復(fù)明片對兔視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響

1、復(fù)明片對兔視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響【摘要】目的研究復(fù)明片對兔實驗性視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinalpigentepitheliu,RPE)增殖的影響。方法用有色家兔96只設(shè)正常對照組A組，制作視網(wǎng)膜脫離模型后分模型組B組、西藥對照組組、復(fù)明片組D組。并于造模后7、14、21d分別取視網(wǎng)膜組織制備細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測各兔增殖細(xì)胞核抗原(PNA)在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的表達(dá)。結(jié)果脫離后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層PNA陽性細(xì)胞表達(dá)均呈上升趨勢，7d后開場下降，且復(fù)明片組相較其余各組比擬均有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。結(jié)論復(fù)明片通過恢復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮與神經(jīng)上皮之間的接觸，阻止RPE的增殖

2、即PNA的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)明片；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；增殖細(xì)胞核抗原；流式細(xì)胞儀；兔；黃芪；生地；茯苓TstudytheeffetfFuingtabletnprliferatinfretinalpigentepitheliu(RPE)inrabbitseyesithretinaldetahent(RD).ethd96healthyadultluredrabbitsererandlydividedintfurgrups:blankgrup(grupA),delparativegrup(grupB),esternediinetreatinggrup(grup)andFuingtablettreat

3、inggrup(grupD).Theellsuspensinserepreparedithretinaltissuesgainedat7th,14thand21thdayafterdeling,andtheexpressinfprliferatingellnulearantigen(PNA)inretinalneursensrylayerasexainedbyflytetry(F).ResultTheexpressinfPNAinreasedinthefurgrupsafterdetahent,hileitbegantdereaseafter7thday,andtheexpressiningr

4、upDassignifiantthanthatinthergrups(P0.05).nlusinFuingTabletaninhibittheexpressinfPNAbythentatfbthretinalneursensrylayerandretinalpigentepitheliulayerasreveredbysasprevented.Fuingtablet;retinalpigentepitheliu;prliferatingellnulearantigen;flytetry;rabbits;Radixastragali;Rhizefrehannia;Prias視網(wǎng)膜脫離(retin

5、aldetahent,RD)是指視網(wǎng)膜色素上皮與神經(jīng)上皮之間的別離，是嚴(yán)重的致盲眼病，可導(dǎo)致眼球萎縮。在眾多致盲因素中占第5位，14歲以下兒童占第4位1。視網(wǎng)膜脫離手術(shù)后的解剖復(fù)位率達(dá)95以上，但術(shù)后視功能恢復(fù)仍不理想。目前，尚缺乏能應(yīng)用于臨床的有針對性的藥物。尋求能改善視網(wǎng)膜脫離手術(shù)后增進(jìn)患者視功能的輔助治療，是臨床上亟待解決的問題。1材料與方法1.1材料1.1.1動物成年安康有色家兔96只，體質(zhì)量2.02.5kg，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。動物合格證號：醫(yī)動字第20-003號。1.1.2藥品復(fù)明片：由黃芪、生地、茯苓、車前子、地龍、赤芍、紅花、白術(shù)等中草藥按現(xiàn)代制劑制備工

6、藝制成，0.3g/片，選用同一批號藥物，批號：040208。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。使用時去掉糖衣，研成粉末，溫開水混合，配制成濃度為10%的混懸液；三磷酸腺苷二鈉片(AdensineDisdiuTriphsphateTablets,ATP)：20g/片，福建古田藥業(yè)消費，批號：050827-1；維生素B1(VitainB1，VitB1)：10g/片，湖北華中藥業(yè)消費，批號：20220801；維腦路通：60g/片，山西晉新藥業(yè)集團(tuán)消費，批號：050811，使用時研成粉末，溫開水混合，配制成每升水含VitB11276g、ATP1102g、維腦路通734g的溶液；透明質(zhì)酸酶：上海第

7、一生化藥研所消費，批號：20220901。1.1.3儀器PTN多功能顯微鏡德國PTN公司消費；lypus光學(xué)顯微鏡日本LYPUS公司消費；雙目間接眼底鏡美國elhAllyn公司消費；Tpn眼科手術(shù)顯微鏡日本TPN公司消費；眼底接觸鏡蘇州醫(yī)療器械消費；eppend-rf5804R/5810R型高速冷凍離心機(jī)德國SIGA公司消費；Bekanulter流式細(xì)胞儀美國貝克曼庫爾特公司消費。1.1.4試劑PNA測試盒武漢博士德生物工程消費；DAB顯色試劑盒武漢博士德生物工程消費。1.2方法1.2.1兔眼視網(wǎng)膜脫離模型建立按照文獻(xiàn)2等提出的方法，并加以改良。術(shù)前3d用0.25氯霉素眼藥水和1阿托品眼藥水交

8、替滴眼，3次/d。手術(shù)當(dāng)日生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，術(shù)前滴1丁卡因眼藥水23次。造模時術(shù)眼均取右眼采用10%新福林和1%阿托品散瞳。3%戊巴比妥耳緣靜脈注射(1L/kg)麻醉后，將兔固定于手術(shù)臺上，慶大霉素加生理鹽水混合液沖洗結(jié)膜囊，常規(guī)消毒鋪巾、開瞼。點丁卡因外表麻醉，方筋膜下注入2利多卡因0.2L形成泡狀隆起，沿角膜緣環(huán)行剪開鼻側(cè)球結(jié)膜和筋膜，向后稍別離，暴露赤道部鞏膜，距角鞏緣后5睫狀體平坦部用25GB-D針頭垂直眼球壁刺穿鞏膜，在眼底接觸鏡和顯微鏡直視下觀察到伸入玻璃體內(nèi)的針尖，將10IU/L透明質(zhì)酸酶溶液0.1L緩慢注入到玻璃體的中央偏后部，拔針后壓迫注射點3in。15in后再由原穿刺口將

9、自制視網(wǎng)膜下腔注射針頭緩慢探進(jìn)，反復(fù)抽吸0.1L液化的玻璃體，在眼底接觸鏡和顯微鏡直視觀察下小心地把針尖引向后極部，避開視網(wǎng)膜血管，在顳側(cè)距視乳頭1個視盤直徑(PapillaDis,PD)放射狀視網(wǎng)膜處刺穿視網(wǎng)膜，進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔，助手緩慢推動注射器，注入液化的玻璃體液0.1L，可見視網(wǎng)膜被別離，脫離的視網(wǎng)膜呈大片灰白色隆起，范圍約1/2個PD大小，退出針頭，角膜緣處放出房水以降低眼內(nèi)壓。術(shù)后鋪平球結(jié)膜，結(jié)膜囊涂0.5%四環(huán)素眼膏，結(jié)膜下注射慶大霉素加地塞米松0.1L，肌肉注射慶大霉素0.8萬u，以防感染，術(shù)后1周每天用氯霉素眼藥水點眼4次，并一直給1%阿托品眼液散瞳。1.2.2給藥方法造模后第

10、1天下午開場給藥，A組正常對照組與B組模型對照組均予溫開水灌胃，5L/kg，每日1次；組西藥對照組予西藥混合溶液灌胃，5L/kg，每日1次；D組復(fù)明片治療組予復(fù)明片混懸液灌胃，5L/kg，每日1次。1.2.3標(biāo)本制備、細(xì)胞懸液制備方法及流式細(xì)胞檢測于造模后7、14、21d，各兔用3%戊巴比妥耳緣靜脈注射(1L/kg)麻醉，摘除眼球，生理鹽水沖洗干凈。在冰生理鹽水中，沿角鞏緣剪開眼球達(dá)360度，棄角膜、晶體、玻璃體，保存視網(wǎng)膜連同脈絡(luò)膜鞏膜組織，取出視網(wǎng)膜于定量濾紙上加少許0.01PBS(pH7.27.6)液，用顯微剪均勻剪碎，制備細(xì)胞懸液，75%乙醇固定，4冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ正R樣本后取細(xì)胞懸液1

11、000r/in離心7in，棄上清后參加75%乙醇混勻固定。測試當(dāng)日加含10%的胎牛血清1L室溫下放置20in后0.01磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗2次，每次3in，1000r/in離心7in，棄上清。陽性組參加PNA150配比50L每管，陰性對照組加PBS液50L每管，4過夜。0.01PBS洗3次，每次5in，1000r/in離心7in，棄上清。1200異硫氰酸熒光素(FluresEinIsthiyanate，F(xiàn)IT)標(biāo)記二抗，室溫孵育2h，0.01PBS洗3次，每次5in，1000r/in離心7in，棄上清。參加0.01PBS800L，應(yīng)用FASalibur型BetnDikinsn公司流式細(xì)胞

12、儀檢測PNA陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。每次檢測都設(shè)有空白對照及正常對照，每時間點檢測35次，取平均值。1.3統(tǒng)計方法用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)處理，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差()表示。2結(jié)果脫離后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層PNA陽性細(xì)胞表達(dá)均呈上升趨勢，7d后開場下降。7d時模型組、西藥對照組、復(fù)明片組、正常對照組各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；14d時除復(fù)明片組與西藥對照組其余各組比擬差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；21d時除復(fù)明片組與正常對照組及復(fù)明片組與模型組外，其余各組比擬差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。3討論3.1中醫(yī)對視網(wǎng)膜脫離的認(rèn)識及治療在祖國醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中無“視網(wǎng)膜脫離病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于“暴盲、“神光

13、自現(xiàn)等范疇，為“外不見證，從內(nèi)而蔽的內(nèi)障眼玻中醫(yī)文獻(xiàn)上的某些記載，與本病頗為相似，如?證治準(zhǔn)繩七竅門?中：“謂目外自神光出現(xiàn)，每如電光閃掣，甚那么如火焰霞明，時發(fā)時止，乃神光欲散，內(nèi)障之重者；?抄本眼科?“落氣眼一癥：“突然眼目黑暗，不能視見，白日如夜，此癥乃元氣下陷，陰氣上升；?目經(jīng)大成?也有“電光夜照病癥的記載。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,視衣(視網(wǎng)膜)為瞳神深部組織,RD屬內(nèi)障眼病,屬于瞳神疾病范疇；瞳神稱水輪,在臟屬腎,視網(wǎng)膜是大腦的延伸部分,腎生髓于腦,故視網(wǎng)膜的病變與腎親密相關(guān)。肝膽互為表里,肝腎同源,腎藏精而肝藏血,目得精血之養(yǎng)才能視覺靈敏,故肝腎缺乏,精血虧虛,常為視網(wǎng)膜病的重要病因病機(jī);

14、又肝主疏泄,肝郁那么氣滯,氣滯那么血瘀,視網(wǎng)膜病變亦常與此有關(guān);脾為后天之本,氣血生化之源,主運化水濕,脾虛氣血缺乏,目失所養(yǎng)或水濕上泛是視網(wǎng)膜發(fā)生變性、水腫、滲出或增殖的重要病機(jī)。故視網(wǎng)膜、玻璃體的病變與肝、膽、腎、脾等臟腑功能親密相關(guān)3。視網(wǎng)膜脫離產(chǎn)生之原因，多為患者氣虛不固致視網(wǎng)膜不能緊貼球壁而脫落；而視網(wǎng)膜脫離手術(shù)是一種人為的眼外傷，術(shù)后多有瘀血病理存在，有時術(shù)中還可致視網(wǎng)膜出血；本病術(shù)中無論放水與不放水，其術(shù)后多有網(wǎng)膜下積液存留；而術(shù)中不可防止之出血又可使眼部陰血虧虛。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.中醫(yī)眼科歷來重視圍手術(shù)期的藥物治療，尤注重手術(shù)后用藥。在RD的治療上，目前一般主張中西結(jié)合，在

15、RD圍手術(shù)期應(yīng)用中醫(yī)中藥，如術(shù)前應(yīng)用補肺生津兼以利水方，術(shù)后應(yīng)用滋養(yǎng)肝腎、益氣養(yǎng)陰兼以活血化瘀方3；或服用具有調(diào)理補益、活血化瘀滲濕功用的中藥；或配合散結(jié)通絡(luò)，活血明目中藥RD2號方口服；或采用和營清熱、溫陽利水法中藥治療；或應(yīng)用中藥RD1號方(利水方劑)結(jié)合皮質(zhì)內(nèi)固醇治療，或針刺療法改善實驗性RD視網(wǎng)膜組織中PK的活性、及進(jìn)步兔眼環(huán)扎術(shù)后房水氧含量，均可以促進(jìn)術(shù)眼的恢復(fù)，防治手術(shù)并發(fā)癥4。3.2活血利水之復(fù)明片對RPE細(xì)胞PNA表達(dá)的影響近年研究結(jié)果提示，網(wǎng)脫后視細(xì)胞外節(jié)變性、視細(xì)胞凋亡及不完全再生是術(shù)后視力恢復(fù)不良的主要原因。視網(wǎng)膜色素上皮與神經(jīng)上皮之間的別離,導(dǎo)致RPE細(xì)胞的直接暴露，R

16、PE細(xì)胞在各種細(xì)胞因子、生長因子等的作用下開場增殖，同時ller細(xì)胞亦啟動增殖，RPE細(xì)胞及l(fā)ler細(xì)胞的增生、肥大不僅填充了視網(wǎng)膜中死亡的光感受器細(xì)胞留下的空缺，ller在視網(wǎng)膜內(nèi)層中的數(shù)目和大小也增加，這些細(xì)胞有在視網(wǎng)膜下空間生長并形成宏大瘢痕的傾向性，從而完全阻礙了外節(jié)的再生5，阻礙視功能的恢復(fù)，并促進(jìn)PVR的形成。趙明威等6研究發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞對FN的吞噬受細(xì)胞內(nèi)PK、TK和PI32K信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，增殖的RPE細(xì)胞吞噬功能下降，影響其對感光細(xì)胞的代謝作用，也即影響視功能的恢復(fù)。那么是一種細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程中的必要蛋白,它最早表達(dá)在G1期,峰值在S期,以后在G2期和期呈弱表

17、達(dá)7。Griersn等8認(rèn)為在正常RPE細(xì)胞層，大多數(shù)細(xì)胞間彼此嚴(yán)密接觸具有協(xié)同作用,處于“接觸抑制狀態(tài)。當(dāng)部分產(chǎn)生損傷時,與損傷區(qū)毗鄰的細(xì)胞互相孤立,細(xì)胞間的協(xié)同作用喪失,并且與來自周圍損傷組織的信號發(fā)生反響。細(xì)胞運動和增殖的接觸抑制被打破,以致于最終進(jìn)入細(xì)胞周期開場增殖。當(dāng)視網(wǎng)膜復(fù)位后，RPE細(xì)胞恢復(fù)原有的協(xié)同作用，重建細(xì)胞間的平衡，接觸抑制恢復(fù)，RPE細(xì)胞的增殖逐漸停頓。另有研究認(rèn)為各種生長因子及其受體、細(xì)胞外基質(zhì)E及其整合素受體和基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物等互相作用維持細(xì)胞生長的平衡調(diào)控的9。在正常情況下,某些特殊的E對RPE細(xì)胞的增殖存在負(fù)調(diào)控作用10，從而抑制了RPE細(xì)胞增殖。本實驗

18、結(jié)果顯示,空白組PNA表達(dá)很低,模型組PNA表達(dá)明顯增高,其余各組眼內(nèi)的含量也明顯高于空白組,而活血利水治療組PNA表達(dá)明顯較模型組低,亦低于西藥對照組,說明活血利水法治療(用復(fù)明片)在抑制PVR開展過程中起作用。復(fù)明片以益氣養(yǎng)陰、活血利水為原那么，用補陽還五湯為主益氣活血，加茯苓、車前子、澤瀉益氣利水消腫；生地、女貞子、旱蓮草補養(yǎng)陰血。前期臨床研究顯示用于治療網(wǎng)脫術(shù)后視力減退患者，對進(jìn)步視力有較好的效果(有效率為95.45%)，且經(jīng)追蹤觀察，其療效穩(wěn)固11。方中選用黃芪大補脾胃之元氣，令氣旺血行，瘀去絡(luò)通；地龍、赤芍、紅花活血祛瘀通絡(luò)；白術(shù)健脾益氣、利水；車前子、茯苓配伍生地使其利水而不傷陰

19、。本方補氣藥與活血藥相配，使氣旺那么血行，共奏益氣活血利水而不傷正之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究說明兩類藥合用具有抗炎、促進(jìn)免疫功能、延緩衰老、減少自由基的生成并促進(jìn)其去除，及抑制血小板鈣調(diào)蛋白而使磷酸二酯酶的活性下降，使血小板內(nèi)AP含量增加而明顯抑制血小板的聚集，擴(kuò)張血管，抗血凝，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜血液循環(huán)，改善能量代謝，增強組織的抗氧化才能，減輕自由基對組織的損傷，還具有和醛固酮及其拮抗劑相似的構(gòu)造而具有利尿、抗癌等作用。合方利水藥促進(jìn)視網(wǎng)膜下液吸收，益氣、活血、養(yǎng)陰可恢復(fù)正氣均可使視網(wǎng)膜色素上皮與神經(jīng)上皮之間恢復(fù)接觸，從而阻止RPE的增殖即PNA的表達(dá)。【參考文獻(xiàn)】1孫為榮.眼科病理學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:357.2彭清華,朱志容,陳吉,等.視網(wǎng)膜脫離復(fù)位動物模型的建立J.中國中醫(yī)眼科雜志,2022，15(2):77-80.3高翔,吳紅斌.中藥在孔源性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)前后的應(yīng)用J.中國中醫(yī)眼科雜志,2022,11(4):225-226.4范金凱.中藥結(jié)合皮質(zhì)類固醇治療凝固術(shù)后滲出性視網(wǎng)膜脫離臨床觀察J.中國中醫(yī)眼科雜志,1997,11(4):229-230.5孫曉東,張皙,俞彰,等.實驗性視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后的視網(wǎng)膜細(xì)胞超微構(gòu)造觀察J.眼科研究,2001，8(4):326-329.6趙明威,何世坤,黎曉新