至壓力為0MPa。穩(wěn)壓：接通電源，連續(xù)加壓至0.1MPa開始計時，保壓在0.10.15Mpa保持2030min，此時溫度在121125。降壓：穩(wěn)壓時間到，封閉電源自然冷卻至壓力為0MPa。出鍋：開鍋后拿出培育基冷卻，儲藏于37培育箱中培育，經(jīng)24h無雜菌生長，可保存?zhèn)溆?。培育基配制、分裝和滅菌時注意的問題1）培育基熬制時邊煮邊攪拌，防范糊底。用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂所有融化。2）配制培育基必然按母液序次依次加入。3）熬制培育基過程中，先放入難溶解的瓊脂及有機附加物（馬鈴薯、香蕉等），最后加入藥劑混雜液，因混雜液中的有機物遇熱時間長易分解無效。（4）多數(shù)植物合適的pH在

51、5.66.5，而培育基經(jīng)高壓滅菌pH一般會降低0.20.3個單位，故調治pH時應比選定pH提高0.20.3個單位。（5）分裝培育基時，注意不能夠將培育基溶液噴灑到瓶壁口處，簡單落菌污染。（6）滅菌過程中須完滿消除鍋內冷水汽，使鍋內所有是熱水蒸汽，滅菌才能完整。7）培育基滅菌嚴格按要求時間進行，如高出時間，培育基成發(fā)散生變化易無效。8）培育基滅菌后，馬上拿出擺平冷卻。拿出過晚凝固差，影響接種轉苗質量。四、無菌操作（接種）技術接種是指把無菌的植物質料切割，經(jīng)無菌操作手序，放到培育基上的所有操作過程。它是組織培育過程中易于污染的一個環(huán)節(jié)，接種操作必定在無菌條件下進行。在接種前30min打開無菌操作間

52、和超凈工作臺的紫外燈進行環(huán)境滅菌。照射20min后封閉紫外燈，打開風機使超凈工作臺處于工作狀態(tài)。接種人員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等。接種人員上工作臺后，用70%75%酒精擦拭雙手，爾后擦拭工作臺面。用70%75%酒精擦拭接種工具并屢次灼燒。進行外植體表面滅菌與接種：將外植體35個為一組放入70%75%的酒精溶液浸潤1060S拿出后再放入2%的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無菌水屢次沖洗35次（1min/次）放入無菌吸水紙上吸干水分，進行合適切割打開已準備好的培育基瓶蓋或封口膜，在酒精燈無菌圈內接入外植體封口。這樣屢次操作，直到所有外植體接種達成。注意工具用后及時滅菌，防

53、范交織污染。接種達成，清理干凈工作臺。表記接種資料并放入培育間培育。作業(yè)欲配制500毫升MS培育基大批元素母液，需硝酸鉀多少克？怎樣制備MS培育基？怎樣進行無菌操作？第四節(jié)植物組織培育迅速生殖技術一、授課章節(jié)第四節(jié)植物組織培育迅速生殖技術。二、學時安排學時。三、授課目的1掌握植物組培快繁的流程。2掌握植物組培快繁的程序。四、授課重點、難點分析重點：植物組培快繁的程序。難點：初代培育中引誘外植體生長與分化路子。五、教具電化授課設備,各培育階段的試管苗。六、授課方法解說法，演示法。七、授課過程.導入本次課主要介紹的是植物組織培育迅速生殖技術。新課一、植物組培快繁的流程母體資料外植體的選擇外植體的辦

54、理外植體的表面消毒外植體的接種初代培育繼代培育（多次循環(huán)）壯苗與生根培育試管苗馴化與移栽二、植物組培快繁的程序（一）外植體的選擇1.外植體選擇的原則選擇優(yōu)秀的種質外植體必然要選擇擁有該品種典型特色、遺傳性牢固、生長強壯、無病蟲害的優(yōu)秀植株。選擇生理狀態(tài)優(yōu)秀的資料盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)優(yōu)秀的資料。選擇生長旺盛、再生能力強的資料在生長季節(jié)選擇年幼的資料，這樣的資料生長旺盛、再生力強，接種成功率高。選擇本源豐富的資料為了成立一個高效而牢固的組培快繁系統(tǒng)，需屢次試驗，因此必然要采用本源豐富的資料。選擇合適的外植體大小合適的外植體大?。呵o尖分生組織0.20.5mm，莖段長帶12個節(jié)，葉片0.5cm0.

55、5cm。2.外植體的選擇就無菌短枝扦插、叢生芽培育來說，木本植物、能形成莖段的草本植物以采取莖尖和莖段比較合適；有些草本植物植株短小或沒有顯著的莖，可用葉片、葉柄、花萼、花瓣作外植體。（二）外植體的辦理將采來的植物質料除掉不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，洗時可加入洗衣粉沖洗，爾后再用自來水沖凈洗衣粉水。沖洗結束后，進入無菌操作室進行消毒接種。（三）外植體的表面滅菌依照無菌操作技術中介紹的方法，打開電源使超凈工作臺處于工作狀態(tài)，將接種工具、消毒的玻璃器皿、無菌水、配制好的滅菌劑等放入超凈工作臺，接種員做好準備進入無菌操作室，點燃酒精燈，對接種工具進行灼燒滅菌。外植體每35個為一組放入7075

56、的酒精中浸泡1060S拿出后放入2的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無菌水屢次沖洗35次用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到合適大小，準備接種。（四）外植體的接種先打開已準備好的培育基瓶蓋或封口膜，將三角瓶傾斜拿在手中，使瓶口湊近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉動灼燒數(shù)秒鐘。爾后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入瓶內，輕輕插在培育基上。將葉片反面接觸培育基，莖尖、莖段要按其生長極性的上下端，正放在培育基上。外植體接種以每瓶放一枚組塊為宜。接完種后，將瓶口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋或封口膜。爾后再接下一瓶，直到所有接種達成。最后做好記錄，注明辦理資料的物種名稱、辦理方法、接種日期等。（五）培育1

57、.培育條件（1）溫度溫度是植物組織培育中的重要因素，大多數(shù)植物組織培育都在2327之間進行，一般采用25土2。（2）光照主要表現(xiàn)在光強和光照時間方面。組織培育中多采用20003000Lx的光強，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。3）濕度影響組織培育的濕度包括以下兩個方面：培育容器內的濕度和培養(yǎng)室內環(huán)境的濕度。一般要求培育室內要保持7080的相對濕度。（4）培育基的pH不一樣的植物對培育基最適pH的要求是不一樣的。大多數(shù)植物合適的pH在5.66.5之間，一般培育基皆要求5.8。（5）浸透壓培育基中由于有無機鹽類、蔗糖等化合物，因此，會影響浸透壓的變化。平時12個大氣壓對植物生長有促使作用，

58、2個大氣壓以上對植物生長有阻攔作用。6）氣體氧氣是組織培育中必要的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口資料。接種時應防范把外植體所有埋入培育基中，省得造成缺氧。2.培育程序初代培育初代培育旨在獲取無菌資料和無性生殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培育。初代培育成立的無性生殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。1）頂芽和腋芽的發(fā)育頂芽和腋芽在離體培育中都可被引誘而生長發(fā)育。從芽萌生變成幼枝，幼枝連續(xù)生長，形成新的頂芽和側芽。再將新形成的芽切割下來連續(xù)培育，屢次萌生新的枝條，在很短的時間內重復芽枝苗的再生過程，就能生產(chǎn)出好多再生小植株。2）不定芽的發(fā)育由外植體產(chǎn)生不定芽，平時第

59、一要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后經(jīng)再分化形成器官原基。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。即外植體產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)生不定芽產(chǎn)生植株。3）體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細胞胚狀體近似于合子胚但又有所不一樣，它也經(jīng)過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最后發(fā)育成小苗，但它是由體細胞發(fā)生的。經(jīng)過體細胞胚狀體產(chǎn)生植株有三個顯著的優(yōu)點：由一個培育物所產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量經(jīng)常比不定芽的數(shù)量多；胚狀體形成快；胚狀體構造完滿，一旦形成都可能直接萌生形成小植株。當前已知有100多種植物能產(chǎn)生胚狀體，但有的發(fā)生和發(fā)育較為困難。4）原球莖的發(fā)育蘭科植物的組培過程中，由莖尖或側芽產(chǎn)生原球莖，原球莖不斷增殖，逐漸分化

60、成為小植株。原球莖最初是蘭花種子萌芽過程中的一種形態(tài)構造。原球莖能夠理解為縮短呈珠粒狀嫩莖器官。在頂芽和側芽的培育中產(chǎn)生的都是這樣的原球莖。從一個芽的周圍能產(chǎn)生幾個到幾十個原球莖，培育一準時間后，原球莖逐漸轉綠，接踵長出毛狀假根，經(jīng)過進一步培育，使其再生、分化，形成完滿的植株。擴大生殖時將原球莖切割成小塊，轉接到增殖培育基上，增殖出幾倍、幾十倍、幾百倍的原球莖。繼代培育繼代培育是在初代培育此后的連續(xù)數(shù)代的增殖培育過程。繼代培育使用的培育基對于一種植物來說每次幾乎完滿同樣，由于培育物在湊近最優(yōu)秀的環(huán)境條件，營養(yǎng)供給和激素調控下，消除了其他生物的競爭，因此能夠按幾何級數(shù)增殖。一般情況，在46周內增